千金苇茎汤调控人肺小细胞癌H446中caspase-3、cox-2抗凋亡的研究

南京中医药大学学报 2010年 7月第 26卷第 4期 JOURNALOFNANJINGTCM UNIVERSITYVo1．26No．4 July．2010 千金苇茎汤调控人肺小细胞癌 H446中 caspase一3、 COX一2抗凋亡的研究 蒋凤 荣 ，蒋El磊，张旭 (南京中医药大学基础医学院，江苏南京 21OO46) 摘要：目的 研究千金苇茎汤对人肺小细胞癌 H446凋亡的影响。方法 将千金苇茎汤通过化学分离法制得水提部位； 分为不同药物浓度，与 H446共同培养，流式细胞仪细胞周期检测以及荧光显微镜检测凋亡结果；免疫组织化学检测 caspase一3、cox-2蛋 白的变化 ；rea1 time PCR检 测 caspase一3 mRNA、cox-2 mRNA的达 量。结果 不 同浓度 的千金苇 茎汤水提部位与 H446培养后，细胞凋亡率明显升高以及 PCNA、caspase一3 RNA水平和蛋白明显的改变(P％0．05)，并 有一定的浓度依赖性。结论 千金苇茎汤水提部位可以有效促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞转移。 关键词 ：千金苇 茎汤 ；肺 小细胞癌 H446；easpase一3；cox-2；凋亡 中图号：R285．5 文献标志码：A 文章编号：1000—5005(2010)O4一O278一O2 千金苇茎 汤源 于唐 ·孙思 邈《备 急千金 要 方》，其主要功效为清热化痰、宣肺利气 、益气养 阴。此方常用治疗肺 系疾病 ，主要集中于肺痈患 者 ，对于肺癌治疗研究少有报道_】]。因此 ，我们以 肺小细胞癌 H446为研究对象 ，观察此方对其 COX 一 2分子调控机制研究 。 1 材料与方法 1．1 药物和细胞 千金苇茎汤由薏苡仁、苇茎、桃仁、冬瓜子等 中药组成 ，生药 由南京中医药大学门诊部提供 ，由 方剂重点实验室分离提取水提有效部位。人肺细 胞株(H446)、人脐静脉 内皮细胞株 (HUVEC)购 于中国科学院上海生化与细胞生物学研究所。 1．2 试剂与仪器 DMEM 培养基(GIBCO，USA)(每 L含 10 小牛血清、L一谷氨酰胺 0．33 mg，青霉素 100 U、 链霉素 100 U、pH 7．4)；胰 蛋 白酶 (MERCK， USA)；二甲基亚砜 (DMS0)(Merck，Germany)； 6孔细胞培养板 (Costar，Denmark)；细胞培养箱 (NAPC0，USA)；倒置相差显微镜(0LYMPUS， JAPAN)；无水 乙醇 (纯，上海振兴化学试剂 厂 ，批号 ：20021200365)，流式细胞仪(BD，USA)。 Casepase一3、COX一2(武汉博士德生物工程有限公 司)、碘化丙 啶 (PI)(Sigma，USA)，荧光 显微镜 (OLYPUS，JAPAN)引物由南京生物工程有限公 司合成。 1．3 实验方法 1．3．1 细胞株的体外培养 人肺癌细胞株(H446)和人脐静脉内皮 细胞 株(HUVEC)，用含 1O％小牛血 清的 DMEM 培 养液培养 、传代 。 1．3．2 Hoechst33258荧光染色观察细胞凋亡 细胞数 目为 5×10 个／mL，接种于 6孔板 中，加入千金苇茎汤及 VP测试物，作用 24 h，用 PBS或 Hank’S液洗涤细胞 ，固定液(甲醇 ：冰醋 酸 3：1)4℃固定 5 min，Hoechst33258染 色 10 min，用蒸馏水洗片后经封片剂封片，用带有荧光 素滤光片的荧光显微镜观察细胞 。 1．3．3 PI染色法检测细胞周期 以 0．25 胰酶消化 、收集正常组 、模型组 、正 丁醇 II组作用 24 h后的贴壁细胞 ，以 PBS洗涤 3 遍 ，弃上 清 液，取 100~L至 上样 管 ，加 PI每 管 20 L，闭光反应 30 min，用 PBS洗涤 2次，弃上 清 ，加 PBS 300 uL后 悬 浮细 胞 ，流 式 细 胞 仪 (FACSCa1ibur，USA)测 定细胞 平均 荧光 强 度。 测定后以分析软件 Cell Quest分析。 收稿 日期 ：2010一O2—09；修稿 日期 ：2010一O3—13 基金项目：国家科技部国际合作项目(2006BAI11B08)；江苏省高校 自然科学基金(O7KJB360085) 作者简介：蒋凤荣(1975一)，男，江苏泰州人，南京中医药大学讲师。*通信作者：jfr258@163．COrn 南京中医药大学学报 2010年 7月第 26卷第 4期 JOURNALOFNANJINGTCM UNIVERSITYVo1．26 No．4 July．2010 1．3．4 免疫组化检测 caspase～3、COX一2 SABC免疫组化法 ，以细胞 核染成紫红色者 为阳性细胞 ，在低倍镜 下选取染色最佳视野高倍 镜下计数，共计数 6个高倍视野，计算阳性细胞。 1．3．5 Real—time PCR检测 casepase一3、COX一2 内参 beta—actin、凋亡基 因 casepase一3、COX一2 引物经 Primer 5．0。beta—actin上游引物 ： 5’一GTGGGGCGCCCCAGGCACCA一3’，下 游引 物 ：5’一CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC一 3 ，COX一2上 游 引 物 ：5 一TGAAACCCACTC— CAAACACAG一3 ，下 游 引 物 ：5 一TCATCAG— GCACAGGAGGAAG一3 ；casepase3上游 引 物 ： 5’一ATGGAAGCGAAGCAATGGAGGTG 一3’， 下游引物：5’一CTGTACCAGACCGAGATGTCA 一 3。采用 TRIZoL试剂 盒提取 总 RNA，紫 外线 扫描定量。在微 离心管 内依 次加入灭菌重蒸 水 2O L、反应缓 冲液 4 L、dNTP混合物 1 L、Oli— go(DT)1 L、总 RNAX L、Taq DNA 聚合酶 1 L，反应体系 20 I ，PCR仪制备 cDNA。在八联 中依 次 加 入灭 菌 重蒸 水 9 L、SYBRGreen 15 gL、引物 1 I cDNA 5 L。以 92．5℃预变性 45 S；50℃变性 45 S；72．5℃退火、延生 90 S；在 PCR 仪上进行 40次循环 。扩增过程及荧光信号检查 、 数据的储存和分析由仪器软件 自动完成。 1．3．6 数据分析 运用 SPSS 13．5统计软件，以均数 ±标准差 表示 ，采用单 因素方差分析及 t检验。 2 结 果 2．1 对 H446的细胞凋亡的改变 结果 提 示 经 千 金 苇茎 汤 水 提 部 位 作 用 后 H446的凋亡率增高(P<0．05，P<0．01)(插页 Ⅲ图 1、2)，说 明千金苇茎汤水提部位能促进细胞 凋亡 ，并呈一定的量效关系。 2．2 对 H446细胞的 caspase一3、COX一2影响 caspase一3、COX一2阳性反应 细胞 核出现 明显 的紫红色 ，每例随机观察 100个 以上细胞 ，计算阳 性细胞数 。结果 显示 ，千 金 苇茎 汤水 提部 位对 H446中的 caspase一3、COX一2均 有影 响，以高剂量 最为明显(P<0．01)(插页Ⅲ图 3、4，表 1)。 2．3 对 H446细胞的 caspase～3、COX一2mRNA影 响 Reahime PCR结果显示 ，千金苇茎汤水提部 位对 H446中的 caspase一3、COX一2 mRNA均有一 定的影响，以高剂量最为明显(P<0．01)，提示千 金苇茎 汤能调 控 caspase一3、COX一2 mRNA 的表 达 ，促进 H446细胞的凋亡。 表 1 对 H446caspase一3、cox-2的影响 ( ±S，It=6l 注 ：与对照组 比较 ， P<0．05，一 P<0．0l。 3 讨论 研究表明环氧合酶(cycJooxygenase一2，COX一 2)基因转染 的肿瘤细胞生长旺盛而凋亡受到明显 抑制 ，转染 COX一2基 因的肿瘤 细胞对凋亡 的抵抗 能力、转移能力及促血管内皮细胞迁移能力增强， 而且 EGFR、VEGF、MMP一2等多种与肿瘤生长、 血管生成有关和转移的因子表达都 明显增强l2]。 COX一2可通过催化细胞产生的 PGE。使 核内信号 转导通路 中活化 的 MAPK 蛋 白水平增 加 4～ 5 倍 ，诱导肿瘤抑癌基 因 BCL一2的表 达 ，从而减少 caspase一3的活化，抑制细胞凋亡_3]。 实验结果显示 ，正常肿瘤 细胞 组 中，细胞核 大，无核碎裂 ，反折光不明显 ，流式细胞仪无细胞 凋亡现象，细胞 中 caspase一3、COX一2蛋 白不明显。 加人中药复方千金苇茎汤水提部位进行干预后， 细胞核出现核碎裂 ，反折光明显增强 ；流式细胞仪 出现 细 胞 凋亡 ，细胞 中 COX一2蛋 白表 达 降低 ， caspase一3蛋 白表达升高，提示千金苇茎汤通过某 些受体激活 COX一2，启动有关信号分 子的表达 、入 核、转录有关的凋亡蛋白。具体成分和分子信号 机制有待于进一步深入研究。 参 考文献 ： [1]王丽英．千金苇茎汤治疗肺系疾病[J]．实用中医内科 杂志 ，】998，l2(2)：43—44． [-2]Chen WS，Wei sJ，I iu JM，et a1．Tumor invasiveness and liver metastasis of colon cancer cells correlated with cyclooxygenase一2(COX一2) expression and inhibited by a COX一2selective inhibitor，etodolac[-J]．Int J Cancer， 2001，91(6)：894—899． [3]Sheng H．Modulation of apoptosis and Bcl一2 expres— sion by prostaglandin E2 in human colon cancer cells[J-]． Cancer Res，1998，58(2)：362—366． (编辑：李伟东)