沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外生长的抑制作用

了其可能的机制，现将结果 如下。 材料与方法 1．实验材料：沙利度胺由常州制药厂惠赠。 RPMI1640培养基和新生牛血清购自美国GIBCO． BRL公司。小鼠抗人caspase-3单克隆抗体购于 Santacruz8公司。人血管内皮生长因子(VEGF)．酶 联免疫吸附(ELISA)试剂盒购于晶美生物工程公 司。人肝癌细胞株SMMC-7721购自中国医学科学 院药物研究所药理室。 2．细胞培养：将人肝癌细胞株SMMC-7721从 液氮中复苏后，用含10％新生牛血清的RPMI1640 培养液培养至对数生长期后进行后续实验。 3．四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖 抑制率：取对数生长期的sMMc．772l细胞，调整细 胞浓度为5×104何IIll，于96孔细胞培养板中每孔 加入100山细胞悬液，再加入不同体积的待测样 品，使得药物终浓度分别为3．125、6．25、12．5、25、 50、100和200仙g／ml，每组分别设4个复孔。空白 对照组加入同体积RPMI1640培养液。继续培养 48h后，每孔加入5mg／ml的MrIfI’溶液20斗l，37℃ 继续培养4h后，吸弃培养上清液，每孔加入200m 二甲基亚砜(DMSO)，震荡10min，在酶标仪490nm 波长处测定各孔吸光度(A)值，计算细胞增殖抑制 率。细胞增殖抑制率=(对照组A值一实验组A 值)／对照组A值×100％。 4．DNA琼脂糖电泳：以200仙g／ml的沙利度胺 处理SMMC-7721细胞，按照DNAzol试剂盒操作说 明书进行以下操作，以1．5％琼脂糖凝胶电泳分离 DNA，电泳l～3h，l％溴化乙啶染色，紫外光下观 察，照相。 5．Hoeest33258染色：以200斗s／ml的沙利度 胺处理SMMC-7721细胞，收集1×106何ml，PBS 洗涤2次。以甲醇和乙酸混合物(比例为3：1)固定 细胞10min以上，PBS洗涤2次，加入Hoecst33258 于暗室染色30min，荧光显微镜下观察，照相。 6．碘化丙啶(PI)法定量检测细胞凋亡：收集 200灿g／ml的沙利度胺处理12、24、48和72h的 SMMC-7721细胞，PBS离心洗涤2次，调整细胞浓 度为l×106个／IIll。加入70％的乙醇1．0ml，离心 洗涤制成单细胞悬液。PI染色，暗室放置，24h内 行流式细胞仪检测。 7．AnnexinV．异硫氰酸荧光素(F1TC)／PI双标 记法定量检测细胞凋亡：分别以50、1{30和200p晤／ml 的沙利度胺处理SMMC-7721细胞48h，离心收集 SMMC-7721细胞1×106+／mi，PBS洗涤2次后，用 490一缓冲液重悬细胞。加入FITC标记的 AnnexinV和PI各5砧，冰上作用10min，上流式细 胞仪检测分析。 8．流式细胞仪测定SMMC-7721细胞中 caspase-3的表达变化：收集50、100和200斗g／ml的 沙利度胺处理24和48h时的SMMC-7721细胞，用 PBS洗涤2次。将SMMC-7721细胞重悬，体积为 100山，加入20—caspase-3-聚乙烯(PE)直标抗体， 以鼠IsG—PE抗体作为对照，4℃避光孵育45min， PBS洗涤2次，24h内上流式细胞仪测定。 9．SMMC-7721细胞内VEGF含量的测定：调整 SMMC-7721细胞浓度为l×106个／llll，以2InL／孔接 万方数据 生堡艘瘗盘壶!Q盟生!旦箜!!鲞笠!翅￡!也』Q堡尘：叁!趔!!!Q塑：y堂：!!，盟!：! 种于6孔培养板，继续培养至满孔。加入50、100和 200斗g／mi的沙利度胺继续培养72h，更换培养液 继续培养48h，取上清液待检。采用人VEGF— ELISA试剂盒，按操作说明书测定VEGF的含量。 10．统计学方法：采用SPSS13．0统计软件进行 统计分析，数据问比较根据资料性质采用方差分析 及t检验。以P<0．05为差异有统计学意义。 结 果 1．沙利度胺对SMMC-7721细胞增殖的影响： MIfr法检测结果显示，空白对照组的A值为0．742± 0．052，对SMMC-7721细胞的增殖没有影响；而沙利 度胺能有效抑制SMMC-7721细胞的增殖，且随着沙 利度胺浓度的增加，其抑制细胞增殖的作用逐渐增 强。统计结果显示，当沙利度胺的浓度>25恤g／ml 时，其对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用明显强于 空白对照组(均P<0．05，表1)。 2．DNA凋亡分析结果：沙利度胺处理SMMC． 7721细胞24h时，可见DNA出现梯形条带，48h时 梯形条带更加明显；而空白对照组虽在48h时也出 现了凋亡梯度条带，但可能为细胞的自然凋亡所至 (图1)。 3．沙利度胺对SMMC-7721细胞形态的影响： 沙利度胺处理SMMC-7721细胞48h时，可见 SMMC一7721细胞出现核固缩和核裂块现象，而对照 组不明显(图2)。 4．PI法检测细胞凋亡的结果：由图3可见，以 200斗g／ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞12、 24、48和72h时，SMMC-7721细胞的凋亡率分别为 3．1％±0．5％、8．4％±1．3％、19．4％±3．5％和 25．8％±2．1％；而空白对照组的SMMC-7721细胞 在培养48h时的自然凋亡率仅为1．6％±0．6％，与 沙利度胺处理24、48和72h时SMMC-7721细胞的 凋亡率差异有统计学意义(均P<0．05)。 l：空白对照组的SMMC-7721细胞培养 24h；2：200∥IIll的沙利度胺处理 SMMC-7721细胞24h；3：空白对照组的 SMMC-7721细胞培养48h；4：200oe,／llll 的沙利度胺处理SMMC-7，72l细胞48h 图1 DNA凋亡分析结果 2a：空白对照组的SMMC-7721细胞培养48h；2b：200斗g／ml的 沙利度胺处理SMMC-7721细胞48h 图2沙利度胺对SMMC-7721细胞形态的影响 5．AnnexinV—FITC／PI双标法检测细胞凋亡的 结果：由图4可见，50、100和200斗g／na的沙利度胺 处理SMMC-7721细胞48h时，SMMC-7721细胞的 凋亡率分别为8．7％±1．2％、16．8％-1-2．5％和 25．4％±4．5％，其凋亡率呈明显的浓度依赖性；而 空白对照组的SMMC-7721细胞在培养48h时的自 然凋亡率仅为2．1％4-0．5％，与沙利度胺处理组的 表1 不同浓度的沙利度胺对SMMC-7721细胞增殖的影响 注：。不|日j浓度沙利度胺处理组的A值与空白对照组比较的结果；一无此项 万方数据 主堡胜疆苤查!Q塑生!旦筮!!鲞筮!翅垫也』鱼!堂：垒!鲤塾!Q塑：y丛：!!，塑!：1 3a：空白对照组的SMMC-7721细胞培养48h；3b：200u．g．／ma的沙利度胺处理SMMC-7721细胞12h；3e：200略／IIll的沙利度胺处 理SMMC-7721细胞24h；3d：200V．g／n_ll的沙利度胺处理SMMC-7721细胞48h；3e：200gg／ml的沙利度胺处理SMMC．7721细胞72h 图3 PI法检测SMMC-7721细胞凋亡的结果 4a：空白对照组的SMMC07721细胞培养48h；4b：50,．g／mi的沙利度胺处理SMMC-7721细胞48h；4e：100V．g／ml的沙利度胺处理 SMMC-7721细胞48h；4d：200她,／ml的沙利度胺处理SMMC-7721细胞48h 图4 AnnexinV—FITC／PI双标法检测SMMC-7721细胞凋亡的结果 差异有统计学意义(均P<0．05)。 6．沙利度胺对SMMC07721细胞表达caspase-3 蛋白的影响：随着沙利度胺浓度的增加或作用时间 的延长，表达easpase．3蛋白的阳性细胞百分率逐渐 增加；而空白对照组随着作用时间的延长，表达 caspase一3蛋白的阳性细胞数量变化并不明显，与沙 利度胺处理组之间的差异有统计学意义(均P< 0．01，表2)。 7．沙利度胺对SMMC-7721细胞体外表达 VEGF的影响：随着沙利度胺浓度的增加，SMMC-7721 细胞体外表达VEGF的量逐渐下降；其中100和200 哕IIll沙利度胺处理组与空白对照组比较，差异有统 计学意义(均P25 斗g／“时，其对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用明 显强于空白对照组(均P<0．05)，与韩亚光等旧1的 研究结果相似。以上结果表明，沙利度胺在体外可 抑制肝癌细胞的增殖，且随着药物浓度的增加，这种 抑制作用逐渐增强。 目前认为，肝癌的发病与细胞凋亡的失衡直接 相关一J。细胞凋亡的主要生物学标志是caspase和 核酸内切酶的活化。活化的核酸内切酶可将DNA 降解，产生180～200bp的寡核苷酸片段，在琼脂糖 电泳中呈现典型的梯状泳带；而在流式细胞仪的 DNA图上则可表现为G，峰前的特征性亚二倍体峰 (即凋亡峰)，根据该峰所占的比例进行凋亡定量分 析。本研究中，我们用沙利度胺处理SMMC-7721细 胞后，于琼脂糖电泳中可见DNA出现梯形条带，且 随着作用时间的延长，梯形条带更加明显；于荧光显 微镜下发现细胞出现核固缩和核裂块现象；于流式 细胞仪DNA图上出现凋亡峰，且随作用时间的延 长，细胞的凋亡率升高。以上结果表明，沙利度胺可 诱导肝癌SMMC-7721细胞产生凋亡。 凋亡早期磷脂酰丝氨酸(PS)从细胞膜内转移 到细胞膜外，使Ps暴露在细胞膜外表面。AnnexinV 对PS有高度的亲和性，可特异性地与PS结合，以被 用于体外检测暴露在细胞表面的PS。PI能透过凋 亡中晚期细胞和坏死细胞的细胞膜而使细胞核红 染。因此，将AnnexinV与PI联合使用，可将凋亡 中晚期的细胞以及坏死细胞区分开来。本研究中， 我们采用AnnexinV—FITC／PI法测定沙利度胺处理 后SMMc_772l细胞的凋亡情况，结果发现，随着沙 利度胺浓度的增加，细胞凋亡率随之增加，呈明显的 浓度依赖性。 caspase活化是细胞凋亡的核心，caspase-3为细 胞凋亡中的关键蛋白酶，在凋亡信号传导的许多途 径中发挥重要功能H0|。本研究中，我们应用不同浓 度的沙利度胺处理SMMC-7721细胞24和48h后， 再加入caspase-3一PE抗体，通过流式细胞仪测定 caspase-3蛋白的表达情况，结果发现，随着沙利度 胺浓度的增加或作用时间的延长，表达caspase-3蛋 白的阳性细胞百分率逐渐增加。以上结果表明，沙 利度胺有诱导细胞凋亡的作用。 有研究的结果表明，沙利度胺的抗肿瘤机制可 能与抑制肿瘤血管的生成有关【111。VEGF是近年 来发现的一种血管生成因子，具有特异和强烈地促 血管内皮细胞分裂增殖、新生血管生成和增加血管 通透性的作用，可作为肿瘤新生血管生成的分子标 志之一¨2|。本研究中，我们以不同浓度的沙利度胺 处理SMMC-7721细胞，结果发现，随着沙利度胺浓 度的增加，SMMC-7721细胞内VEGF的含量逐渐减 低。以上结果表明，沙利度胺有抑制肿瘤血管生成 的作用。 综上所述，沙利度胺可能通过诱导肝癌细胞的 凋亡、抑制肿瘤血管的生成而发挥双重抗肿瘤生长 的作用，有望成为治疗肝癌的有效药物，但尚需要临 床进一步研究证实。 参考文献 [1]心k哪sv．Ctment蜘ofthalidomideinthetreatment0f叫lc∞ Oncolog)r，2001，15：867-874． [2]王喜安，肖正达，金冠球．等．沙利度胺对小鼠肝癌血管形成 的影响．第一二军医大学学报，2001，22：561-563． 【3]梁丹，宋向群．沙利度胺在治疗肺癌中的应用．Oneol，2008， 14：326-328． [4 RajkumarSV，GertzMA，LacyMQ．eta1．Thalidomideasinitial therapyforearly—stagemyeloma．Leukemia．2003，17：775-779． [5 HwuWJ，KrewnSE，PanageasKS，eta1．Temozolomideplus thalidomideinpatientswithadvancedmelanoma：resultsofadose· findingtrial．JClinOncol，2002．20：2610—2615． [6]赵增虎，丁瑞亮，李成云，等．沙利度胺对中晚期肝癌TACE 配合中药治疗后VEGF和MVD的影响．中国误诊学杂志， 2008．8：8866-8867． [7]郑伟生，陈强，叶韵斌，等．沙利度胺对原发性肝癌介人治疗 后生存质量的影响．中国肿瘸临床与康复，2007，14：478-480． [8]韩亚光，李富华．沙利度胺对人肝癌细胞株体外生长的影响． 山东医药，2007，47：30-31． [9]管孝鞠，王爱平．细胞凋亡的定量检测方法．国外医学卫生 学分册，1999。26：16-21． [10]郭荣平，钟崇．石明，等．血管内皮生长冈子和基质金属蛋白 酶-2在肝细胞癌中的表达及临床意义．中华肿瘤杂志，2006， 28：285-289． [11]Ste#zm1I)，Btaldeq，F'dlnxn8J．MechanismofactionintIla瑚M池 te口t0群械．BiochemPharmacol，2000。59：1489—1499． [12]SauterER，NesbitM，WatsonJC，eta1．Vascularendothelial刚 factoris amarkeroftumorinvasionandmetastasisinsquamous cellcarcinomasoftheheadandneck．ClinCancerRes，1999，5： 775-778． (收稿日期：2009-01-08) 万方数据 沙利度胺对人肝癌细胞株SMMC-7721体外生长的抑制作用 作者： 孙萍， 张良明， 孙等军， 董亮亮， SUN Ping， ZHANG Liang-ming， SUN Deng-jun， DONG Liang-liang 作者单位： 青岛大学医学院附属烟台毓璜顶医院肿瘤内科,264000 刊名： 中华肿瘤杂志 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF ONCOLOGY 年，卷(期)： 2009,31(8) 被引用次数： 2次 参考文献(12条) 1.Hwu W J;Krown SE;Panageas KS Temozolomide plus thalidomide in patients with advanced melanoma:results of a dosefinding trial[外文期刊] 2002(11) 2.Rajkumar SV;Gertz MA;Lacy MQ1 Thalidomide as initial therapy for early-stage myeloma[外文期刊] 2003(4) 3.梁丹;宋向群 沙利度胺在治疗肺癌中的应用 2008 4.王喜安;肖正达;金冠球 沙利度胺对小鼠肝癌血管形成的影响[期刊论文]-第二军医大学学报 2001(6) 5.Rajkumar SV Current status of thalidomide in the treatment of cancer 2001 6.Santer ER;Nesbit M;Watson JC Vascular endothelial growth factor is a marker of tumor invasion and metastasis in squamous cell carcinomas of the head and neck 1999 7.Stephens TD;Bunde CJ;Fillmore BJ Mechanism of action in thalidomide teratogenesis[外文期刊] 2000(12) 8.郭荣平;钟崇;石明 血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶-2在肝细胞癌中的表达及临床意义 2006 9.管孝鞠;王爱平 细胞凋亡的定量检测方法 1999 10.韩亚光;李富华 沙利度胺对人肝癌细胞株体外生长的影响[期刊论文]-山东医药 2007(16) 11.郑伟生;陈强;叶韵斌 沙利度胺对原发性肝癌介入治疗后生存质量的影响[期刊论文]-中国肿瘤临床与康复 2007(5) 12.赵增虎;丁瑞亮;李成云 沙利度胺对中晚期肝癌TACE配合中药治疗后VEGF和MVD的影响[期刊论文]-中国误诊学杂 志 2008(36) 引证文献(2条) 1.施有琴.王荣.谢华.贾正平.郭志强.郭立方 沙立度胺抗肿瘤作用机制与临床应用研究进展[期刊论文]-中国药理 学通报 2010(8) 2.施有琴.王荣.谢华.贾正平.孟宪栋.郭志强 沙立度胺及其对映体对人肺癌细胞系NCI-H460细胞抑制作用[期刊论 文]-中国肿瘤 2010(11) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zhzl200908005.aspx