HPLC法测定银杏叶软胶囊中总黄酮的含量

2010年11月第7卷第33期 ·药品鉴定 · H P LC法测定银杏叶软胶囊中总黄酮的含量 叶秀波 ，岑帼英 ，李瑞明 (1．广州市海珠区中医院 ，广东广州 510220；2．中山大学附属第一 医院药学部 ，广东广州 510080) 【摘要】目的 ：采用 RP-HPLC法测定保健食品银杏叶软胶囊中总黄酮的含量 。 ：采用 Agilent C 8(4．6 mmx250 mm， 5 m)色谱柱 ，流动相为 甲醇一水 (用磷酸调 pH 为 2．5)(50：50)，流速 为 1．0 ml／min，检测 波长为 360 nm，柱温为 30oC。结果 ：槲皮素 、山奈素 、异 鼠李素的线性范围分别为 0．050～0．400、0．005～0．040、0．005～0．040 Ixg；3批样品中总黄 酮含量分别为 6．466、6．455、6．838 m 垃。结论：本法简便 、准确、分离效果好 ，适合于银杏叶软胶囊总黄酮的含量测定。 【关键词】银杏叶软胶囊；总黄酮；槲皮素 ；山奈素；畀鼠李素；含量测定 【中图分类号】R927．2 【文献标识码】A 【文章编号】1673—7210(2010)11(C)-029-03 Determination 0f Total Flavonoid in Yinxingye Soft Capsules by HPLC l，E Xiubo ，CEN G∞ ，☆ LI Ruiming2 f1．Traditional Chinese Medicine Hospital of Haizhu District，Guangzhou 510220，China；2．Department of Pharmacy，the First Amliated Hospital of Sun Yat—sen University．Guangzhou 510080．China) [Abstract]Objective：To establish an RP—HPLC method for quantitative determination of Total Flavonoid in Yinxingye Soft Capsules．Methods：The analytical column was Agilent C18 (4．6 mmX 250 mm，5 Ixm)column．The mobile phase was composed of methanol and water fwith phosphoric acid pH=21 at a flow rate of 1．0 ml／min．The wavelength of UV detector was 360 nm and columu temperature was 30℃．Results：The linear ranges of Quercetin，Kaempferol and Isorhamnetin were 0．050—0．400．0．005—0．040．0．005—0．040 Ixg，respectively．The contents of Total F1avonoid in three batches of samples were 1 Capsule 6．466。6．455，6．838 mg．Conclusion：This method iS sensitive，repeatable and suitable to determ ine the content of Total Flavonoid in Yinxingye Soft Capsules． [Key words】Yinxingye Soft Capsules；Total Flavonoid；Quereetin；Kaempferol；Isorhamnetin；Determination 银杏叶软胶囊是 由银杏提取物与适量 的基质制成的软 胶囊 ，银杏提取物 中含有黄酮类化合物和银杏总内酯两类生 物活性物。其 中，总黄酮类包括槲皮素 、山奈素、异 鼠李素等， 共同作用于心脑和外周末梢血管系统 ，促进血液循环和改善 末梢血液的运行 ，从而预防血管系统循环障碍所 引起的各种 症状 。另外 ，黄酮类化合物有清除游离氧的抗氧化等药理作 用Ill。本文用 HPLC法测定总黄酮的含量 ，为建立银杏叶软胶 囊质量控制方法提供依据 。 1仪器与试药 1．1仪 器 LC一2010高效液相色谱仪 (日本岛津公司)；KQ一300超 声清洗仪 (昆山市超声仪器有限公司)；色谱柱 Agilent C (4．6 minx250 mm，5 Ixm)。 1．2试 药 槲皮素对照品(供含量测定 用 ，批号 ：10081—200406，中 国药品生物制品检 验所 )；山奈素对照品(供含量测定用 ，批 号：110861—200303，中国药品生物制品检验所 )；异鼠李素对 照品(供含量测定用 ，批号：110860—200205，中国药品生物制 品检验所 )；甲醇 为色谱纯 ，水为重蒸馏水 ，其他试剂均为分 析纯 ，银杏 叶软胶囊 (批号 ：080510、080920、091026，广州美 丽康有限公司)。 2方法与结果 2．1色谱条件 采用 Agilent C】8(4．6 mmx250 mm，5 m)色谱柱 ，流动相 【作者简介】叶秀波(1972一)，女，毕业于广州中医药大学，主管药师。 为甲醇一水 (50：50)(用磷酸调 pH为 2．5)，流速为 1．0 ml／min，检 测波长为 360 nm嘲，柱温为 30℃。在本条件下，槲皮素、山奈 素 、异 鼠李素能达到较好分离。其他成分对测定无干扰 ，结果 见图 1。 2．2溶 液 的制备 2-2．1混合对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、山奈素 、异 鼠李素对照品适量加 甲醇制成槲皮 素浓度为 1．0 mg／m~、山 奈素浓度为 0．1 mg／ml、异 鼠李素浓度为 0．1 mg／ml的单一成 分对照品贮备液。分别精密量取上述槲皮素对照品贮备液 4 ml、 山奈素对照品贮备液 4 ml、异 鼠李素贮备液 1 ml，置 10 ml 量瓶中用甲醇定容至刻度，摇匀，即得槲皮素浓度为0．4384mg／ml、 山奈素浓度为 0．042 2 mg／ml、异鼠李素浓度为 0．010 0 mg／ml 的混合对照品溶液 。 2．2．2供试 品溶液 的制备 取本品装量差异下 的内容物 2 g． 精密称定，加 20 ml甲醇超声提取 30 min，滤过 ，滤液加入 1．5 mol／L盐酸溶液 20 ml，水浴回流 3 h，冷却后用甲醇定容 至 50 m1量瓶 ，摇匀 ，过 0．45 Ixm微孔滤膜滤过 ，即得[31。 2．3线性关系的考察 精密吸取“2．2．1”项下槲皮素 、山奈素 、异 鼠李素备用对 照品溶液加 甲醇配制成含一系列浓度的混合溶液：对照品溶 液 1(含槲 皮素 0．050 mg／ml、山奈 素 0．005 mg／ml、异 鼠李 素 0．005 mg／m1)，对照品溶 液 2(含槲皮素 0．100 mg／ml、山奈 素 0．010 mg／ml、异鼠李素 0．010 m#m1)，对 照品溶液 3(含槲皮 素 0．150 mg／ml、山奈素 0．015 mg／ml、异 鼠李素 0．015 mg／m1)， 对照品溶液 4(含槲皮素 0．300 mg／ml、山奈素 0．030 mg／m~、异 CHINA MEDICAL HERALD 巾国医药导报 29 · 药品鉴定 · 0 2．5 S．0 7．5 f0．0 t2．5 15．0 47．5 20．0 22．5 25．0 27．5 A a b ／、 C O 2．5 5．O 7．5 1O．O 12，5 15 O 17．5 20．0 22．5 25 O 27．5 B 图 1 HPLC色谱 图 (A．供试 品；B 对照品 ；a．槲皮素 ；b．山奈素 ；c．异鼠李 素J Fig．1 HPLC chromatography (A Sample；B Reference substance：a．Quercetin；b．Kaempferol； c．Isorhamnetin) 鼠李素 0．030 mghn1)，对照品溶液 5(含槲 皮素 0．400 m ml、 山奈素 0．040 mg／ml、异鼠李素 0．040 m#m1)。精密吸取上述 对照品溶液各进 10 I记录峰面积 ，以峰面积 为纵坐标 ， 进样量 (rag／g)为横坐标进行线性 回归 ，得槲皮素 、山奈素 、 异鼠李素的回归方程分别为：槲皮素 Y=31 248 671X一15 558 (r=O．999 5)；山奈素 Y=30 421 567X+614 692(r=O．999 9)； 异鼠李素 Y=24 180 21 一225 760(r=0．999 7)。结果明槲 皮素 、山奈素 、异鼠李素进样量分别在 0．050～0．400、0．005～ 0．040、0．005 0．040 g范围内与峰面积呈 良好线性关系。 2．4精 密度试 验 精密吸取混合对照品溶液 10 l，重复进样 5次，记录峰 面积。结果槲皮素 、山奈素、异鼠李素的峰面积的 RSD分别 为 1．8％、1．7％、1．6％。结果表明本法精密度 良好。 2．5稳 定性试 验 取银杏叶软胶囊 (批号 ：080510)的供试品溶液 ，分别于 (0、l、2、4、8、12、24 h)进样 20 H己录峰面积 ，结果槲皮素 、 U1奈素 、异 鼠李 素的 峰面积 的 RSD分别 为 2．8％、2．5％、 2．8％ 结果表明供试品溶液在 24 h内基本稳定 。 2．6重现 性试验 取同一批号银 杏叶软胶囊 (批号 ：0805lo)各 6份 ．按 “2．2．2”项下方法制备供试 品溶液 ．分别进样 20 1，记录峰面 积 ，计算含量 ，再按总黄酮醇苷含量=(槲皮素含量+山柰素含 量+异鼠李素含量 )×2．5l[2／计算 ，样品中槲皮素 、山奈素 、异鼠 李素的含量分别为 2．33、0．19、0．06 mg／粒 ，总黄酮醇苷平均含 量为 6．46 m 粒(RSD=1．5％)。结果表明本法重复性 良好。 2．7加样 回收 率试验 精密称取 已知含量的同一批 号银杏 叶软胶囊 f批号 ： 080510)适量，按表 1稍密加入对照品，按供试品溶液制备项 30 巾国医药写报 CHINA MEDICAL HERALD 下操作测定 ，结果见表 1。 2010年 11月第 7卷第 33期 表 1 回收率试验结果【n=9) Tab．1 Results of recovery test(n=9) 2．8样 品含 量测 定 分别取 3批银杏叶软胶囊样品 ，按“2．2．2”项下方法制备 供试品溶液。分别精 密吸取“2．2．1”项下混合对照品溶液 10 l及供试品溶液 20 l，注入色谱仪 ，记录峰面积。按外标法 计算样品中槲皮素 、山奈素 、异鼠李素的含量 ，并换算成总黄 酮醇苷的含量 、结果见表 2。 表 2 样 品含量测定结果(％。n=3】 Tab．2 Content determination results of samples(％，n=3) 3讨论 在提取过程中 ，比较采用甲醇一25％盐酸溶液 (4：1)的混 合溶液水浴加热 匝】流法、甲醇超声提取 、盐酸加热水解法三 (下转第 41页 ) 2010年 11月第 7卷第 33期 表 1 两组治疗后 DNS评分结果 Tab．1 DNS score results after treatment of the two groups ：Fisher确l刃概率法计算，差异无统计学意义(P>0．1)，其余均有统 汁学意 义(均 P<0．05) ：for the calculation of Fisher exact test，no significant difference(P>O．1)， and there were significant difference in the others fP<0．051 2．2正 中神经、腓神 经的运动传导速度及感觉传导速度测定 凯时组治疗前后神经传 导速度比较 ，差异有统计学意义 (P<0．01)；睛尔组治疗前 后神经传导速 度比较 ，差异有统计 学意义 (P<0．05)；凯时组疗效较 晴尔组 明 ，差异有统计学 意义(P<0．05)，见表 2。 表 2 两组治疗前后神经传导速度变化 (x+s。m／s Tab 2 Changes in nerve conduction velocity before and after treatment ±5，m／s) 与治疗前 比较 ， 尸<0．05，”尸l分析

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