酶工程在酿酒工业中的应用

酶工程在酿酒工业中的应用 何进武,黄惠华 (华南理工大学轻工与食品学院,广东 广州 510640) 摘 要:综述了酶工程在啤酒、白酒、黄酒中的应用,并对它未来在酿酒工业中应用的发展趋势作了概括。 关键词:酶工程;啤酒;白酒;黄酒;应用 中图分类号:Q814.9;TS26 文献标识码:B 酶是活细胞产生的具有高效催化功能、高度专一性和高 度受控性的一类特殊蛋白质[1]。其催化作用条件非常温和,可 在常温常压下进行,又具有可调控性。 酶工程是现代生物技术的一个重要组成部分。酶工程又 称酶反应技术,就是指在一定的生物反应器内,利用生物酶作 为催化剂,使某些物质定向转化的工艺技术,包括酶的研制与 生产,酶和细胞或细胞器的固定化技术,酶分子的修饰改造, 以及生物传感器等[2]。其应用范围已遍及工业、医药、农业、化 学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面[1]。 与此同时,酶工程产业也在快速发展。据报道,全世界已发现 的酶有 3000多种,目前工业上生产的酶有 60多种,真正达到 工业规模的只有20多种。剂型和品种有600多个[3]。1998年 全世界工业酶制剂销售额高达16亿美元。预计到2008年,销 售额将达到30亿美元[3,4]。近年来,美国、欧洲共同体国家和日 本,在酶工程研究和酶工程产业方面发展非常迅速,仍然居于 领先地位。 食品工业是应用酶工程技术最早和最广泛的行业[5]。近年 来,由于固定化细胞技术应用化、固定化酶反应器的推广应 用,促进了食品加工工艺的发展优化,食品添加剂新产品的开 发,产品品种增加,质量提高,成本下降。本文简单介绍酶工程 在酿造工业中的应用。 1啤酒工业中的应用 啤酒以其特有的“麦芽的香味、细腻的泡沫、酒花的苦涩、 透明的酒质”为人们所喜爱。由于啤酒含有丰富的氨基酸和维 生素,因此被称为“液体面包”。制麦芽大麦含有全麦啤酒酿造 用到的所有的酶,现在企业用到大量的谷物作为替代品,所以 需要外源酶[6]。而利用现代酶工程技术与传统啤酒酿造技术相 结合,将提高啤酒质量,降低生产成本,增加企业效益。酶在啤 酒生产中的作用主要有辅料液化、提高发酵度降低双乙酰、改 善麦汁过滤、增加 α-氨基酸、提高啤酒稳定性、改善膜过滤 速度[7,15]、消除杂菌污染、啤酒除氧等[7]。 1.1淀粉酶 早期的啤酒主要以麦芽为原料,成本较高。而现在广泛利 用各种原料如大米、玉米、小麦、杂粮等作为辅料。使用辅料量 一般占 30%左右,不少工厂高达40%~50%。提高辅料比,可降 低粮耗、降低成本;同时又能提高啤酒质量,使啤酒清淡爽口[7]。 陈廷登等人研究了以 60%大米为辅助原料,通过添加酵 母提取物作为补充氮源和外加耐高温 α-淀粉酶、糖化酶促 进淀粉糊化、液化和糖化的高辅料啤酒酿造新工艺。结果显示 该新工艺在保证啤酒质量的同时,又降低了啤酒酿造成本,具 有较显著的经济效益[8]。这些辅料价值的实现,都和淀粉酶作 用分不开。辅料中的淀粉经过糊化后在淀粉酶的作用下水解 成糊精和低聚糖,最终产物为麦芽糖、麦芽三糖、麦芽五糖。 淀粉酶可分为 α-淀粉酶、β-淀粉酶和 γ-淀粉酶。真 菌 α-淀粉酶是由曲霉属微生物发酵产生的一种 α-淀粉 酶。与细菌 α-淀粉酶不同的是,真菌 α-淀粉酶的最适作 用温度为 55℃左右,超过 60℃开始失活;其水解淀粉的产物 主要是高含量的麦芽糖和一些低聚糖及少量的葡萄糖。而细 菌 α-淀粉酶最适作用温度高(中温 α-淀粉酶 70～80℃, 耐高温 α-淀粉酶为 95～105℃),水解淀粉的主要产物是糊 精。β-淀粉酶水解淀粉产生麦芽糖。可用来生产高麦芽糖 浆、高纯度麦芽糖,医用针剂麦芽糖,麦芽糖醇,麦芽糊精,啤 酒等。这两种酶都可以用来淀粉液化,但是目前应用和研究的 较多的是 α-淀粉酶,特别是耐高温,酸性的 α-淀粉酶[9-15]。 在生产中应选用哪种酶及其剂量要根据所生产啤酒糖浆的类 型来选择[17]。γ-淀粉酶又叫葡萄糖淀粉酶,简称糖化酶。它的 主要作用是水解淀粉、糊精、糖原等,最终得到葡萄糖。它在啤 酒辅料液化糖化中必不可少,还可提高麦汁的可发酵度和麦 汁糖化的组分,目前的发展方向是通过分离出来的耐高温糖 化酶构建糖化酶工程菌[16]。 1.2α-乙酰乳酸脱羧酶 双乙酰是啤酒中的主要风味物质,在啤酒中的阈值很低, 当啤酒中双乙酰的浓度超过阈值时,就会产生一种不愉快的 馊酸味。双乙酰是由酵母繁殖时生成的 α-乙酰乳酸和 α- 乙酰羟基丁酸氧化脱羧而成的,当达到高峰值以后即逐渐消 减,其消减速度受到诸因素影响。一般在啤酒发酵后期还原双 乙酰需要约 5～10d的时间,因而双乙酰的形成与消除是啤酒 风味成熟的重要限速步骤,双乙酰含量是关系到啤酒发酵时 间以及风味的重要因素,是啤酒质量的重要标志之一。 收稿日期:2007-01-23 作者简介:何进武(1983—),男,江西人,在读硕士研究生。研究方向: 食品工程。 文章编号:1002-8110(2007)03-0057-04 第34卷 第3期 2007年 5月 酿 酒 LIQUOR MAKING Vol.34.№.3 May,2007 · 57· 如果在生产中加入 α-乙酰乳酸脱羧酶能催化 α-乙 酰乳酸直接形成羧基丁酮,可缩短发酵周期,减少双乙酰含 量。 现在随着对酵母形成双乙酰机理及其分子遗传学的逐渐 了解,通过基因工程的手段修饰异亮氨酸 -缬氨酸生物合成 途径,从而降低双乙酰的形成成为可能[18]。张吉娜等人用来源 于啤酒酵母 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(GSH1)和铜抗性 基因 (CUP1)取代质粒 PLZ-2中 α-乙酰乳酸合成酶基因 (ILV2)内部约 213kb的 DNA片段,构建成重组质粒 pICG。限 制酶酶切质粒 pICG后获得在基因 GSH1和 CUP1两端含有 ILV2序列的 610kb的 DNA片段。用此片段转化啤酒酵母 YSF31,得到铜抗性高的转化子。并通过 PCR和 α-乙酰乳 酸合成酶(AHAS)活性测定筛选到酵母工程菌。小试实验结果 表明酵母工程菌谷胱甘肽含量比受体高 34%,而双乙酰含量 是受体的75%。其它发酵指标并没有发生改变。中试实验表 明酵母工程菌发酵周期缩短 3d,而且成品啤酒的保鲜时间延 长50%[19]。李艳等人利用PCR技术以啤酒酵母 QY的染色体 为模板扩增出含有乙酰羟酸合成酶(AHAS)基 ILV2的片段,将 ILV2基因的内部EcoRI片段连接到整合载YIp5上,并在该载 体的 BamHI-SalI位点插入铜抗性基因 CUP1-MT1,构建了 YIpCE质粒,将其转化啤酒酵母 QY,所得到的转化子 AHAS 酶的活力比受体菌 QY降低 75%左右,在发酵测试中,转化了 产生双乙酰的量比原始菌株降低30%[20]。 1.3蛋白酶和葡萄糖氧化酶 啤酒稳定性是指啤酒保质、保鲜的能力。也就是在保质期 内不会发生混浊,不产生杂味,保持口味纯正的能力。啤酒不 稳定大致可分为生物混浊和非生物混浊两种。非生物混浊在 啤酒混浊是主要的,而非生物混浊中蛋白质引起的混浊又是 主要的,约占90%以上。 解决非生物混浊可以添加酸性蛋白酶和葡萄糖氧化酶。 木瓜蛋白酶(啤清)[21]或菠萝蛋白酶分解啤酒中的蛋白质。葡萄 糖氧化酶的主要作用是除去啤酒中的溶解氧,阻止啤酒因为 氧化而变质,并阻止啤酒老化味产生。加了该酶后,其除氧效 果好、速度快、无异味,这对于提高啤酒稳定性,保持啤酒原有 风味有很好的效果。 1.4 其它酶 用于啤酒生产的酶还有普鲁兰酶、酸性木聚糖酶、β-葡 聚糖酶、纤维素酶、α-葡萄糖苷酶等。普鲁兰酶的主要作用 是切割淀粉支链,增加出糖,酸性木聚糖酶[22]和 β-葡聚糖酶 [7]则可以改善麦汁过滤速度。纤维素酶可以减少啤酒中双乙酰 含量,增加出糖,提高出酒率[7,23,24]。沈金龙等人用选育得到的 纤维素酶对玉米叶和杨树叶水解,水解糖化率分别达到 86.2%和56.0%。通过酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)将糖 化液转化为酒精,产乙醇浓度达到 5%～5.8%,转化率为 79.4%～92.1%[18]。α-葡萄糖苷酶,又称 α-D-葡萄糖苷水解 酶、D-葡萄糖基转移酶等。在糖化工段加入 α-葡萄糖苷酶, 可生产低醇保健啤酒,改善啤酒口感;在发酵工段添加 α-葡 萄糖苷酶,可生产低糖超级发酵度的清爽啤酒。添加 α-葡萄 糖苷酶生产出来的啤酒富含低聚异麦芽糖(双歧因子),酒精含 量达到国家低醇啤酒的,其他理化指标也完全符合啤酒 国家标准[25]。 2 白酒和黄酒工业中的应用 白酒和黄酒产业是我国的一大传统民族工业,多年来为 我国的国民经济发展作出了较大贡献,如何面对我国已加入 WTO的现实,实现传统产业的提升和进一步发展,是摆在全 行业面前的大课题。现代的白酒和黄酒的生产,既要保持原酒 的风味特色,又要提高出酒率、简化操作,这就要求传统生产 工艺和现代技术相结合。目前,酶在这两种酒的生产应用中已 经很广泛。 酿酒工业中广泛应用的酶主要是糖化酶、液化酶、纤维素 酶、蛋白酶、酯化酶等,具有酶活力强、用量少、使用方便等优 点,适量添加可提高出酒率和品质[26]。糖化酶、液化酶是白酒黄 酒酿造中主要用酶,目前流行的生料酿酒[26,27]和液化法黄酒酿 造[28-31]也主要是利用这两种酶直接将淀粉液化糊化糖化来代 替蒸煮作用的原理,而通过酶的固定化技术将它们固定在载 体上,效果更好,也是当前研究的热点[32]。下面主要介绍其它 几种酶的应用。 2.1酸性蛋白酶 酸性蛋白酶是一种在酸性环境下 (pH2.5～4.0)催化水解 动植物蛋白质的酶制剂。在生产中添加可以增加料液中的 α-氨基酸[7],从而提高出酒率;改善风味;降低杂醇油含量(酵 母繁殖过程减少了从糖代谢过程中间体酮酸生成高级醇的数 量)[33,34,36]。酿酒原料中的淀粉,对液化型淀粉酶有吸附作用。被 淀粉吸附的液化型淀粉酶活性,则被削弱或失去应有的液化 作用。这对酿酒的出酒率上极为不利。但曲中的酸性蛋白酶, 可使被淀粉吸附的液化型淀粉酶,从淀粉上解脱出来,重新起 到液化作用。酸性蛋白酶及淀粉酶的综合作用结果,最终使糖 化力大幅度提高[35,36]。 李兰在对酸性蛋白酶在生料酿酒的应用研究中发现,在 生料酒曲中添加 2%～3%的酸性蛋白酶,以大米、玉米、高粱 等淀粉质原料为主的生料酿酒生产中,能提高原料出酒率 1.84%～2.68%,缩短发酵时间 1～2d,提高设备利用率 20%, 降低生料酒中杂醇油的含量,改善酒质[36]。 2.2酯化酶 酯化酶工程技术是 20世纪 80、90年代发展起来的一项 应用于传统工艺白酒的新技术,它与“强化大曲”、“人工老窖” 并称为三大生物工程技术[37]。酯化酶的理论基础为酶在有机 融剂中作用,将酸与醇酶促合成酸酯。该酶具有多项合成功 能,在受控制同时合成己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙 酯等酯类物质。浓香型白酒含有种类繁多的香味物质,其中主 要以己酸乙酯的含量及其他酯类物质的比例关系而决定酒质 的优劣。酯化酶可以应用于黄浆水酯化液及窖外生物合成酯 化液的生产、强化大曲生产、双轮底酒醅强化产酯等方面;其 生物合成酯化液可以应用于发酵酒提香、调味酒的制备、串香 生产及直接勾兑等方面;生产高酯液可人为控制,摆脱了传统 工艺的束缚,获得高酯调酒液,并可根据反应基质的不同而合 第三期 2007酿 酒 · 58· 成所需要的酯类[38-40]。 程江红等人将红曲霉菌中得到的酯化力220mg/(g·100h) 的酯化红曲应用于酿酒,明显提高了成品酒的总酯及己酸乙 酯含量,生产的成品酒窖香纯正浓郁、酒体醇厚爽净,回味悠 长[41]。 2.3酸性木聚糖酶 木聚糖酶(1,4-β-D-xylanxylanohydrolase,EC3.2.1.8)为一 类以内切方式水解木聚糖分子中 β-1,4-木糖苷键的酶,其水 解产物主要为木二糖与木二糖以上的低聚木糖,也有少量木 糖和阿拉伯糖。木聚糖酶在造纸工业、酿造工业、饲料工业和 食品工业有广泛的用途。 酸性木聚糖酶已经试用于日本大麦烧酒和清酒的酿造 中,并且取得了较好的效果。日本研究人员发现木聚糖酶 C 有助于提高大麦烧酒发酵效率,增加酒精的产率,原因在于木 聚糖酶对大麦细胞壁中木聚糖的分解有助于加快淀粉酶的作 用[42]。曹钰等人将不同的酸性木聚糖酶应用于日本清酒酿造 中,结果发现米曲霉 RIB128产生的木聚糖酶 B有助于加快 发酵速度,提高酒精产率,发酵结束后清酒的几项主要指标也 都正常[43],但是白曲霉木聚糖酶 C和华根霉木聚糖酶 R在清 酒酿造中的作用则不太明显[44],这种差别很可能是由于木聚 糖酶的水解底物特异性造成的。 3酶工程在酿酒工业中的应用发展趋势 随着科技的进步,酶工程在酿酒工业中的作用越来越大, 在很大程度上解决了传统酿酒工业的高能耗,低产出问题,降 低了生产成本。但是目前,在酿酒工业中,各种酶、酵母大部分 是分开使用,既增加了成本,又使工艺复杂化。未来酶在酿酒 工业中的应用应该从下面两个方向发展:(1)利用酶的固定化 技术发展复合酶,实现酶的重复利用、产物与酶的分离及生产 工艺的简化[32]。(2)利用基因工程改良酿酒酵母可提高其生产 性能。基因改良酿酒酵母的研究和应用有:①增加酿酒酵母发 酵性能的基因改良,如:构建含 α-乙酰乳酸脱羧酶基因的低 双乙酰工程酵母;含乙醇乙酰酶基因的高生香工程酵母;含糖 化酶、葡聚糖酶等基因的高发酵度工程酵母;高絮凝性工程酵 母和嗜杀酵母。②增强或缺失酵母自身基因的菌种改良,如构 建高级醇低生成量的工程酵母和构建双乙酰低生成量的工程 酵母[45]。 4结束语 虽然酶工程和酶制剂在酿酒中的应用已经很广泛,但是 酶制剂的生产主要是欧美几家公司,如 NOVO、杰能科两家公 司就占有全球 75%的份额。国内的技术相对落后,国内酒类 企业需要大量进口酶制剂,这也限制了行业的发展。因此,必 须加大投入和研发力度,产学研相结合来带动整个行业的发 展。 [参考文献] [1]G.G.Birch,N.Blakcbroughetal.Enzymesandfoodprocessing[M]. 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ApplicationofEnzymeEngineeringinWineIndustry HEJin-wu,HUANGHui-hua (CollegeofLightIndustryandFoodSciences,SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong510640,China) Abstract:Theapplicationanddevelopmenttrendofenzymeengineeringinwineindustrywerereviewedinthispaper. Keywords:Enzymeengineering;Beer;Spirit;Yellowwine;Application 文章编号:1002-8110(2007)03-0060-03 !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! 第34卷 第3期 2007年 5月 酿 酒 LIQUOR MAKING Vol.34.№.3 May,2007 · 60·