人肠道微生态系统的研究进展

人肠道微生态系统的研究进展 金红芝　李堃宝　(上海交通大学生命科学技术学院) 关键词　微生态系统　肠道菌群　分子生物技术 　　简述了人胃肠道菌群的组成、分布、影响因素以及肠道菌群的生理功能. 着重介绍了近几年来分子生物学技术 ( 例如 :16S rRNA 基因的聚合酶链式反应、变性梯度凝胶电泳、脉冲场凝胶电泳、限制性片段长度多态性、荧光原位杂 交等) 在肠道微生态学研究中的应用进展. 　　人的胃肠道栖息着大约 30 属 500 多种细菌[1 ] ,可以 分为生理性细菌、条件致病菌、病原菌. 肠道菌群保持共 生或拮抗关系 ,与人的健康及疾病有密切关系. 这些微 生物群落分别对宿主及环境产生物质流、能量流及基因 流 ,同时它们也受宿主遗传性的控制 ,从而构成了宿主 小生境特定的微生态系统. 这些菌群在人体内构成微生 态平衡 ,与宿主间有着相对稳定的作用 ,对人体是有益 的. 当这些正常的微生物群落受宿主及外环境影响 ,其 种群数和菌量、活性发生了异常或定位转移时 ,这些群 落中就容易容纳外籍菌 ,原先的平衡遭到破坏 ,出现菌 群失调 ,使宿主致病. 肠道菌群随着人生长发育、营养变 化、生育和年龄增长而发生生理性演替[2 ] . 研究人体肠 道中的基本微生态规律是纠正菌群失调、增强体质、提 高健康水平、发展相应微生态制剂的必要的理论基础. 　　随着近几年来分子微生态学技术的进步 ,人们对肠 道微生物菌群的结构与特性有了全新的认识. 研究发 现 ,肠道菌群中 ,在光学显微镜下可直接观测到的细菌 总数中有 40 %～80 %[3 ]是不能通过常规微生物学的实 验方法培养出来的 ,只有通过分子生态学的方法测定它 们的存在. 在这些迄今无法培养的细菌中 ,有些种类如 梭状芽胞杆菌属中的 Segmeneted filamentous actria 在动物 和人体的免疫系统成熟方面起着非常重要的作用 ;在鸡 的小肠内也发现了一种巨大的细菌 ,这种细菌和肠黏膜 的上皮分泌细胞紧密相粘 ,明其与上皮细胞是一种共 生的关系[4 ] . 分子微生态学技术的发展有可能给肠道微 生态学带来革命性的突破. 一、胃肠道菌群的组成、分布及影响因素 1. 胃肠道菌群的组成与分布[1 ,5 ] 　　人的胃肠道细菌 ,主要由厌氧菌、兼性厌氧菌和好 氧菌组成 ,其中专性厌氧菌占 99 %以上 ,而仅类杆菌与 双歧杆菌就占细菌总数的 90 %以上. 乳杆菌和双歧杆菌 是胃肠道正常微生物区系中的重要成员并与宿主终生 伴随. 胃、十二指肠、空肠细菌的种类及数量极少 ,主要 为革兰阳性好氧菌 ,如链球菌、葡萄球菌和乳酸杆菌 ,其 中乳酸杆菌的数量约为 103CFU/ ml. 在回肠末端 ,细菌数 逐渐增加到 105～108 CFU/ ml ,主要含乳酸杆菌 (102～ 105CFU/ ml) 、大肠杆菌、类杆菌和梭状芽孢杆菌等. 至结 肠 ,细菌数明显增加 ,浓度为 109～1012CFU/ ml ,主要为厌 氧菌 :双歧杆菌 (108～1011 CFU/ ml) 、类杆菌、乳酸杆菌 (104～109CFU/ ml) 占绝对优势 ,为优势菌群而有潜在致 病性的梭状芽孢杆菌和葡萄球菌仅占少量. 　　肠道微生物群落可分为三大部分 : ①与宿主共生的 生理性细菌. 为专性厌氧菌 ,是肠道的优势菌群 ,如双歧 杆菌、类杆菌、优杆菌和消化球菌等是膜菌群的主要构 成者 ,具有营养及免疫调节作用 ; ②与宿主共栖的条件 致病菌 ,以兼性需氧菌为主 ,为肠道非优势菌群 ,如肠球 菌、肠杆菌 ,在肠道微生态平衡时是无害的 ,在特定的条 件下具有侵袭性 ,对人体有害 ; ③病原菌. 大多为过路 菌 ,长期定植的机会少 ,生态平衡时 ,这些菌数量少 ,不 会致病 ,如果数量超出正常水平 ,则可引起人体发病. 如 变形杆菌、假单胞菌和韦氏梭菌等. 2. 胃肠道菌群的影响因素[6 ] 　　消化道正常菌群的种类、数量和分布不是固定不变 的 ,而是受多种因素影响 ,诸如宿主、微生物及微生物之 间的互相作用. 又与饮食密切相关. 　　(1) 宿主因素 　　pH、分泌物 : 胆酸、胃酸、免疫球蛋白、淋巴因子 (lymphokines) 、盐类和酶类等. 运动特性 :胃肠蠕动 ,运动 速度. 　　生物学特性 :区室化作用 (compartmentalisation) . ·88· Ziran Zazhi 　Vol. 26 No. 2科技进展 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　　片状剥落细胞 :黏蛋白、黏液层、微绒毛膜、细胞 组织. 　　(2) 微生物因素 　　定植力 :黏附力、定植抗性、运动性. 　　菌的特性 :孢子、膜、酶类、抗微生物物质 (细菌素) 、 世代时间. 　　(3) 微生物之间的互相作用 　　协同作用 :代谢的协同作用 ,生长因子和维生素分 泌、氧化还原电位 ( Eh) 、pH、氧气. 　　拮抗/ 刺激 :短链脂肪酸、胺、Eh、pH、氧气 ;定植抗 性、抗微生物物质 (细菌素) 、铁载体、营养需求等. 　　(4) 饮食 　　成分 :非消化纤维、药物等. 3. 菌群失调[1 ,7 ] 　　肠道正常菌群的种类、数量和比例发生异常变化 , 偏离正常的生理组合 ,转变为病理性组合状态 ,即菌群 失调. 菌群失调会引起许多相关疾病 ,临床上以腹泻为 最明显症状. 其他如肠道菌群中潜在致病菌引起的内源 性感染和一些过敏性疾病 ,如特异性反应性湿疹、过敏 性皮炎和炎症性肠病等. 这些症状被认为与菌群变化导 致肠道屏障功能损害有关. 　　抗生素抗菌谱过广 ,时间应用过长 ,在杀死病菌的 同时也杀死有益菌群 ,破坏了肠道微生态平衡 ,是引起 菌群失调的主要诱发因素. 放射性同位素、激素及放射 治疗和化疗均可在治疗疾病的同时降低人体免疫力 ,影 响益生菌 ,使人体潜在的致病菌定植. 另外 ,手术、外伤、 感染、肿瘤及环境恶化等也会引起菌群失调. 二、肠道正常微生物群的生理功能[8 ,9 ] 　　肠道正常微生物群落是原籍微生物群落 ,是微生物 与其宿主在共同的历史进化过程中形成的. 这些微生物 群数量巨大 ,对其寄主非但无害 ,而且是有有益和必要 的 ,因为它们含有种类繁多的酶系统 ,参与宿主能量、物 质及遗传信息运转等一系列生理过程. 1. 营养作用 　　肠道内一些正常微生物 ,如 :双歧杆菌、乳杆菌、真 杆菌和大肠杆菌等能合成多种蛋白质和维生素 ,供宿主 利用. 肠道微生物可结合氨基酸分解的 NH3 ,合成蛋白质 或其他氨基酸 ,同时它们具有利用非蛋白氮合成氨基 酸、蛋白质的生物固氮能力. 此外 ,肠道微生物能促进亚 油酸的吸收 ,促进胆固醇向类固醇的转变 ,促进胆汁酸 脱饱和、脱羟基等正常代谢 ,并参与一些药物、毒物的体 内代谢. 2. 提高防御能力 　　随人个体生长发育到不同阶段 ,不同种类和数量的 正常微生物群定植在胃肠道黏膜及胃肠道内容物中 ,形 成胃肠道的动态微生态平衡 ,该平衡能有效阻止致病细 菌和病毒等外籍微生物的入侵和繁殖. 人胃肠道中 ,厌 氧菌占绝对优势 (占 90 %以上) ,这些菌在代谢过程中产 生挥发性脂肪酸和乳酸 ,降低小生境内的 pH 和 Eh ,从而 抑制外籍菌的生长繁殖. 同时 ,厌氧菌与胃肠道黏膜上 皮细胞紧密结合 ,形成一层叫膜菌群的生物膜 ,这层膜 对宿主起到了占位性保护作用. 由于厌氧菌数量巨大 , 在营养竞争上处于优势 ,加之在厌氧条件下繁殖很快 , 因而限制了兼性菌的生长. 此外 ,厌氧菌产生的 H2O2 对 不能产生过氧化氢酶的细菌有抑制作用. 3. 免疫调节作用 　　正常微生物群落尤其是在胃肠道的微生物能剌激 宿主建立完备的免疫系统. 在检查无菌动物的免疫系统 时 ,发现同其淋巴系统、抗体形成系统等均发育不良 ,如 无菌鸡回盲部的淋巴结比普通鸡减少了 4/ 5. 此外 ,从新 生儿免疫系统的发育过程也可看出正常菌群的作用. 无 菌动物的体液免疫、细胞免疫功能均低于普通动物 ,如 无菌动物血液中γ球蛋白含量降低 ,基本测不出分泌型 IgA. 无菌小鼠血液中的 IgG含量仅为普通小鼠的 1/ 10. 无菌动物淋巴细胞增殖能力很低 ,浆细胞形成受抑制 , 细胞免疫反应能力弱. 这说明正常微生物不仅能刺激机 体免疫器官的发育 ,而且对增强机体特异性细胞和体液 免疫是不可缺少的. 4. 微生态平衡与抗生素 　　抗生素的使用严重破坏了人胃肠道的微生态平衡 , 还引起耐药性菌株的产生. 就个体而言 ,抗生素破坏胃 肠道的膜菌群 ,外籍致病菌便乘机而入 ,导致二重感染. 一般来说 ,抗生素的抗菌谱愈广 ,发生菌群失调和二度 感染的频率愈高. 针对抗生素的弊端 ,近年来提出了微 生态疗法的概念 ,主要包括营养调整、抗菌调整、内服菌 群促进物质和活菌制剂 (益生素) 等四个方面 ,其目的是 恢复和稳定原有的微生态平衡 ,而稳定的胃肠道正常微 生态平衡有助于人抵抗病原菌感染. 如可通过细菌拮抗 作用、细菌干扰作用、屏障效应、定居抗性作用和竞争排 斥作用等机制来实现抗感染. ·98· 自 然 杂 志 　26 卷 2 期 科技进展 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 三、肠道菌群研究的新技术 　　传统的技术是从肠道分离微生物 ,经培养的分离物 作为肠道菌群的惟一来源 ,进一步对其获得的分离 物进行表型特征性状的测定和鉴定. 传统的技术费时耗 力 ,某些特性的测定精确性差 ,而且不能表达分离物间 的系统发育关系. 而应用不依赖纯培养的分子生态学方 法及分子工具 ,可大大扩展对肠道分离物的鉴定能力 , 对研究人肠道菌群的生物多样性和深入了解益生菌及 其在肠道中的功能有着重大影响. 目前常用技术有如下 几种 : 1. 16S rRNA基因的聚合酶链式反应( polymerase 　chain reaction , 简称 PCR) [ 10] 　　16S rRNA 基因序列高度保守 ,其核苷酸位点的变化 具有种的特异性. 这种方法的基本过程是 ,先 PCR 扩增 一 DNA ,然后对扩增片段进行测序. 测序后或人工 解读 ,或使用测序数据分析软件包自动解读. 测序的正、 反链序列经校正后可排列成一个一致序列 (consensus se2 quence) . 比如 :将被检分支杆菌的一致序列中的特征性 序列和已知分支杆菌的特征性序列进行比较 ,就可以准 确地鉴定这种分支杆菌. 或者通过计算机从 EMBL、 DDBJ、PDB、GenBank 和 Ribosomal Database liberary (www. cme. msu. edu/ RDP) 等数据库寻找 DNA 序列相似度. 当 被检分支杆菌的相关序列和数据库的参考序列 100 %相 同时 ,可以作确切的鉴定. 　　Frothingham 等[11]对来源于肠道的 7 种共 8 株双歧 杆菌的 16S rRNA 基因进行测序 ,7 个种的双歧杆菌的 16S rRNA 基因相似性是 94 %～99 %. 而双歧杆菌 (以 B . infantis 为例) 与其他相关菌 ( Actinomyces bovis , Arhtro2 bater globiformis , Mycobacterium bovis , Saccharothrix austr2 liense and Strptomyces coelicolor) 的相似性远远小于属内相 似程度 ,从而将双歧杆菌与其他非双歧杆菌区分开来. Leblond 等[12]对 4 种 5 株双歧杆菌的 16S rRNA 序列进行 了测定 , 并同 GenBank/ EMBL 中的其他双歧杆菌 16S rRNA 序列比较构建了发生树 ,表明 16S rRNA 序列也可 以区别不同种的双歧杆菌. 沈永才等[13]也曾利用双歧杆 菌 16S rRNA 序列的恒定区和 V10 可变区设计引物 ,对 6 种 15 株不同来源的双歧杆菌进行 PCR 鉴定 ,发现特异 性和灵敏性都比较高. 2. 变性梯度凝胶电泳( denaturing gradient gel elec- 　 trophoresis , 简称 D GGE) 　　这一方法可从通常的扩增产物分开单独的 rRNA 基 因. 其原理为 :在一个引物的 5′端加入 30 - 50bp 的 GC 片 段 ( GC - clamp) ,对 16S rRNA 基因进行 PCR 反应 ,把带有 较高解链温度 GC 片段的扩增产物放到有梯度的尿素和 甲酰胺作为变性剂的聚炳烯凝胶中进行电泳 ,部分解链 的双链DNA 分子的电泳迁移率降低 ;而序列不同的DNA 分子的解链速度和程度不同 ,它们在凝胶的不同位置停 止迁移 ,从而使不同序列的 DNA 分子分开[14] . 在恰当的 条件下 ,只要有一个碱基对的差异即可相互分开. 　　DGGE 可为一单个的肠道复杂的微生物菌群留下指 纹印迹. 应用此技术能快速地检测一单独区系菌群的构 成 ,也可以发现存在的新分离物或供人们利用的益生 菌. Favier 等[15]应用 DGGE 技术对两个新生儿肠道菌群 的 16S rRNA 基因的多样性进行了连续检测 ,通过分析 DGGE 主要带型的变化 ,对人类自出生之日起肠道微生 态系统的发生发展的变化规律进行了动态描述. 他们发 现婴儿出生后起初几天 ,DGGE 的带型是简单的 ,但随着 时间的延长 ,肠道菌群多样性的提高 ,带型越来越复杂. Temmerman 等[16]利用 DGGE 技术对来自不同厂家的 10 种益生菌制品的菌种组成进行了分析研究 ,并与利用依 赖纯培养的传统技术所检测的结果进行比较 ,发现其中 一些益生菌制品所含菌种被厂家错误标示 ;而且 10 种 益生菌制品中有 6 种其商标上所标示含有的菌种 ,利用 传统纯培养技术不能被完全检测到 ,而利用 DGGE 技术 不但可以完全检测到已标示的菌种 ,还能发现其中 5 种 益生菌制品中所包含的商标上没有标示的其他菌种. 3. 脉冲场凝胶电泳 (pulsed-field gel electrophoresis , 　简称 PFGE) [5 ] 　　脉冲场凝胶电泳实质上是利用一电泳脉冲系统通 过琼脂糖凝胶迁移很大片段的 DNA. 方法是用一种少见 的限制性内切酶 (通常有一个 8bp 或 6bp 可识别的位点) 将分离物的基因组消解成相对少的 (5 - 50) 大片段 ,然 后用脉冲场凝胶电泳将它们分开 ,从而获得 DNA 片段的 指纹图. 通过计算机凝胶扫描、软件分析 ,可以建立对所 有微生物的 PFGE 图谱的数据库 ,以便各菌株间的比较. PFGE对特异的菌有特征性 ,步骤简单 ,具有高分辨力 , 且结果易于分析. Roussel Y等[17] ,利用 PFGE 将 9 株生化 特性明显不同的生产用 Lactobacillus acidophilus 确定为 Lactobacillus acidophilus , 并通过 PFGE 确定了 Lact . aci2 dophilus 和 Lact . Gasseri 的分子量大小 ,分别为 1. 85 和 2. 02Mb. McCartney 等 (1996) 和 Kimura 等 (1997) 曾应用此 技术对人粪便样品中的乳杆菌和双歧杆菌进行了跟踪 检测. 但 PFGE 技术耗时较长 ,需 2～3 天 ,降低了实验室 分析大量样品的能力 ,使其应用受到限制. ·09· Ziran Zazhi 　Vol. 26 No. 2科技进展 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 4. 16S rRNA基因的限制性片段长度多态性( restriction 　fragment length polymorphism,简称 RFLP) [18] 　　利用以 16S rRNA 基因内通常的保守区为靶的引物 , 用聚合酶链式反应技术扩增 16S rRNA 基因 ,用特定的限 制性内切酶切割扩增物 ,再将产生的长短、种类、数目不 同的限制性片段 ,用琼脂糖凝胶电泳分开它们 ,从而生 成一特征性的限制性片段长度多态性. 由某一限制性内 切酶产生的片段大小和数目在不同个体中即表现出差 异. 对每一个 DNA/ 限制性内切酶组合来说 ,所产生的片 段都是特异性的. RFLP 作为检测细菌种内或种间水平 的方法 ,近年来被应用于细菌 ,尤其是双歧杆菌的分类 及鉴定中. Mangin 等[19]对 21 株双歧杆菌采用不同的限 制性内切酶切割 ,得出 RFLP 所显示的带型图谱 ,将 21 株菌归为 8 个种. 同时 RFLP 还显示了各菌株之间 DNA 差异 ,这使得 RFLP 可作为种以下菌株间的鉴定成为 可能. 5. 随机扩增多态性技术( random amplif ied polymor 　phic DNA) 　　采用随机序列的 10 - 12 个碱基的引物 ,对基因组 DNA 进行扩增 ,非特异的引物可以结合在模板 DNA 的 多个位点 ,产生多个 PCR 产物 ,经电泳分离开和溴化乙 锭染色 ,即可直接检测 DNA 多态性的产生 ,并用于 DNA 指纹分析. Du Plessis 等[20]应用此方法区分了 Lactobacil2 lus acidophilus、Lb. crispatus、Lb. amylovortts、Lb. galli2 narum、Lb. gasseri 和 Lb. jonhsonii . 此技术快速 ,有鉴别 力 ,可应用于那些缺乏序列信息的菌类. 但缺点在于 ,操 作程序上反应条件的细微变化就可能改变显现带的图 形 ,重复性差. 6. 荧光原位杂交( fluorescent in situ hybridization , 　简称 FISH) 　　此技术是将带有荧光标记的寡核苷酸探针直接与 固定在载玻片上的细胞进行杂交 ,固定过程中要使短的 探针渗透到细胞内的核酸 ,用荧光显微镜即可观察到带 有杂交荧光标记探针的细胞. Langendijk 等[21]已应用此 技术检测粪便样品中双歧杆菌 ,其用荧光标记靶 16S rRNA 寡核苷酸探针 ,使用显微镜测定粪便样品中双歧 杆菌中的数量. Harmsen 等[22]曾设计 7 种 16S rRNA 寡核 苷酸探针来检测人粪便样品中 6 种厌氧菌 ( Phascolarcto2 bacterium , Veillonella , Eubacterium hallii , Lachnospira , Eu2 bacterium cylindroids , Ruminococcus) ,能检测到细菌总数的 90 %. 　　综上所述 ,人胃肠道菌群在人的生命活动中起着非 常重要的作用. 了解菌群与宿主、菌群中各种微生物间 的相互作用 ,以及调控这些活动的生态机制 ,是人们长 期以来致力研究的一个重要领域. 随着分子生物学的发 展 ,新技术的应用 ,克服了在检测前必须培养菌体的问 题 ,为研究不可培养微生物提供了可能性. (2003 年 11 月 7 日收到) 金红芝 　硕士研究生 ,上海交通大学生命科学技术学院 , 　　　　上海 200240 李堃宝 　教授 ,上海交通大学生命科学技术学院 , 上海 　　　　200240 1 　郭贵海 ,王崇文. 临床内科杂志 ,2002 ;19 (2) :88290 2 　周德庆 ,郭杰炎. 工业微生物 ,1999 ;29 (1) :34243 3 　Guarner F. ,Malagelada J . R. 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