4--目的基因的获取

null第四章 目的基因的获取第四章 目的基因的获取目的基因：准备要分离、改造、扩增或达的基因。目的基因获得方法：化学合成、构建文库、PCR扩增第一节 化学合成目的基因1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。第一节 化学合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法自动化合成法。1. 磷酸二酯法① 保护dNTP的5’端P 或3’端-OH③ 用酸或碱的脱保护（1）原理1. 磷酸二酯法② 带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。带5’保护的单核苷酸与带3’保护的另一个单核苷酸以磷酸二酯键连接起来。（2）合成过程（2）合成过程下一个5’端保护的单核苷酸又可以同3’端保护的二核苷酸聚合。二、 化学合成DNA片断的组装化学合成的DNA片断一般在200bp以内。 二、 化学合成DNA片断的组装用T4多核苷酸激酶使各个片段的5’端带上磷酸。1. 互补连接法预先设计合成的片断之间都有互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有断点的完整双链。（2）5’端磷酸化（1）互补配对（合成的DNA单链的5’端是-OH）（3）连接酶连成完整双链T4 DNA连接酶T4多核苷酸激酶使5’-OH磷酸化完整的DNA双链（3）连接酶连成完整双链2. 互补延伸连接法2. 互补延伸连接法预先设计的片断之间有局部互补区，可以相互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶延伸成完整的双链。3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ T4DNA连接酶Klenow片段引物三、 寡聚核苷酸化学合成的用途1. 直接合成基因三、 寡聚核苷酸化学合成的用途2. 合成引物（20mer左右）（1）mRNA的含量很低，很难作cDNA 3. 合成探针序列4. 定点突变合成合成带有定点突变的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪DNA合成仪5. 合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点人工接头（Adaptor）或衔接物（Linker）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor第二节 基因组文库和cDNA文库 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。一、基因文库的构建1. 基因文库（gene library）第二节 基因组文库和cDNA文库null2、 基因组DNA片断化（1）限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组DNA切成不同大小的片断。酶切2、 基因组DNA片断化 优点由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。 优点缺点目的基因内部也可能有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene（2）机械切割法（2）机械切割法超声波超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片断。高速搅拌1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片断。3. 构建基因文库的载体选用（2）目前常用的载体 3. 构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。（1）对载体的要求载体系列： 容量为 24 kp cosmid载体： 容量为 50 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb4. 基因文库构建的一般步骤断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体DNA大片段的制备4. 基因文库构建的一般步骤超声波（300bp）或机械搅拌（8kb）。 ① 物理切割法：内切酶Sau3A进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。② 酶切法：（2）载体与基因组DNA大片段的连接（2）载体与基因组DNA大片段的连接① 粘性末端直接连接载体与外源DNA大片段的两个末端都有相同的粘性末端。如：Sau3A与BamHI的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。②人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。null各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶粘性末端③ 同聚物加尾（3）重组载体导入受体细胞（3）重组载体导入受体细胞5. 基因组文库的大小5. 基因组文库的大小一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1-f)p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%）f: 插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因 组DNA的百分数N：所需的重组载体数（克隆数）null例如：人的基因组是 3×109 bp，插入DNA片断的平均长度如果是1.7×104 bpN=ln (1-p)ln (1-f)=ln (1-99%)ln (1-f)=4.61×GfN=4.61×GfG：Genome大小；f：fragment大小N=4.61×Gf=4.61×3×1091.7×104= 8.1×105二、 cDNA文库的构建1. cDNA以mRNA为逆转录出的DNA称cDNA。2. cDNA library二、 cDNA文库的构建mRNAcDNA3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶引物利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称cDNA文库。4. 构建cDNA文库的一般步骤（1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，容易构建。4. 构建cDNA文库的一般步骤（1）总RNA（total RNA）提取3. cDNA文库的特点提取总RNA有商业化的试剂盒（kit）。（2）mRNA的分离纯化分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱。 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。 mRNA只占总RNA的1%-2%。（2）mRNA的分离纯化① 原理② mRNA的分离纯化Column（柱）null（3）cDNA的合成反转录酶（3）cDNA的合成① cDNA第一链合成逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 mRNAcDNA3’ 5’ 5’ AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物② 降解mRNA模板用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’ 3’ 5’ 5’ 引物cDNA第一链3’ 5’ 引物② 降解mRNA模板或RNaseH碱③ cDNA第二链合成剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。cDNA第一链5’ cDNA第二链合成DNA聚合酶cDNA第一链cDNA第二链5’ 3’ ③ cDNA第二链合成④去掉发卡结构④去掉发卡结构核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一链cDNA第二链5’ 3’ cDNA第一链cDNA第二链5’ 3’ 5’ 3’ null妙用RNaseH这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。妙用RNaseH小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。nullmRNAcDNA3’ 5’ 反转录酶引物mRNAcDNA第一链3’ 5’ 引物mRNAcDNA第一链3’ 5’ mRNAmRNADNA 聚合酶DNA 聚合酶cDNA第二链cDNA第一链3’ 5’ RNaseHDNA ligase去引物null5.cDNA与载体连接：在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。5.cDNA与载体连接：接上人工接头粘性末端CCCCCC末端转移酶null6. cDNA文库的大小6. cDNA文库的大小一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。N=ln (1-p)ln (1- )p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%）: 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例N：所需的重组载体数（克隆数）1n1n三、文库的查询（screening）三、文库的查询（screening）用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。文库载体探针电泳后杂交放射自显影测序分析第三节 PCR分离和扩增目的基因1. 直接从基因组中扩增（1）提取基因组DNA作模板（2）根据目的基因序列设计引物（3）PCR扩增真核生物基因组含有内含子！适合扩增原核生物基因。第三节 PCR分离和扩增目的基因null原核基因组部分原核细胞提取基因组DNAPCR扩增2. 从mRNA中扩增: RT-PCR（1）提取基因组 total RNA（2）反转录合成总cDNA作模板（4）PCR扩增（3）根据目的基因序列设计引物2. 从mRNA中扩增: RT-PCR原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾。适合扩增真核生物基因。null纤 维 柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNATotal mRNA纤 维 柱探针DNA探针DNA探针DNA探针DNA过柱与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。特异mRNA洗脱RT-PCRnull目的基因 的引物1反转录成目的基因cDNA第一链目的基因 的引物2目的 基因cDNA第二链PCRmRNA克隆外源基因克隆外源基因