5--基因的重组与转移

null第五章 基因的重组与转移 外源DNA载体DNA重组分子原核细胞真核细胞扩增或表达表达连接转化或转导电穿孔或显微注射受体细胞第五章 基因的重组与转移 第一节 DNA片段的体外连接一、粘性末端的连接DNA连接酶把相互靠近的5’端磷酸与3’-OH连到一起。第一节 DNA片段的体外连接nullnullligasenick二、齐平末端（blunt end）的连接二、齐平末端（blunt end）的连接1. 直接连接T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。 5’端与3’端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。而且目的DNA再切不下来5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5’ 3’ -OH-PP-HO-5’ 3’ 2. 人工加尾形成 “粘性末端” 1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。（1）同聚加尾 法 2. 人工加尾形成 “粘性末端” DNA末端转移酶能在没有的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。①原理：分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。②加尾—碱基互补null④缺点：③优点：能把任何片段连接起来不能把插入片段再切下来。非酶切位点（2）衔接物(linker)连接用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。（2）衔接物(linker)连接① linker用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。GGAATTCC CCTTAAGGEcoRI linker：② linker的作用 ③优点：④缺点：1）可以用内切酶把插入片段切下来。如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段2）能给载体连接上Polylinker:③优点：1. 与T载体直接连接1. 与T载体直接连接（1）PCR产物两个3’端一般都有一个ATaq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3’端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。（2）T载体的两个3’端人为地各加一个T利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！三、PCR产物的连接nullAAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶载体PCR产物TATAnull2. 在引物的5’端酶切位点符合载体的多克隆位点；（1）设计原则（2）带酶切位点的引物的结构3’端15~20bp与模板互补； 5’端6~10bp是某个内切酶的识别序列。（5’端多余的3~5bp属保护碱基）避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。引物1引物1GCAGAATTC 互补序列模板EcoRI位点5’--3’ GCAGAATTC 互补序列5’--3’ 3’ 模板GCAGAATTC 互补序列 PCR产物5’--3’ 3’ 复性延伸模板模板3’ 3’ 引物2GCTAGCCGG 互补序列模板BamH I 位点-5’ 3-’ 5’ 复性延伸模板模板3’ 3’ GCTAGCCGG 互补序列-5’ 3’-模板5’ GCTAGCCGG PCR产物 互补序列-5’ 3’-引物2带酶切位点的PCR产物带酶切位点的PCR产物GCAGAATTC PCR产物5’--3’ GCTAGCCGG PCR产物-5’ 3’-CGTCTTAAGCGATCGGCCEcoRI位点BamHI位点AATTC PCR产物5’--3’ GCTAG PCR产物-5’ 3’-GCEcoRIBamHI两头各有一个粘性末端！四、DNA体外连接应注意的事项四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。（1）用相同的酶切EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。2. DNA插入的方向正确2. DNA插入的方向正确（1）用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTC T重组但移码突变！4. 防止载体自身环化连接4. 防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’ 3’ 载体插入片断五、载体和外源DNA插入片段的连接结果1. 载体自身环化连接（能存活）2. 载体之间互相连接（能存活）3. 插入片段互相连接（不能存活）4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活）null17第二节 重组体导入细菌细胞（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第二节 重组体导入细菌细胞外源基因导入细胞的方法外源基因导入细胞的方法18null1. 目的增加受体菌细胞膜的通透性。感受态大肠杆菌的制备一、转化（transformation)2. 菌种使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2. 菌种null3. 制备原理用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3. 制备原理4. 制备过程4. 制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4On ice 5-10 min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70 ℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬On ice 30 min用冰冷的60mMCaCl2重悬感受态细胞 （competent cells) ①生长状态制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。②必须在冰冷的条件下制备。要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。④储存感受态菌要在-70℃以下③CaCl2处理⑤使用感受态菌时必须迅速融化融化后一般不能再次冻存使用。感受态细胞 （competent cells) 转化率每gDNA转化成功的细菌克隆数。 转化方法 转化率简单，但转化效率不高（106-108/gDNA）。（1）热休克法（heat shock）转化效率高（高于109/gDNA）。（2）电转化法（1）热休克法10ng载体DNA100L感受态菌 On ice混合，静置10分钟42ºC 1分钟加入1mL LB培养基37℃摇1小时10-100L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DNA（1）热休克法（2）电转化法LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6冰浴15分钟，2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心集菌冰冷的水重悬菌体2°C离心收集菌体少量冰冷的水重悬分装成 50-300L 电转仪调为2.5kV,25F 脉冲控制器200-400 0.5g质粒DNA On ice混合加入1mLSOC培养液37°C中速震荡60分钟10-100L转化液涂含抗菌素的平板转化（2）电转化法4. 平板培养基培养细菌4. 平板培养基培养细菌10-100L转化液涂于含抗菌素的平板37℃过夜二、体外包装的噬菌体的转导把重组的噬菌体DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。二、体外包装的噬菌体的转导（1）体外包装（in vitro packaging） （2）转导（transduction）通过受体菌细胞表面的DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。（3）cI857基因突变的噬菌体 cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养细菌时能够保持溶源性。 但当温度升高到44℃—45℃时，就会导致cI基因编码的阻遏蛋白失活，DNA复制、外壳蛋白合成。便于提取外壳蛋白。（3）cI857基因突变的噬菌体 但由于该噬菌体的S基因上有一个突变，所以细菌还不裂解。nullcI857其它基因溶源状态（DNA不转录、不翻译）DNA阻遏 蛋白阻遏 蛋白44℃—45℃DNA转录、翻译合成外壳蛋白32℃（4） 互补型噬菌体 噬菌体1外壳蛋白基因E发生了无义突变，不能合成头部蛋白，但能合成其它外壳蛋白（尾部蛋白）。在cI857基因突变的噬菌体的基础上，选择两种外壳蛋白的突变型噬菌体。 （4） 互补型噬菌体 外壳蛋白基因D发生了无义突变，不能合成头部的包装识别蛋白，但能合成其它外壳蛋白（头部、尾部蛋白）。噬菌体2(5) 体外包装过程 (5) 体外包装过程 （6） 转导 体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，使受体菌发生溶菌，形成噬菌斑。（每g DNA能形成106噬菌斑）。 （6） 转导