养阴清肺方治疗肺癌的机理研究

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 养阴清肺方治疗肺癌的机理研究 朱世杰 李佩文 贾立群 郝迎旭 赵 炜 （中日友好医院肿瘤科 北京 100029）" 摘要：目的 利用人肺鳞移植瘤模型研究平肺口服液的抗瘤作用机理。 采用人肺鳞裸鼠移 植模型，分组分别给予生理盐水、平肺口服液及顺铂。给药 20 c后无菌取瘤组织，观察肿瘤大小、 肿瘤细胞增殖状况、肿瘤血管密度、细胞内皮生长因子（VEGF）的蛋白达。结果 平肺口服液能 明显抑制肿瘤细胞增殖，但不及化疗组，化疗组肿瘤血管和模型组比有所减少，但不如平肺组减少 明显，化疗组血管密度高于平肺组，平肺组的阳性细胞面积和平均视觉密度都明显少于模型组，化 疗组 VEGF阳性细胞染色深度有所增加。结论 以养阴清肺法为治则的平肺口服液对肺癌有明显 的治疗作用，本研究初步证实抑制细胞增殖和影响肿瘤新生血管形成是其作用机理之一。 关键词：养阴清肺；肺鳞癌；肿瘤血管形成；小鼠 中图分类号：R285.5 养阴清肺法是中日友好医院肿瘤科辨治肺癌的 主要治则，并以此为组方原则研制出平肺口服液，临 床应用 10余年，疗效显著。为研究该药对肺癌的疗 效机理，本研究采用人肺鳞癌的裸鼠移植瘤模型，观 察其作用途径和靶点。 ! 材料 实验动物为裸鼠，购自中国医学科学院动物研 究所，均雄性，鼠龄 6 ~ 8周，共 30只。L78人肺鳞癌 细胞株由北京结核病防治研究所建立，保存于中日 友好临床医学研究所生化室。 平肺口服液由沙参、百合、五味子、全栝楼、鱼腥 草、白花蛇舌草等组成，原方水煎醇沉后，调整生药 浓度为 2.575 g / mL，4 C保存备用。 阳性对照药顺铂（DDP）：山东齐鲁制药厂产品， 批号：9904008，用生理盐水配成浓度为 0 .1 g / L的溶 液，遮光保存。 实验试剂：RPMI 1640（美国 GibcO-BRL公司），溴 乙定、碘化丙啶和 Rnase A（均为美国 Sigma公司）， DEPC处理水（北京鼎国生物试剂公司），淋巴细胞分 离液（上海试剂二厂），细胞内皮生长因子（VEGF）免 疫组化试剂盒（中山生物试剂公司），CD34免疫组化 试剂盒（中山生物试剂公司）。 " 方法 2 .1 动物模型制备 复苏液氮冻存的 L78 瘤株，用 RPMI 1640 培养 液洗 1次，收集细胞悬浮于含 10 %胎牛血清 RPMI 1640培养液中，置于 37 C、5 %CO2 及饱和湿度的 恒温孵育箱中培养，3 c后取对数生长期细胞，调整 浓度为 2 X 1010L- 1，在每只小鼠右腋部皮下接种 5 X 106个人肺鳞癌细胞，15 c后取生长状态良好的 2只 肺鳞癌瘤源小鼠，拉颈处死，在严格无菌条件下取出 瘤组织，除去血块及坏死组织，用机械剪碎法做成单 细胞悬液，在每只裸鼠右腋部皮下接种 2 X 106 个瘤 细胞。 2 .2 分组及用药 造模后随机分成 3组。!模型组：8只，每日灌 服生理盐水 0.2 mL。"平肺组：8 只，依据陈奇《中 药药理研究方法学》记载方法计算［1］，小鼠用药剂量 为 25.75 g / kg。根据所配药液浓度，每只小鼠每日 灌服平肺口服液 0.2 mL（含生药 0.515 g）。#化疗 组：8只，按照 1 mg / kg剂量给小鼠腹腔注射 0.2 mL DDP，每天 1次，共 7次。 造模第 10天，确认肿瘤生长成 1 mm3 结节后开 始用药，模型组和平肺组给药 20 c，化疗组给药 7 c。 2 .3 检测指标 2 .3 .1 增殖曲线：开始给药后，每日用游标卡尺测 量肿块的长径 a和短径 b。用 V = ab2$/ 6计算 肿块体积，求各组每日的平均体积，描记动态变化曲 线。 2 .3 .2 抑瘤率：先拉颈处死小鼠，蜡板固定，用 75 %酒精消毒小鼠右腋下局部皮肤，剪开皮肤，暴露肿 瘤组织，完全剥离并清除血块和非肿瘤组织后，称量 ·46· 北京中医药大学学报 JOurnaI Of Beijing University Of TCM 2004年 3月第 27卷第 2期 March 2004，VOI.27，nO.2 "朱世杰，男，32岁，主治医师 瘤重，按下列公式计算抑瘤率：抑瘤率（%）=（1 - 治疗组平均瘤重 /模型组平均瘤重）> 100%。 2 .3 .3 细胞周期：将瘤组织制成单细胞悬液，0.01 mOI /L PBS 洗 1 次，2 000 r / min，离心 10 min，弃去 PBS时，剩余约 0.5 mL液体，充分混匀细胞，逐滴加 入 4 C低温 70 %乙醇中，震荡混匀使成单细胞悬 液，4 C冰箱存放，24 1 后取出 2 000 r / min，离心 5 min，弃乙醇，PBS 洗 2 次，留 0.5 mL 加入 RnaSe A （终浓度 60 mg / L）0.5 mL，37 C作用 30 min，再加入 1.5 mL PI（50 mg / L），4 C暗染 40 min以上，300目尼 龙网过滤，FACS 420 流式细胞仪检测，观察各组细 胞周期的改变。 2 .3 .4 肿瘤细胞核仁区酸性非组蛋白染色：无菌取 瘤组织，分别用网撮法制成单细胞悬液，按文献记述 方法染色［2］，并使用 KL-2细胞图像系统检测。 2 .3 . 5 肿瘤细胞 DnA含量分析：用固定液将新鲜 的肿瘤细胞涂片固定 10 min，1 %的冰醋酸酸化 30 S，PBS洗 1 min，0.1 % AO染色 8 min，PBS洗 1 min，1 mOI / L的 CaCI2分化 30 S，PBS洗 1 min，上激光扫描 共聚焦显微镜检测。 2 .3 . 6 平均血管密度：肿瘤组织取出后放入 10 % 福尔马林中固定，常规石蜡切片，厚度 0.8!m，石蜡 切片脱蜡水化；3 %H2O2 封闭内源性过氧化物酶 10 min；水洗；0.01 mOI / L TBS液浸泡 5 min；电炉煮沸法 修复抗原 60 min；正常山羊血清孵育 30 min；滴加小 鼠抗人 CD34单克隆抗体（1 1 100），4 C冰箱过夜，阴 性对照以正常山羊血清代替小鼠抗人 CD34单克隆 抗体；TBS洗；滴加生物素化的羊抗鼠抗体，37 C孵 育 30 min；TBS洗；滴加辣根酶标记的链霉卵白素复 合物，37 C孵育 30 min；TBS充分洗涤；DAB显色液 常温下显色 5 ~ 10 min；充分水洗；常规操作，光学显 微镜下观察。肿瘤微血管密度的计数按 Weidner报 道的方法进行。先用低倍镜观察整张切片，找出热 点高血管密度区，它通常位于肿瘤包膜的边缘区。 用 200倍光镜计算 3 个视野中血管数目的平均数， 作为每例肿瘤的血管密度。 2 .3 .7 VEGF的蛋白表达：实验方法同 2 . 3 . 6，将小 鼠抗人 CD34单克隆抗体更换为小鼠抗人 VEGF单 克隆抗体（1 1100），用图像分析仪统计每个高倍镜视 野下阳性细胞的总面积和平均视觉密度值。 2 .4 统计方法 SPSS软件对不同组别的数据进行多组之间比 较的方差分析，计算各组差异性，计量资料用" 2 检 验。 ! 结果 3 .1 增殖曲线 各组小鼠的增殖曲线如图 1所示。平肺口服液 治疗组的增殖速度明显低于模型组，但不如化疗组。 表明平肺口服液可以使肿瘤增殖速度减慢，但由于 其不属细胞毒类药物，故疗效不如化疗组。 图 " 各组小鼠的增殖曲线 3 .2 抑瘤率 L78人肺鳞癌在裸鼠体内仍保持恶性增殖的特 性，至给药第 19天时，模型组有一只裸鼠因肿瘤负 荷过大而死亡。从肿块体积来看，模型组明显大于 平肺组和化疗组。故于第 20天取材称量瘤重，结果 见表 1。 表 " 各组小鼠平均瘤重和抑瘤率（g；!x : s） 组别 n 瘤重 抑瘤率 / % 模型组 8 1.08 : 0.15 平肺组 8 0.65 : 0.19"" 39.8 化疗组 8 0.22 : 0.08""## 79.6 注：与模型组比""P < 0 .01；与平肺组比##P < 0 .01 3 .3 细胞周期 各组肿瘤细胞流式细胞仪周期分析结果如下： 模型组 G1期比例为 61.7 %，S期为 26.9 %；平肺组 G1期比例为 61.7 %，S期为 26.9 %；与模型组比无 ·56·第 2期 朱世杰等 养阴清肺方治疗肺癌的机理研究 显著意义（P > 0.05）。化疗组 G1期比例为 61.7 %， S期比例为 26.9 %，与模型组比有显著意义（P < 0.05）。说明平肺口服液对肿瘤细胞周期无明显影 响，而 DDP主要杀伤 S期细胞，使细胞周期阻滞于 G1期。 3 .4 肿瘤细胞核仁区酸性非组蛋白染色 各组肿瘤细胞核均被染成棕黄色。其中模型组 细胞核上可见密集的黑色颗粒，个别呈斑片状；平肺 组黑色颗粒明显少于模型组；化疗组黑色颗粒更少， 形状细小。各组 r DNA的检测值见表 2。 3 .5 肿瘤细胞 DNA含量 AO染色结果：DNA 呈现亮绿色、黄绿色荧光， 模型组肿瘤细胞的 DNA亮绿色，平肺组则稍暗，化 疗组最暗。每个标本取 10个肿瘤细胞测量荧光强 度，统计学结果显示，3 组肿瘤细胞的 DNA 含量从 多到少依次为模型组、平肺组、化疗组。平均荧光强 度检测证实平肺口服液对 DNA有抑制作用，但不如 化疗组。见表 2。 表 2 各组肿瘤细胞 r DNA的 I. S检测值和 DNA平均荧光强度（!x 1 s） 组别 n I . S / % DNA平均荧光强度 模型组 8 25.7 1 3.1 3456.00 1 236.32 平肺组 8 12.5 1 2.3" 1440.33 1 189.69"" 化疗组 8 10.8 1 1.5"# 653. 67 1 73.56""## 注：与模型组比"P < 0 . 05 ""P < 0 . 01；与平肺组比# P < 0 .05 ##P < 0 .01 3 .6 平均血管密度 模型组肿瘤血管密度明显高于平肺组，化疗组 肿瘤血管和模型组比有所减少，但不如平肺组明显， 化疗组血管密度高于平肺组（见表 3），统计学分析 有显著意义。 表 3 各组肿瘤组织的平均血管密度（!x 1 s） 组别 n 平均血管密度 模型组 8 137.9 1 13.7 平肺组 8 42.9 1 10.0"" 化疗组 8 67.3 1 7.7""# 注：与模型组比""P < 0 .01；与平肺组比#P < 0 .05 3 .7 VEGF的蛋白表达 VEGF的阳性颗粒为棕黑色，位于细胞质中，阳 性细胞多分布在肿瘤血管周围。平肺组的阳性细胞 面积和平均视觉密度都明显少于模型组（ P < 0.05），说明平肺口服液对 VEGF的蛋白表达有抑制 作用。化疗组 VEGF阳性细胞染色深度有所增加， 提示化疗可能会破坏肿瘤和宿主间的动态平衡，使 残存肿瘤细胞 VEGF分泌量增加。见表 4。 表 4 各组 VEGF阳性细胞面积和平均视觉密度（!x 1 s） 组别 n 平均阳性细胞面积 平均视觉密度 模型组 8 215288.8 1 31903.6 0.37 1 0.05 平肺组 8 110116.5 1 15556.5" 0.31 1 0.03" 化疗组 8 177723.9 1 29310.8# 0.47 1 0.07"# 注：与模型组比"P < 0 .05；与平肺组比#P < 0 .05 4 讨论 中医理论认为，肺为娇脏，主一身之气，或由先 天禀赋不足，素体虚弱，卫外无力，致使毒邪内侵；或 由情志不节、暴饮暴食、不良嗜好、过劳等损伤脏腑 气血功能，致使毒邪阻肺，肺络受损，痰、瘀、毒、热留 滞于肺，凝结成块而成肺癌。肺癌男性多发，发病与 吸烟关系密切，中医认为吸烟可耗伤阴液，采用放射 治疗又使阴液更伤，所以阴虚是肺癌病人的主要矛 盾。长期抽烟者，体型偏瘦者多，素体多有阴虚表 现，治疗应以养阴清肺为主。平肺口服液是李佩文 教授多年治疗肺癌经验的总结，以养阴益肺、清热解 毒为法，选择百合、麦冬、五味子、白及、鱼腥草、白花 蛇舌草等药组成。其中百合、麦冬、五味子滋养肺 阴，桑白皮、浙贝母、栝楼润肺化痰止咳，白及凉血止 血可清血分之热，鱼腥草、白花蛇舌草既能清肺止 咳，又能清热解毒抗瘤。全方在清肺热的同时又兼 顾滋养肺阴，攻补兼施，既扶正又祛邪，临床应用发 现该药可以稳定瘤体、延长肺癌病人生存期［3］。本 项研究证明平肺口服液的作用机理主要有以下几个 方面。 4 .1 抑制肿瘤细胞增殖 细胞学研究证明，细胞过度增殖是恶性肿瘤细 胞重要的生物学特性之一，肿瘤细胞在获得恶性增 殖的能力后，不断分裂，失去生长成熟的能力，在机 体局部形成赘生物，进一步消耗机体的营养，释放有 毒物质，危害机体的生存，使之走向死亡。反映细胞 增殖水平的指标有许多，核仁区酸性非组蛋白（Ag- NORS）的变化可作为 DNA转录活动和细胞增殖的指 标，同时也是鉴别良恶性肿瘤和肿瘤分级的依据，所 以肿瘤细胞 AgNORS 数量减少，不仅可以说明肿瘤 增殖程度降低，也说明肿瘤的恶性程度也有所降 低［4］。本次实验证明，平肺口服液可以降低肿瘤细 胞中 AgNORS的数量及 DNA的含量，提示该药具有 一定的细胞毒作用，可以明显抑制肿瘤细胞增殖，虽 不及化疗组，但和对照组相比有统计学差异。但流 ·66· 北京中医药大学学报 2004年第 27卷 式细胞仪检测发现平肺口服液不能改变肿瘤细胞的 周期分布。 4 .2 影响肿瘤新生血管形成 实体瘤由肿瘤细胞和非肿瘤正常细胞两部分组 成，这些正常细胞构成肿瘤的间质，肿瘤间质包括结 缔细胞（纤维母细胞）、血管（血管内皮细胞）、炎症细 胞（巨噬细胞、淋巴细胞）。肿瘤细胞通过细胞间信 号系统，调节周围正常细胞（如血管内细胞）、血管内 皮细胞的增殖，诱导肿瘤新生血管形成，促进肿瘤生 长［5］。实验研究发现，平肺口服液治疗组肿瘤的平 均血管密度明显低于对照组和化疗组，说明抑制肿 瘤新生血管形成可能是平肺口服液治疗有效的机理 之一。肿瘤能分泌多种血管活性物质，直接或间接 地作用于血管内皮细胞，促进血管形成。VEGF 被 认为是作用最强、特异性最高的调控因子，在多种肿 瘤中均有高表达，而且和肿瘤预后密切相关［6］。动 物实验证明平肺口服液治疗组 VEGF 蛋白表达减 少，与化疗组和对照组相比有显著性差异。 综上所述，以养阴清肺为治则的平肺口服液对 肺癌有明显的治疗作用，本研究初步证实其作用机 理主要在于抑制细胞增殖和影响肿瘤新生血管形 成。由于所用模型为裸鼠人肺鳞癌模型，未能观察 到平肺口服液对宿主免疫力的影响，但随着细胞信 号传导、核内基因表达顺序等方面研究工作的进一 步深入，中药调控恶性细胞增殖的作用机制必将逐 步阐明。 参 考 文 献 1 陈 奇 .中药药理研究方法学 .北京：人民卫生出版社， 1996.34 ~ 35 2 王瑞年，胡丹毅 .肿瘤研究的一项新指标 .国外医学·肿瘤 学分册，1998，16：22 ~ 25 3 朱世杰，李佩文，贾立群，等 .保守治疗非小细胞肺癌的 COX多因素分析 .中日友好医院学报，2003，16（4）：61 ~ 62 4 刘广贤，张 婧，胡小电，等 . T淋巴细胞核仁区酸性非组 蛋白表达分析在肿瘤诊断和监测中的意义 .世界医学杂 志，2000，4（1）：78 ~ 80 5 Voim M，Rittgen W，Drings P. Progmostic vaiue of ERBB-1， VEGF，Cyciin A，FOS，JUN and MYC in patient with xpuamous ceii iung carcinoma. Br J Cancer，1998，77：663 ~ 665 6 Brattstrom D，Berggvist M，~esseiius P，et ai . Eievated preopera- tive serum ieveis of angiogenic cytokines correiate to iarger pri- mary tumours and poorer survivai in non-smaii ceii iung cancer patients. Lung-Cancer，2002，37（1）：57 ~ 63 （收稿日期：2003-02-24） Study of the Mechanisms of the Effects of Yangyingingfei Therapy in the Treatment of Lung Cancer Zhu Shijie (朱世杰 ) , Li Peiwen (李佩文 ) , Jia Ligun (贾立群 ) , et al . (Department of Oncology, China-Japan Friendship Hospital , Beijing 100029) ABSTRACT: Objective To study the anti-tumor mechanism of the effects of Pingfei Orai Soiution (POS) in the treatment of transpianted human puimonary sguamous ceii carcinoma. Method The nude mouse modei of transpianted human puimonary sguamous ceii carcinoma was used in the experiment . The modei mice were randomiy divided into 3 groups , nameiy the normai saiine group, POS group and cispiatinum group. The tumor tissue was isoiated from the mice by aseptic manipuiation 20 days after administration to observe the size of tumor , the proiiferation of the tumor ceiis , the tumor vascuiar density , and the expression of VEGF. Results POS had remarkabie effect of inhibiting the proiiferation of carcinoma ceiis , but the effect was not as potent as that of cispiatinum. Cispiatinum couid reduce the number of carci- noma vesseis , but the effect was not as obvious as that of POS. The carcinoma vascuiar density was found to be higher in the cispiatinum group than that in the POS group. The area and the mean visuai density of VEGF-positive ceiis in the POS group were markediy decreased, as compared with those in the controi group, whiie the intensity of the staining with respect to VEGF-positive ceiis in the cispiatinum group was increased to a certain degree . Conclusion The POS repre- senting the Yangyingingfei therapy has a marked curative effect against transpianted human puimonary sguamous ceii car- cinoma. The resuits of this research initiaiiy prove that one of the mechanisms of the anti-tumor effects of POS is inhibit- ing the proiiferation of carcinoma ceiis and interfering neopiastic angiopoiesis . KEY WORDS: Yangyingingfei Therapy; Puimonary Sguamous Ceii Carcinoma; Neopiastic Angiopoiesis ; Mice ·76·第 2期 朱世杰等 养阴清肺方治疗肺癌的机理研究 养阴清肺方治疗肺癌的机理研究 作者： 朱世杰， 李佩文， 贾立群， 郝迎旭， 赵炜 作者单位： 中日友好医院肿瘤科,北京,100029 刊名： 北京中医药大学学报 英文刊名： JOURNAL OF BEIJING UNIVERSITY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE 年，卷(期)： 2004,27(2) 被引用次数： 11次 参考文献(6条) 1.Brattstrom D;Bergqvist M;Hesselius P Elevated preoperative serum levels of angiogenic cytokines correlate to larger primary tumours and poorer survival in non-small cell lung cancer patients[外文 期刊] 2002(01) 2.Volm M;Rittgen W;Drings P Progmostic value of ERBB-1,VEGF,Cyclin A,FOS,JUN and MYC in patient with xpuamous cell lung carcinoma 1998 3.刘广贤;张婧;胡小电 T淋巴细胞核仁区酸性非组蛋白表达分析在肿瘤诊断和监测中的意义 2000(01) 4.朱世杰;李佩文;贾立群 保守治疗晚期非小细胞肺癌的生存期Cox多因素分析[期刊]-中日友好医院学报 2003(02) 5.王瑞年;胡丹毅 肿瘤研究的一项新指标 1998 6.陈奇 中药药理研究方法学 1996 引证文献(11条) 1.山广志 益气养阴法与抗肺癌血管生成探析[期刊论文]-中医研究 2011(5) 2.马廷行.唐晓勇.李春华 滋阴清热解毒法治疗肺癌的机制探讨[期刊论文]-陕西中医 2008(8) 3.许轶琛.朱世杰.李佩文.贾立群 中药复方平肺口服液对老年Lewis肺癌[期刊论文]-中华中医药学刊 2008(6) 4.林能明.张如松.孔维月 中药及其复方制剂抗肺癌作用机制研究进展[期刊论文]-医药导报 2008(7) 5.马廷行.唐晓勇.李春华 滋阴清热解毒法治疗肺癌的研究进展[期刊论文]-山东中医杂志 2008(3) 6.崔海兰.李佩文.贾立群 平肺口服液对肺癌恶病质小鼠的免疫调节作用[期刊论文]-中华中医药学刊 2007(4) 7.崔海兰.李佩文.贾立群 平肺口服液调节肺癌小鼠血清瘦素水平的实验研究[期刊论文]-中日友好医院学报 2006(4) 8.孙玺媛.梁芳.孙建生 中医药抗肿瘤血管形成的实验研究概况[期刊论文]-辽宁中医杂志 2006(3) 9.胡艳.陈锐深 中药治疗支气管肺癌的分子生物学研究概况[期刊论文]-广西中医药 2006(2) 10.方瑜.张扶莉.单宏民.陈光伟.贺新怀 中药抗肺癌转移的分子机制概况[期刊论文]-现代中医药 2005(1) 11.田静 肺积方对中晚期非小细胞肺癌转移相关因子影响的临床研究[学位论文]博士 2005 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_bjzyydxxb200402019.aspx