羊胚胎移植技术概论

null 羊 胚胎移植技术 羊 胚胎移植技术河套 大学 吉日嘎拉 null羊胚胎移植技术概论河套大学一、供体羊的选择与饲养管理 1、供体羊的选择 2、供体羊的饲养管理 3、供体羊的超数排卵及人工授精 4、影响超排效果的因素 5、胚胎回收 二、受体羊的选择及饲养管理 1、受体羊的选择 2、受体羊的同期发情处理 3、胚胎移植 4、影响胚胎移植 妊娠率的因素一、供体羊的选择与饲养管理 1、供体羊的选择 2、供体羊的饲养管理 3、供体羊的超数排卵及人工授精 4、影响超排效果的因素 5、胚胎回收 二、受体羊的选择及饲养管理 1、受体羊的选择 2、受体羊的同期发情处理 3、胚胎移植 4、影响胚胎移植 妊娠率的因素 1、供体羊的选择： A、品种优良、生产性能好； B、遗传性能稳定、谱系清楚； C、体质健壮、繁殖机能旺盛，无遗传病、生殖道疾病和传染性疾病。年龄在1.5~6岁以内为宜； D、产羔历史清楚、性周期正常； E、产羔60天以上，经观察至少有两个以上正常发情周期的母羊。 1、供体羊的选择： A、品种优良、生产性能好； B、遗传性能稳定、谱系清楚； C、体质健壮、繁殖机能旺盛，无遗传病、生殖道疾病和传染性疾病。年龄在1.5~6岁以内为宜； D、产羔历史清楚、性周期正常； E、产羔60天以上，经观察至少有两个以上正常发情周期的母羊。 一、供体羊的选择与饲养管理 2、供体羊的饲养管理 A、保持饲养环境稳定，饲养环境卫生、干燥、棚舍温度适宜，避免应激反应； B、制定合理的日粮配方，以粗料为主，精料为补，保证正常的营养平衡； C、满足供体羊清洁饮水的需要； D、适当的运动。 2、供体羊的饲养管理 A、保持饲养环境稳定，饲养环境卫生、干燥、棚舍温度适宜，避免应激反应； B、制定合理的日粮配方，以粗料为主，精料为补，保证正常的营养平衡； C、满足供体羊清洁饮水的需要； D、适当的运动。 供体羊的选择与饲养管理3、供体羊的超数排卵及人工授精 （1）超数排卵的季节及发情周期----绵羊和山羊的最适超排季节为8月下旬至12月上旬（内蒙地区）。绵羊的发情周期为15--17.5天，山羊为19--22天。供体母羊在超排前最好观察2个完整的发情周期； （2）超排激素：促滤泡素（FSH）、促黄体素（LH）、孕马血清促性腺激素（PMSG） （3）激素剂量： FSH：绵羊90--180iu、山羊90--180iu LH：60--200iu PMSG：500-1500iu （4）同期发情处理： CIDR（进口） 阴道海绵栓（浙江台州永安兽药有限公司） PG（国产）3、供体羊的超数排卵及人工授精 （1）超数排卵的季节及发情周期----绵羊和山羊的最适超排季节为8月下旬至12月上旬（内蒙地区）。绵羊的发情周期为15--17.5天，山羊为19--22天。供体母羊在超排前最好观察2个完整的发情周期； （2）超排激素：促滤泡素（FSH）、促黄体素（LH）、孕马血清促性腺激素（PMSG） （3）激素剂量： FSH：绵羊90--180iu、山羊90--180iu LH：60--200iu PMSG：500-1500iu （4）同期发情处理： CIDR（进口） 阴道海绵栓（浙江台州永安兽药有限公司） PG（国产）供体羊的选择与饲养管理3、供体羊的超数排卵及人工授精 （5）超排方法：目前常用的方法是--FSH三天递减注射法： 绵羊以母羊发情之日作为发情周期的第0天，在母羊发情后的第13天或13.5天（周期大于17.5天的羊在第13.5天）开始，每天早（6：00~7：00h）和晚（18：00~19：00h）各肌肉注射一次FSH ，连续3天，剂量递减、进行肌肉注射。 山羊以母羊发情之日作为发情周期的0天，在母羊发情后期的15—16天开始，每天早（6：00~7：00h）和晚（18：00~19：00h）两次肌肉注射FSH，连续三天，剂量递减。 3、供体羊的超数排卵及人工授精 （5）超排方法：目前常用的方法是--FSH三天递减注射法： 绵羊以母羊发情之日作为发情周期的第0天，在母羊发情后的第13天或13.5天（周期大于17.5天的羊在第13.5天）开始，每天早（6：00~7：00h）和晚（18：00~19：00h）各肌肉注射一次FSH ，连续3天，剂量递减、进行肌肉注射。 山羊以母羊发情之日作为发情周期的0天，在母羊发情后期的15—16天开始，每天早（6：00~7：00h）和晚（18：00~19：00h）两次肌肉注射FSH，连续三天，剂量递减。 供体羊的选择与饲养管理 null绵羊（山羊）FSH具体注射如下 供体羊的选择与饲养管理供体羊超排及受体羊同期发情处理一(d)供体羊超排及受体羊同期发情处理方案一(d)供体羊超排及受体羊同期发情处理方案二(g)供体羊超排及受体羊同期发情处理方案二(g)供体羊超排及受体羊同期发情处理方案三(g)供体羊超排及受体羊同期发情处理方案三(g)供体羊超排及受体羊同期发情处理方案四（c)供体羊超排及受体羊同期发情处理方案四（c)3、供体羊的超数排卵及人工授精 （6）供体羊的发情鉴定 每天早晚2次，用试情公羊进行发情鉴定，每30~40只母羊需1只试情公羊。要求试情准确。 3、供体羊的超数排卵及人工授精 （6）供体羊的发情鉴定 每天早晚2次，用试情公羊进行发情鉴定，每30~40只母羊需1只试情公羊。要求试情准确。 供体羊的选择与饲养管理试情公羊的选择： 体质健壮、性欲旺盛，活动力强。3、供体羊的超数排卵及人工授精 （7）对种公羊的要求：谱系清楚，检疫合格，遗传性稳定，生产性能优良，精液品质良好。 （8）人工授精操作要求：确认发情时立即进行第一次输精，之后隔12小时再输精一次。3、供体羊的超数排卵及人工授精 （7）对种公羊的要求：谱系清楚，检疫合格，遗传性稳定，生产性能优良，精液品质良好。 （8）人工授精操作要求：确认发情时立即进行第一次输精，之后隔12小时再输精一次。供体羊的选择与饲养管理 在胚胎移植实际工作中、受精这个技术环节虽与胚胎移植技术本身无直接的相关性，但其与受精卵的多少直接相关。 4、影响供体羊超排效果的主要因素 作为供体羊的个体对超排处理的反映存在很大差异，往往出现相同超排处理方法，而结果差异却很大，有的供体排卵很多、而有的供体却无反应，目前已知影响羊超排效果的主要因素有以下几个方面： （1）促性腺激素：除其种类、剂量、效价、投药时间和次数以外，生产厂家、批号、药剂的保存方法、处理程序等均影响超排效果。如下表所示： FSH批号排卵数回收胚可用胚批号一 19.74±9.18 a 11.58 ±7.41 b 9.63 ±7.36c 批号二 15.57 ±6.68a 8.36 ±6.23 b 4.50 ±3.85dFSH剂量、方法、厂家相同、批号不同对绵羊超排处理结果a=a、b=b p>0.05 c>d p<0.01(2)个体差异：羊的品种、年龄和营养状况等都会影响超排效果。一般繁殖力高的品种对促性腺激素的反应比繁殖力低的品种好，成年羊比幼龄羊的反应好，营养状况好的比营养状况差的反应好。山羊的超排效果优于绵羊。 相似的方法对不同品种绵羊超排处理结果 品 种 回收胚胎数 美利奴羊 16.37 ±3.7 萨福克羊 11.3±0.9 罗姆尼羊 8.2 ±2.0(2)个体差异：羊的品种、年龄和营养状况等都会影响超排效果。一般繁殖力高的品种对促性腺激素的反应比繁殖力低的品种好，成年羊比幼龄羊的反应好，营养状况好的比营养状况差的反应好。山羊的超排效果优于绵羊。 相似的方法对不同品种绵羊超排处理结果 品 种 回收胚胎数 美利奴羊 16.37 ±3.7 萨福克羊 11.3±0.9 罗姆尼羊 8.2 ±2.0null（3）季节：在国外，有科研人员为探讨季节对供体羊超排效果的影响问题，曾经分几个批次作过一年的实验，结果发现：春季（3月）最低，秋季（9月）最高。我国的科研人员也曾对绵羊的自然排卵情况作过观察，发现新疆山区的牧场细毛羊发情旺季在9—12月份，10月份最高，发情母羊占91.4%，其中排卵母羊占96.3%。1—3月份卵巢仍有活动，4—7月份为乏情期。 在内蒙的鄂尔多斯地区，绒山羊的发情旺期在8月下旬—11月中旬，5—6月份为乏情期。（4）供体本身的FSH水平：家畜在自然情况下，发情前出现FSHHE LH的分泌峰值，促使卵泡的生长形成卵泡腔，因为只有腔卵泡才能接受外援促性腺激素的刺激而发生排卵。在自然情况下，约99%的有腔卵泡发生闭锁退化，只有1%左右的卵泡在排卵时排出卵子。有研究证明：FSH在卵泡腔形成过程中起重要作用，它能够刺激颗粒细胞的有丝分裂和卵泡液的形成，还可以增加LH感受器的数目而诱发颗粒细胞对LH的敏感性。母畜在排卵以前的20—30h出现第二次FSH高峰，其目的是启动另一批卵泡形成卵泡腔，为下一个情期排卵作准备。排卵率高的羊此峰值明显高于排卵率低的羊，而且分泌的FSH量与17天后卵巢上的有腔卵泡数量成正比。 新疆的郭志勤曾做过这样的实验（在超排处理前情期的第二天用小剂量的FSH做预处理） 组 别 排卵数 回收卵数 可用胚 实验组 16.7 13.33 12 对照组 13.57 8.78 4.13 （4）供体本身的FSH水平：家畜在自然情况下，发情前出现FSHHE LH的分泌峰值，促使卵泡的生长形成卵泡腔，因为只有腔卵泡才能接受外援促性腺激素的刺激而发生排卵。在自然情况下，约99%的有腔卵泡发生闭锁退化，只有1%左右的卵泡在排卵时排出卵子。有研究证明：FSH在卵泡腔形成过程中起重要作用，它能够刺激颗粒细胞的有丝分裂和卵泡液的形成，还可以增加LH感受器的数目而诱发颗粒细胞对LH的敏感性。母畜在排卵以前的20—30h出现第二次FSH高峰，其目的是启动另一批卵泡形成卵泡腔，为下一个情期排卵作准备。排卵率高的羊此峰值明显高于排卵率低的羊，而且分泌的FSH量与17天后卵巢上的有腔卵泡数量成正比。 新疆的郭志勤曾做过这样的实验（在超排处理前情期的第二天用小剂量的FSH做预处理） 组 别 排卵数 回收卵数 可用胚 实验组 16.7 13.33 12 对照组 13.57 8.78 4.13 p<0.015、胚胎回收（手术冲胚） （1）仪器设备 5、胚胎回收（手术冲胚） （1）仪器设备 1、连续变倍体视显微镜 2、加样器：50--200ul 3、Tip头 ※ 4、表面皿 ★ 5、冲胚管 6、一次性培养皿（Φ35mm、Φ60mm） ★ 7、电子天平（感量1‰） 8、硫酸纸 9、量筒（20ml~500ml等)、烧杯（50ml~500ml等） 10、超净工作台 11、双蒸水蒸馏器 ※ 12、羊内胎 ※ 13、羊采精外套 ※ 14、集精杯 ※ 15、保温套 ※ 16、羊输精器 17、一次性注射器（5ml、10ml) 18、1ml卡介苗玻璃注射器 19、酒精喷灯 20、玻璃细管 21、高压灭菌器 22、恒温水浴箱 ※ 23、电热古风干燥箱 24、电冰箱 供体羊的选择与饲养管理5、胚胎回收（手术冲胚）5、胚胎回收（手术冲胚）（2）药品试剂 1、PBS粉末 2、BSA 3、FSH 4、LH 5、静松灵 6、新洁而灭 7、碘酒 8、酒精 9、CIDR 10、阴道海绵拴 11、PG （录前列希醇） 12、液体石蜡 13、青霉素 14、消炎粉 15、生理盐水 （3）手术器械 1、手术台（1） 2、手术刀（1） 3、止血钳（4） 4、手术剪（圆头直刃剪、尖头直刃剪）（各1） 5、剪毛剪（1） 6、剪线剪（1） 7、布巾钳（4） 8、创布（1大1小/次/只） 9、方磁盘 10、移动车（手术用） 11、止血纱布（若干） 12、缝合针（不同型号） 13、缝合线（不同型号） 14、持针钳（1） 15、手术刀片（若干） 16、刮胡刀（1） 供体羊的选择与饲养管理null5、胚胎回收（手术冲胚） （4）冲胚方法： ※ 腹腔内窥镜法 ※ 手术法供体羊的选择与饲养管理 手术法胚胎移植对供受体母羊重复使用的影响 表1、手术对供体母羊重复超排取胚的影响 手术次数 供体羊数 排卵数 回收胚胎数 1 91 15.6  9.0 10.9 7.4 2 43 11.8  8.6 9.8  7.1 3 7 7.0  3.9 5.6  4.4 4 2 11.0 4.2 7.0 1.4手术法胚胎移植对供受体母羊重复使用的影响 表1、手术对供体母羊重复超排取胚的影响 手术次数 供体羊数 排卵数 回收胚胎数 1 91 15.6  9.0 10.9 7.4 2 43 11.8  8.6 9.8  7.1 3 7 7.0  3.9 5.6  4.4 4 2 11.0 4.2 7.0 1.4排卵数 : 1>2=3=4 P<0.01 回收胚胎数: 1=2>3=4 P<0.05另附： 表2、因手术发生粘连对供体母羊胚胎回收操作的影 表2、因手术发生粘连对供体母羊胚胎回收操作的影1=2=3 P >0.05 表3、手术对受体母羊妊娠及分娩的影响 手术次数 移植受体数 妊娠受体数（%） 分娩受体数（%） 1 244 194（79.5) 167(68.4) 2 85 62(72.9) 52(61.2) 3 45 33(73.3) 29(64.4) 4 9 3(33.3) 3(33.3) 表3、手术对受体母羊妊娠及分娩的影响 手术次数 移植受体数 妊娠受体数（%） 分娩受体数（%） 1 244 194（79.5) 167(68.4) 2 85 62(72.9) 52(61.2) 3 45 33(73.3) 29(64.4) 4 9 3(33.3) 3(33.3)1=2=3>4 P<0.05 注意事项（须遵循以下几个原则）： 无菌、规范、各种器械使用得当。nullnullnullnullnullnullnullnull6、胚胎的冷冻保存及解冻 冷冻液：目前所用的冷冻液主要为乙二醇和甘油 (1)冷冻液的配制： A、母液----HM(含BSA的磷酸盐缓冲液[PBS]） B、冷冻液----EG(1.5M的乙二醇） 第一液（VS1)：1/3的1.5M的EG+2/3的HM 第二液（VS2): 2/3的1.5M的EG+1/3的HM 第三液（VS3)：1.5M的EG (2)平衡： 第一液：6--7分钟 第二液：6--7分钟 第三液（装管）------15--20分钟 （3）冷冻（使用程序2或3）：6、胚胎的冷冻保存及解冻 冷冻液：目前所用的冷冻液主要为乙二醇和甘油 (1)冷冻液的配制： A、母液----HM(含BSA的磷酸盐缓冲液[PBS]） B、冷冻液----EG(1.5M的乙二醇） 第一液（VS1)：1/3的1.5M的EG+2/3的HM 第二液（VS2): 2/3的1.5M的EG+1/3的HM 第三液（VS3)：1.5M的EG (2)平衡： 第一液：6--7分钟 第二液：6--7分钟 第三液（装管）------15--20分钟 （3）冷冻（使用程序2或3）：供体羊的选择与饲养管理 室温-6.5 ℃植冰-0.3~-0.5℃/分-30~-35℃LN5分钟5分钟人工6、胚胎的冷冻保存及解冻 （4）胚胎的解冻： A、解冻液的配制： a、母液： 母液1----PBS+BSA(HM)(含BSA的磷酸盐缓冲液PBS) 母液2----乙二醇(EG)(1.5M的乙二醇） 母液3----蔗糖(Suc)(1M的蔗糖） b、解冻液： 第一液（VS1)：1/3的1.5M的EG+1/3的1M的Suc+1/3的HM 第二液（VS2)：1/4的1M的Suc+3/4的HM 第三液（VS3)：HM B、解冻程序 6、胚胎的冷冻保存及解冻 （4）胚胎的解冻： A、解冻液的配制： a、母液： 母液1----PBS+BSA(HM)(含BSA的磷酸盐缓冲液PBS) 母液2----乙二醇(EG)(1.5M的乙二醇） 母液3----蔗糖(Suc)(1M的蔗糖） b、解冻液： 第一液（VS1)：1/3的1.5M的EG+1/3的1M的Suc+1/3的HM 第二液（VS2)：1/4的1M的Suc+3/4的HM 第三液（VS3)：HM B、解冻程序 供体羊的选择与饲养管理（液氮）胚胎空气30--35℃水浴第一液第二液第三液洗后移植8~10秒30~60秒6~7分钟6~7分钟 1、受体羊的选择： *繁殖性能良好、发情周期正常、无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、膘情在7成以上； *年龄在1.5--6岁之间； *经观察有两个正常发情周期的母羊； *供受体同步差最多不超过前后24小时； *受体羊单独组群编号，加强饲养，保持环境相对稳定，避免应激反应。 1、受体羊的选择： *繁殖性能良好、发情周期正常、无繁殖机能疾病，经检疫无传染疾病，健康、膘情在7成以上； *年龄在1.5--6岁之间； *经观察有两个正常发情周期的母羊； *供受体同步差最多不超过前后24小时； *受体羊单独组群编号，加强饲养，保持环境相对稳定，避免应激反应。 二、受体羊的选择及饲养管理2、受体羊的同期发情处理： *方法1、PG两次注射法，即第一次注射在任意一天，第二次注射：绵羊在第一次注射后7天、山羊在第一次注射后9--10天。第二次注射后24--96小时观察发情。受体羊发情之日计为0天，按胚龄要求进行移植。 *方法2、CIDR 法，任意一天放入，放9天后取出，并在取出前24小时肌注PG，48小时后，85%以上的羊可发情，受体羊发情之日为0天，按胚龄要求进行移植。 *方法3、阴道海绵栓法，任意一天放入，放置12—14天取出，一般在取出前48h肌注PMSG200iu，48小时后，80%--95%以上的羊可发情，受体羊发情之日为0天，按胚龄要求进行移植。（可不进行试情） 2、受体羊的同期发情处理： *方法1、PG两次注射法，即第一次注射在任意一天，第二次注射：绵羊在第一次注射后7天、山羊在第一次注射后9--10天。第二次注射后24--96小时观察发情。受体羊发情之日计为0天，按胚龄要求进行移植。 *方法2、CIDR 法，任意一天放入，放9天后取出，并在取出前24小时肌注PG，48小时后，85%以上的羊可发情，受体羊发情之日为0天，按胚龄要求进行移植。 *方法3、阴道海绵栓法，任意一天放入，放置12—14天取出，一般在取出前48h肌注PMSG200iu，48小时后，80%--95%以上的羊可发情，受体羊发情之日为0天，按胚龄要求进行移植。（可不进行试情） 受体羊的选择及饲养管理 受体羊的选择及饲养管理 受体羊的选择及饲养管理 3、胚胎移植 *手术法 *腹腔内窥镜法4、影响胚胎移植妊娠率的因素 羊胚胎移植妊娠率的高低主要取决于以下几个方面： （1）供体与受体的同步化程度； （2）受体的黄体发育与孕酮含量； 国外有学者做过这样的实验：将切除卵巢后3个月的母羊，移植胚胎后用孕酮处理10天，几乎都能使胚胎发育至第15天，由此可见，黄体分泌的孕酮是维持妊娠的重要因素，黄体发育不好、分泌功能不足或退化就难以维持妊娠。 （3）受体的品种、年龄； （4）一次移植的胚胎数； 80年代—90年代就有人认为：移植双胚的妊娠率比移植单胚的高10%--15%、将2枚胚胎同时移入受体一侧的子宫角，要比分别移两侧的子宫角受胎率高。 （5）术者的技术熟练程度； 4、影响胚胎移植妊娠率的因素 羊胚胎移植妊娠率的高低主要取决于以下几个方面： （1）供体与受体的同步化程度； （2）受体的黄体发育与孕酮含量； 国外有学者做过这样的实验：将切除卵巢后3个月的母羊，移植胚胎后用孕酮处理10天，几乎都能使胚胎发育至第15天，由此可见，黄体分泌的孕酮是维持妊娠的重要因素，黄体发育不好、分泌功能不足或退化就难以维持妊娠。 （3）受体的品种、年龄； （4）一次移植的胚胎数； 80年代—90年代就有人认为：移植双胚的妊娠率比移植单胚的高10%--15%、将2枚胚胎同时移入受体一侧的子宫角，要比分别移两侧的子宫角受胎率高。 （5）术者的技术熟练程度； null体外胚胎良种供体超排处理发 情 人工授精胚胎回收鲜胚冻胚受体母畜 自 然 发 情 同期发情处理发情胚胎移植妊娠良种小畜培育良种母畜良种青年公畜培育良种公畜杂交改良市场良种精液市场冷冻杂交母畜杂交公畜市场胚胎移植技术产业化发展思路体内胚胎体内胚胎null自然繁殖与应用胚胎移植技术一年后直接经济效益比较本部分内容到此结束本部分内容到此结束nullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnullnull谢谢大家 敬请指教谢谢大家 敬请指教