分子生物学技术在肠道正常菌群研究中的应用

·综述· 分子生物学技术在肠道正常菌群研究中的应用 楼金　 (综述) 　陈洁 (审校) (浙江大学医学院附属儿童医院消化科 ,杭州 310003) 　　作者简介 :楼金　 (19762) ,男 ,浙江东阳人 ,在读硕士研究生 ,从事 小儿消化专业研究工作 　　【摘要】　对肠道正常菌群的研究方法主要有传统的微生物学方法和分子生物学方法。近几年来大量的 分子生物学技术应用于肠道菌群的研究 ,取得了很大的进展 ,这些方法具有快速、方便、全面等优点。本文就 16S rRNA、16S～23S rRNA 基因区间、随机扩增多态性 DNA、变性梯度凝胶电泳、荧光原位杂交法、脉冲场凝胶 电泳等技术在肠道菌群研究中的应用进展作一综述。 　　【关键词】　细菌 ,厌氧 ; 　DNA ,核糖体 ; 　聚合酶链反应 ; 　分子生物学 　　【中图分类号】　R378 　　　【文献标识码】　A 　 　　【文章编号】　100123512 (2004) 0120001204 　　正常菌群在人体内分布很广 ,其中以肠道菌群最 具有代性。在人体微生态的研究中肠道菌群的研 究最有成效。目前对健康人的大便标本的研究中已 知肠道内栖息着大约 1 014个细菌 ,是人体细胞总数的 10～20 倍 ,约 400～500 种。其中 90 %～9919 %是厌氧 菌。大量的研究结果表明 ,肠道内的细菌对人体的生 长发育、免疫功能、营养、发病机制及健康等起着重要 的作用。肠道内细菌的分离、鉴定和定量对于研究肠 道内菌群的功能以及与机体的相互关系非常重要。 传统方法主要是通过微生物的选择性培养 ,再进 行鉴定和分类。培养技术只能定量检测可培养的细 菌 ,不能鉴定未知的细菌 ,低估了正常菌群的数量和 多样性 ,同时不能阐明肠道微生物之间或与宿主的相 互关系。而且 ,培养方法费时、费力 ,易受操作方法的 影响。近年来大量的分子生物学技术应用于肠道微 生态的研究 ,使我们对肠道微生物有了更完整的评 价 ,对肠道中不能培养的细菌的研究在增加。 1 　16S rRNA及其基因 16S rDNA的研究 近几年来国内外学者采用各种分子生物学方法 对细菌的 16S rRNA 进行研究 ,得到了广泛的细菌 16S rRNA 序列库。利用 16S rDNA 可以检测肠道中不能培 养或生长缓慢的细菌。普遍存在的 rDNA 序列分析已 经成为分类和检测细菌、评价种系关系的一个理想的 工具。 111 　聚合酶链反应法 　Suau 等[1 ]用针对 16S rRNA 的 细菌域通用引物 ,采用聚合酶链反应 ( PCR) 法特异性 扩增粪便标本的 DNA ,得到 284 个平均长度 500bp 的 16S rDNA 片段。对这些片段进行测序和种系分析发 现 ,284 个 16S rDNA 片段对应于 82 个分子菌种 ,其中 95 %的片段对应于三类细菌 :类杆菌、球形梭菌、柔嫩 梭菌。只有 24 %的克隆与目前已知能培养的细菌相 对应 ,而将近 76 %的扩增得到的 rDNA 序列与已知的 细菌不一致 ,可能是肠道中迄今为止未知的细菌。因 此 ,他认为 ,直接对粪便标本分析 16S rDNA 可以发现 许多肠道中新的菌种 ,并且由此获得的肠道菌群的分 子多态性为进一步分析不同年龄、饮食、胃肠道疾病 和不同区域的人群的肠道菌群多样性提供了基础和比 较框架。 112 　变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳 　变性 梯度凝胶电泳 (DGGE) 是一个遗传指纹技术。首先从 胃肠道标本中提取 DNA ,再用通用引物 PCR 法扩增 16S rDNA。扩增产物包含了这个标本中存在的所有细 菌的 16S rDNA 片段。不同细菌的 16S rDNA 片段通过 DGGE凝胶时 ,可以在不同的尿素和甲酰胺浓度梯度 的聚丙烯酰胺凝胶中发生部分变性 ,迁移速度明显下 降 ,从而加以分离。16S rDNA 片段的分离产生了一个 细菌群体的图谱 ,每一个 DNA 片段类型代表一个菌 种[2 ] 。温度梯度凝胶电泳 (TGGE) 与 DGGE 机制相同 , 不同的是凝胶中所采用的不是尿素和甲酰胺浓度梯 度而是温度梯度。DGGE 凝胶电泳与 16S rRNA 探针 结合鉴定特异性的种、属、域。有用的 PCR 产物可以 洗脱下来 ,再扩增进行序列分析。 113 　DNA2RNA 杂交 　DNA2RNA 杂交法可以计算肠 道中特殊菌群的比例。这种方法从标本中提取细菌 RNA ,在膜上与一系列放射性标记的寡核苷酸探针 (每 一个探针代表一个特殊的菌群) 进行斑点杂交。以通 用探针为对照 ,根据杂交程度来判断细菌所占的比 例。Sghir 等[3 ]在 27 个人的研究中 ,6 个寡核苷酸探针 可以检测占 70 %的通用探针检测到的 16S rRNA ,其中 类杆菌2普氏杆菌2卟啉单胞菌占 37 % ,球形梭菌占 ·1·国外医学儿科学分册 2004 年 1 月第 31 卷第 1 期　Foreign Medical Sciences Section of Pediatrics ,January 2004 ,Vol . 31 ,No. 1 16 % ,柔嫩梭菌占 14 % ,乳酸杆菌2链球菌2肠球菌、双 歧杆菌、肠杆菌各占 1 %。在 DNA2RNA 杂交法的应用 中 ,寡核苷酸探针只能从已知的细菌中获得 ,因此 ,该 方法首先应对细菌进行种系分析或 16S rDNA 序列分 析。 114 　寡核苷酸微距阵法 　寡核苷酸微距阵技术 (oligonucleotide microarray)可以在一个载玻片上同时检 测多个甚至数十个基因或目标 DNA ,它主要应用于基 因的研究。Wang 等[4 ]将其应用于粪便标本中细菌的 检测。他们根据 20 种肠道菌种的 16S rDNA 序列设计 了 60 个探针 ,置于载玻片上的微距阵中 ,制备了寡核 苷酸微距阵玻片。用通用引物从粪便标本中扩增花 青苷 5 (cyanine 5)标记的 16S rDNA ,根据扩增产物与微 距阵中的探针杂交程度的不同 ,显示的颜色亦不同 , 没有杂交的距阵则不显示。通过该方法所得到的肠 道菌群数据与以前通过其他方法得到的数据一致。 Wang 等[5 ]依据同样的微距阵原理 ,用硝酸纤维素薄膜 距阵代替昂贵的微距阵设备 ,同样取得很好效果。 115 　扩增核糖体 DNA 限制性分析 　对 rDNA 扩增产 物用限制性内切酶进行酶切 ,根据酶切后不同的片段 分析 ,对不同的菌株进行鉴别。Veatura 等[6 ]用两个限 制性内切酶对 106 株 16 种不同的双歧杆菌菌种的 16S rDNA 进行酶切 ,鉴定结果与特异性引物 PCR 扩增的 结果一致 ,认为扩增核糖体 DNA 限制性分析是一个快 速、敏感、容易控制的鉴定双歧杆菌的有效方法。 116 　其他 11611 　荧光原位杂交法 　荧光原位杂交法 ( FISH) 是 采用免疫荧光标记的的寡核苷酸探针与目标检测物 进行原位杂交 ,计算杂交率来定量检测和鉴定细菌。 FISH优先检测活的有足够靶分子的细菌 ,对数量上占 优势的细菌最适合。与 PCR 方法相比 ,它不需要选择 性纯化或扩增步骤 ,可以提供一个更详细的微生物图 谱。Franks 等[7 ]设计了少部分能识别大部分种系免疫 荧光标记的寡核苷酸探针 ,与 16S rRNA 序列相结合。 结果这些探针能检测到大约 2/ 3 的大便标本中的细 菌。在检测到的细菌中 ,类杆菌、梭菌、直肠真杆菌等 占了将近一半。Moter 等[8 ]认为 FISH的结果很容易出 现假阴性和假阳性结果。由于部分微生物可以发出 自免疫荧光 ,出现假阳性结果。免疫荧光探针不易进 入到细菌内、靶目标或探针的空间结构复杂 ,可出现 假阴性。如果细菌中 rRNA 含量过低 ,则检出率下降。 寡核苷酸探针通过不同细菌的细胞壁容易程度不一 致 ,结果会出现偏差。 11612 　脉冲场凝胶电泳技术 　脉冲场凝胶电泳技术 (PFGE)可以分离大小为 50～1 000 kb 的 DNA 片段 ,甚 至可以观察整个染色体 ,可用于分离细菌染色体等大 分子 DNA。PFGE已经成功的应用于分析不同细菌中 的染色体构成 ,同时结合特异性的酶切技术用于菌种 间或同一菌种不同菌株的鉴定。此外 ,它还可以为判 断基因组的大小和基因图谱的建立提供有用的资料。 O′Riordan 等[9 ]应用 PFGE结合限制性酶用于双歧杆菌 种间及菌株间的鉴定。他认为尽管 PFGE 技术费时费 力 ,但对很多菌属的菌株鉴别来讲它还是比核糖分型 技术、十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳、随机扩 增多态性 DNA(RAPD)等更有效。 11613 　重复细菌 DNA 元件的 PCR 扩增 　重复细菌 DNA 元件的 PCR(Rep2PCR)应用于乳酸杆菌的分类 (在 种、亚种、菌株的水平) 。Gevers 等[10]认为 Rep2PCR 扩增 是一个以 PCR 为基础的简单技术 ,它有以下特点 :有很 高的识别力、成本低、适用于优势菌株 ,是一个应用于分 类大量革兰氏阴性和阳性细菌的一个可靠工具。它是 一个快速、易于操作、可重复性好的工具 ,可以达到菌株 的水平。 11614 　三步任意引物 PCR 　任意引物 PCR (AP2PCR) 可以获得特征性的 DNA 片段 ,但只要反应条件的一点 小小改变 ,就会影响条带的产生 ,重复性差。Cusick 等[11 ]设计了三步任意引物 PCR ( TAP2PCR) ,用三个不 同的退火温度 ,同时应用于三步反应 ,使条带的鉴定 对温度变化敏感。认为 TAP2PCR 是一个简单、快速、 价廉的技术。 2 　16S～23S rRNA基因区间序列的研究 　　16S rRNA 的进化速度非常慢 ,基因序列保守 ,无 法区分种系非常接近的菌种或同一菌种的不同菌株。 而 16S～23S rDNA 区间序列的进化速度是 16S rRNA 的 10 倍 ,再加上 16S rRNA 端及 23S rRNA 端的高度保 守序列 ,使 16S～23S rDNA 区间序列成为鉴别细菌的 一个新的方法。Tannock 等[12 ]对 40 个乳酸杆菌菌株 16S～23S rRNA 基因区间进行 PCR 扩增和序列分析 , 并与基因库中的参考菌株进行对比 ,发现 9715 %或更 高的一致性。Tilsala2Timisjarvi 等[13 ]设计了两条引物 (1621A 和 2321B) ,特异性的扩增 16S～23S rRNA 基因 区间 ,成功的检测到类干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、德 氏乳杆菌等。 3 　转运 RNA基因 　　Bale 等[14 ]设计了针对转运 RNA 基因 (tDNA) 保守 区的引物 ,对 82 种乳酸杆菌菌株的 tDNA 区间进行 PCR 扩增 ,扩增产物进行毛细管电泳 ,发现 21 种菌株 可以在菌种水平上得到鉴定 ,其余的大致上可以分为 两组。该方法可以区分只有一个碱基对长短差异的 扩增片段 ,但敏感性较低。 ·2· 国外医学儿科学分册 2004 年 1 月第 31 卷第 1 期　Foreign Medical Sciences Section of Pediatrics ,January 2004 ,Vol . 31 ,No. 1 4 　功能性基因的研究 　　在肠道细菌的研究中 ,特异性 PCR 引物或探针主 要以 16S rRNA 基因序列为靶目标。然而在某些细菌 如双歧杆菌中 ,16S rRNA 序列高度保守 ,在每个染色 体中有多个 16S rRNA 基因的拷贝。这些特点影响了 根据 16S rRNA 核苷酸序列的鉴定和定量 PCR 方法的 结果[2 ] 。因此 ,国外学者用 PCR 法对某一基因序列分 析来检测和鉴定双歧杆菌。目前研究较多的是双歧 杆菌的转醛酶基因、乳酸脱氢酶基因和 recA 基因。双 歧杆菌产生至少 14 种转醛酶 (可以通过蛋白质电泳和 血清学方法鉴别) ,这提示转醛酶的异构体的氨基酸 序列不同 ,因此 ,转醛酶基因的核苷酸序列在菌种中 亦不同。Requena 等[15 ]用 ForTal、RevTal2GC 引物对双 歧杆菌转醛酶基因进行 PCR 扩增 ,再进行 DGGE ,结果 长双歧杆菌的两种亚型、假链状双歧杆菌的两种亚 型、青春双歧杆菌的五种亚型得以识别 ,显示出很高 的敏感性。Roy 等利用乳酸脱氢酶基因 , Kullen 等利 用 recA 基因对双歧杆菌进行鉴别 ,均取得了满意的结 果。然而在功能性基因的研究中 ,选取一个很好的可 以区分不同菌株的功能性基因很困难。 5 　RAPD 　　RAPD 应用随机设计的短的引物通过 PCR 方法获 取随机扩增 DNA 片段 ,菌种之间 DNA 的变异可以通 过 RAPD 片段大小和数量的不同加以区别。这个方法 是以整个细菌的 DNA 基因组为研究对象 ,因此具有很 高的敏感性和特异性 ,它可以对细菌在菌株的水平上 进行鉴别。Vincent 等[16 ]应用 RAPD 技术采用五个不 同单一引物反应对六种双歧杆菌进行区别。他们认 为与传统方法相比 , RAPD 技术有用且快速。Daud Khaled 等[17 ]在单一的反应中应用两个引物进行多重 RAPD对乳酸杆菌进行鉴别 ,其结果比单一的 RAPD 的结果重复性更高。Bouton 等[18 ]认为 RAPD 或 Rep2 PCR 分析的是扩增产物的序列和多态性 ,而 PFGE 基 于限制性酶多态性分析整个细菌的 DNA 染色体。因 此认为应用不同的分子技术对细菌的鉴定和分类会 产生不同的结果 ,如果结合应用 PCR 和 PFGE法 ,对菌 群的鉴别更有效。 PCR 技术的发展为微生态的发展开拓了崭新的 新局面。对细菌 rRNA 及 rDNA 的分析提供了一个区 别于传统的伯杰氏细菌分类系统的新的分类系统。 分子生物学技术已经广泛应用于世界上很多实验室 , 对肠道微生态的研究产生巨大的推动作用。但回顾 近 20 年来的发展 ,PCR 技术同样存在许多问题。von Wintzingerode 等[19 ]在 1997 年就对 rRNA 的 PCR 技术 应用中所存在的问题作一综述 ,他认为在 PCR 分析中 每一物理、化学、生物学的步骤均会引起误差 ,包括样 本的采集、细胞的裂解和核酸物质 ( RNA/ DNA) 的提 取、PCR 的扩增过程、16S rRNA 基因扩增产物的分离、 16S rRNA 基因序列分析均会引起结果的误差。因此 在肠道微生态的研究中 ,我们应该根据不同的研究对 象 ,采取不同的分子生物学方法或联合应用某两种或 几种方法 ,必要时可以结合应用传统的培养和生化鉴 定方法才可能对肠道微生态有一个更全面的了解。 参 　考 　文 　献 1 Suau A , Bonnet R , Sutren M , et al . 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FEMS Microbiol Rev ,1997 ,21(3) :2132229.(收稿日期 :2003208213)(本文编辑 :程晓秋) 感染性腹泻与肠道神经系统 黄祖雄1 (综述) 　叶礼燕2 (审校) (11 福建医科大学福州总医院临床医学院儿科 , 福州 350025 ;21 南京军区福州总医院儿科 ,福州 350025) 　　【摘要】　肠道液体的分泌和吸收受肠道神经系统 (enteric nervous system , ENS) 的调控。近年来研究表明 ENS参与感染性腹泻的病理生理过程。ENS可能通过肠壁内的神经反射或外来初级感觉神经的轴突反射 ,促 进肠道液体分泌。通过作用于肠道神经的某一位点来减少肠道液体分泌 ,将是止泻药物研究的新方向。 　　【关键词】　腹泻 ; 　肠神经系统 ; 　止泻药 　　【中图分类号】　R44212 　　　【文献标识码】　A 　　　【文章编号】　100123512 (2004) 0120004203 　　作者简介 :黄祖雄 (1978 - ) ,男 ,福建莆田人 ,在读硕士研究生 ,儿科 感染消化专业 　　感染性腹泻是婴幼儿常见病。大多数急性感染 性腹泻的死亡原因是液体丢失过多 ,导致脱水和酸中 毒。口服补液盐的问世大大降低了腹泻的病死率 ,口 服补液盐仍是目前的主要治疗手段 ,但这种方法并不 能减轻腹泻的病程和粪便量。因此 ,学者们一直致力 于研究抑制肠道分泌、促进水钠吸收的止泻药物。近 年来发现肠道神经系统 (enteric nervous system ,ENS) 参 与感染性腹泻的发生 ,通过作用于肠道神经某一位点来 减少肠道液体分泌 ,可能为止泻药物的研究指出新方 向。 1 　ENS 的调节作用 　　肠道液体的吸收和分泌受交感神经、副交感神经 和 ENS 的多重调控。ENS 是位于胃肠壁内的自主神 经系统 ,呈网状结构 ,大约含 108 个神经元 ,由肌间神 经丛和黏膜下神经丛组成 ,前者控制胃肠运动 ,后者 调节胃肠的分泌和吸收。ENS独立于大脑而行使其功 能 ,但同时受脑的调节 ,每 300 个神经元由一来自中枢 神经系统的交感、副交感传出纤维调控[1 ] 。ENS 含有 20 多种神经递质 ,其中乙酰胆碱、血管活性肠肽 (VIP) 和神经降压素等 ,可直接作用于肠细胞或间接作用于 其它黏膜下神经元 ,促进肠液体分泌 ;而脑啡肽、生长 抑素和神经肽 Y等递质则可能通过抑制神经元活性 , 起到抗分泌或促进肠的水钠吸收作用。这些递质间 构成相互协同、相互拮抗的复杂网络 ,使肠道的水、电 解质吸收代谢处于相对平衡状态[2 ] 。另外 , ENS 还可 与邻近的免疫细胞相互作用 ,通过释放一些神经递质 (如 VIP、生长抑素等) ,影响炎症反应的发生 ;而免疫 细胞也可通过旁分泌形式释放介质 ,影响 ENS 对肠道 液体分泌的调节[3 ]。交感神经则可通过释放去甲肾上 腺素 ,作用于 ENS ,抑制 VIP 能和胆碱能分泌运动神经 元 ,减少肠腔液体分泌 ;副交感神经在肠液体分泌吸收 中的作用尚不清楚。 2 　感染性腹泻与 ENS 　　传统观点认为霍乱毒素 (CT) 通过环磷酸腺苷途 径直接作用于隐窝细胞 ,刺激 Cl - 的分泌 ,并抑制肠绒 毛上皮对 Na + 、Cl - 的吸收 ,导致液体在肠腔累积过多 超过结肠的吸收能力。但这主要是来自体外实验 (如 离体肠段试验)的结果 ,不能完全解释 CT 所致的大量 水样便。Lundgren 等[4 ]在研究 CT致腹泻作用时 ,最早 发现 ENS参与腹泻的发生。他认为肠绒毛突向肠腔 , 与内容物密切接触 ,而隐窝细胞则位于深处 ,并不易 直接与肠腔内容物接触 ,因此局部的微环境可直接影 响绒毛对 Na + 、Cl - 的吸收过程 ,但隐窝细胞的局部控 制更可能有赖于间接的作用机制 (如 ENS 作用) 。利 用经标记的 CT研究发现 ,CT 并不与肠腔的隐窝细胞 直接接触 ,提示确实存在另外一种机制刺激隐窝细胞 的 Cl - 分泌。 　　大量体内试验[4 ,5 ]证实 ,CT 除了直接作用于肠细 胞 ,还可能激活 ENS后继发隐窝细胞的过度分泌。研 究发现神经毒素、河豚毒素、六季双铵和利多卡因等 神经阻滞剂可抑制 CT 所诱导的小肠液体分泌 ;利用 苯扎氯铵破坏肠肌间神经丛后 ,CT便无法引起此段小 肠的分泌反应 ;CT 引发的腹泻还常伴有 52羟色胺 (52 HT) 、VIP 和神经降压素等胃肠神经肽的增加 ;CT作用 于肠黏膜后 ,可使肌间和黏膜下神经丛 fos 原癌产物 表达增加 ,后者是神经活动的可靠标志。毫无疑问 , ENS参与了霍乱的发生。Lundgren 等的前驱工作使人 ·4· 国外医学儿科学分册 2004 年 1 月第 31 卷第 1 期　Foreign Medical Sciences Section of Pediatrics ,January 2004 ,Vol . 31 ,No. 1