葛根散等3首解酒方对急性酒精中毒小鼠细胞因子水平的影响

3． 3 清除羟基自由基研究结果 正交提取得到的金银花叶中总 黄酮经柱色谱提纯后进行清除羟自由基研究，实验结果见图 3 所 示。从图 3 中可以看出，金银花叶中总黄酮提取液对由 Fenton 体系产生的·OH 有一定的清除作用，随着溶液中金银花叶总黄 酮含量的增加，总黄酮对·OH 的清除能力也逐渐增强，当总黄 酮浓度在 107． 30 ～ 160． 95 μg /ml 之间时，自由基清除率保持在 较高的水平，最高达到 92． 22%。 图 3 羟自由基的清除作用 4 结论 本实验通过正交实验的研究，确定了金银花叶中总黄酮的最 佳提取工艺条件:以 40%乙醇为提取溶剂，采用料液比为 1∶ 20 (m∶ V) ，在 80 ℃下提取 3 h，得到金银花叶中总黄酮单位浸出量 为 111． 03 mg /g。同时进行了精密度，稳定性，重现性和加样回收 率实验，建立了比色法测定金银花叶中总黄酮的含量的方法，该 方法简便、稳定、灵敏性高，适用于对植物中总黄酮类物质的快速 测定。使用 D101 大孔吸附树脂对乙酸乙酯总黄酮萃取液进行 分离提纯，实验中出现了明显的洗脱峰，当洗脱体积为 4 倍柱体 积时总黄酮基本被洗脱下来，此时洗脱率为 102． 17%。此外本 实验还探讨了金银花叶中总黄酮对Fenton体系产生的·OH的 清除作用，表明金银花具有较强的抗氧化性能，为进一步开发综 合利用金银花叶中总黄酮提供了科学依据。 参考文献: ［1］ 王 倩，王建新，于治国，等．金银花药材高效液相色谱指纹图谱研 究［J］．中成药，2005，27(7) :751． ［2］ 王丽婷，杨敏丽．高效液相色谱法同时测定金银花及叶中的黄酮类 物质［J］．时珍国医国药，2007，18(8) :1850． ［3］ 杨 波．黄酮类化合物对心血管系统的作用［J］．岭南心血管病杂 志，2004，10(2) :144． ［4］ 丁利君，吴振辉，蔡创海，等．金银花中黄酮类物质最佳提取工艺的 研究［J］．食品科学，2002，23(2) :62． ［5］ 刘军海．杜仲叶中总黄酮类成分提取工艺研究［J］．食品研究与开 发，2006，27(8) :129． ［6］ 黄 雄，李松林，李 萍，等． HPLC 法同时测定金银花中 8 种黄酮 的含量［J］．药学学报，2005，40 (3) :285． ［7］ 邢俊波，李会军，李 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与正常对照组比较，模型对照组小鼠各项指标均明 显升高(P ＜ 0． 01) ;与模型对照组比较，葛根散等 3 首方剂在一定剂量下都能明显降低小鼠血清 TNF － α、IL － 1β、IL － 6、 IL － 8 水平及肝脏 TNF － α mRNA、IL － 1β mRNA、IL － 6 mRNA表达(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01，石膏汤对小鼠血清 IL － 1β的 影响除外:P ＞ 0． 05) ，只有葛根散大剂量组能明显降低小鼠肝脏 IL － 8 mRNA的阳性表达(P ＜ 0． 05)。结论 葛根散等 3 首方剂能调节细胞因子水平，对减轻细胞因子失调产生的损伤效应有重要作用，这可能与该 3 首方剂的解酒机制有关。 关键词:葛根散; 石膏汤; 葛花解酲汤; 细胞因子 DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 05． 061 中图分类号:R285． 5 文献标识码:B 文章编号:1008-0805(2011)05-1171-03 ·1711· LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 5 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期 近年来随着我国经济的发展，人均酒精消耗量不断增加，急 性酒精中毒的发病呈上升趋势，酒精已成为继病毒性肝炎后导致 肝损害的第二大病因［1］。研究表明，肝损伤的发生机制可分为 化学性和免疫性，化学机制主要通过细胞色素 P450 及结合反应 产生的中间代谢产物产生损伤，免疫机制则通过细胞因子、一氧 化氮、补体及免疫变态反应等产生损伤，特别是细胞因子在其发 病机制中的作用越来越受到重视［2］。祖国医学在酒精中毒的防 治方面具有悠久的历史。在前期研究中，我们初步筛选出了葛根 散(金·张子和《儒门事亲》)、石膏汤(解酒验方)、葛花解酲汤 (元·李东桓《脾胃论》)等 3 个能有效保护肝功能经方 /验方(另 文发表)。本研究旨在通过观察上述方剂对急性酒精中毒小鼠 TNF － α、IL － 1β、IL － 6、IL － 8 等细胞因子水平的影响，为进一步 阐明这些方剂防治酒精中毒的作用机制提供实验依据。 1 材料 1． 1 动物 SPF 级昆明雄性小鼠 110 只，体质量 18 ～ 22 g，由上 海斯莱克实验动物有限责任公司提供［许可证号:SCXK(沪) 2007 － 0005］。 1． 2 药材与试剂 实验方剂包括葛根散(金·张子和《儒门事 亲》)、石膏汤(解酒验方:石膏 12 g、葛根 10 g、干姜 6 g)、葛花解 酲汤(元·李东桓《脾胃论》) ，组方药材购自上海同仁堂大药房， 按原方比例制备水煎剂(生药浓度为 1 g /ml)备用。56%(V /V) 红星二锅头白酒(北京红星股份有限公司，批号 090309) ;TNF － α，IL － 1β，IL － 6，IL － 8 酶联检测试剂盒均由上海晶美生物有限 公司提供;TNF － α，IL － 1β，IL － 6，IL － 8 原位杂交试剂盒由武汉 博士德生物工程有限公司提供。 1． 3 仪器 AB135 － S型梅特勒托利多电子天平(梅特勒托利多 上海公司) ;DG3021 酶联免疫检测仪 (美国 BIO － TEK 公司) ; TG16 － WS型低温离心机(中国湘仪)。 2 方法 2． 1 动物分组与给药 参照文献方法［3］。将小鼠随机分为 11 组，每组 10 只，分别为正常对照组、模型对照组、各给药大、中、小 剂量组。根据动物药理实验用药折算方法，以成人常规用量折算 实验小鼠用药量，给药组以不同剂量的中药水煎剂灌胃，分别为: 葛根散 0． 2，0． 1，0． 05 g(生药)/10 g(体质量) ;石膏汤 0． 1，0． 05， 0． 025 g(生药)/10g(体质量) ;葛花解酲汤 0． 4，0． 2，0． 1 g(生 药)/10g(体质量) ，1 次 /d，正常对照组和模型对照组代以等量蒸 馏水，30 min后，模型对照组和各给药组用 56%(V /V)红星二锅 头白酒灌胃，0． 15 ml /10 g，1 次 /d，正常对照组代以等量蒸馏水。 连续灌胃 10 d。所有动物均按常规饲养。 2． 2 检测指标 末次灌胃 12 h 后开始禁食(不禁水) ，24 h 后眼 眶采血，分离血清待用;采血后，快速断颈处死，取肝脏右叶小块 组织，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片。血清细胞因子 TNF － α、IL － 1β，IL － 6，IL － 8 水平及肝组织 TNF － α mRNA，IL － 1β mRNA，IL － 6 mRNA，IL － 8 mRNA 表达的检测均按试剂盒 说明书操作。原位杂交检测判断标准:TNF － α，IL － 1β，IL － 6 和 IL － 8 mRNA的阳性表达在细胞浆，呈棕黄色着色。结果评定标 准参照文献［4］，根据着色程度及着色细胞阳性范围进行计算， 阳性强度:不着色者为 0 分，着色淡者为 1 分，中等着色为 2 分; 着色深者为 3 分。着色细胞阳性范围:无着色为 0 分，着色阳性 细胞小于 1 /3 为 1 分，着色阳性细胞 1 /3 ～ 1 /2 为 2 分，着色阳性 细胞 ＞ 1 /2 为 3 分。将每张切片着色程度与着色细胞阳性范围 得分各自相加为其最后计分。 2． 3 统计分析 应用 SPSS11． 5 软件进行数据分析，计算结果以 珋x ± s表示，组间采用 t检验。 3 结果 本研究在统计各方对实验动物细胞因子水平的影响时，以各 方最佳效果剂量组作为参比组。有关实验结果如下。 3． 1 小鼠血清 TNF － α、IL － 1β、IL － 6 和 IL － 8 水平的检测结果 见表 1。与模型对照组比较，3 首方剂在一定剂量下都能显著降 低小鼠血清细胞因子 TNF － α、IL － 1β(石膏汤除外:P ＞ 0． 05)、 IL － 6 和 IL － 8 的水平(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ，且与正常对照组 接近(P ＞ 0． 05，石膏汤对 IL － 1β 的影响除外:P ＜ 0． 05)。各有 效方剂最佳效果剂量组之间比较，对各项检测指标的影响无明显 差异(P ＞ 0． 05)。 表 1 各组小鼠血清细胞因子水平的变化(珋x ± s) 组别 n TNF － α /pg·ml －1 IL － 1β /pg·ml －1 IL － 6 /pg·ml －1 IL － 8 /pg·ml －1 正常对照 10 144． 19 ± 55． 613) 46． 15 ± 11． 723) 81． 42 ± 38． 223) 35． 16 ± 9． 513) 模型对照 9 281． 24 ± 67． 39c) 88． 43 ± 31． 56c) 159． 23 ± 58． 97c) 58． 28 ± 10． 30c) 葛根散大剂量 9 167． 21 ± 53． 57■□3)a) 57． 24 ± 18． 33■□2)a) 89． 35 ± 38． 81■□3)a) 38． 57 ± 8． 84□3)a)* 葛根散中剂量 10 186． 07 ± 40． 42 64． 92 ± 23． 17 106． 82 ± 42． 47 44． 36 ± 12． 70 葛根散小剂量 9 206． 53 ± 42． 08 73． 51 ± 28． 24 127． 20 ± 31． 41 52． 18 ± 18． 55 石膏汤大剂量 9 174． 78 ± 51． 91□3)a)* 71． 97 ± 30． 12□1)b)* 108． 43 ± 25． 64□2)a)* 43． 33 ± 15． 61□2)a)* 石膏汤中剂量 8 189． 45 ± 47． 34 78． 07 ± 33． 62 136． 09 ± 40． 12 48． 64 ± 20． 04 石膏汤小剂量 8 220． 75 ± 66． 08 83． 63 ± 34． 91 141． 56 ± 29． 66 60． 19 ± 24． 12 葛花解酲汤大剂量 10 186． 07 ± 54． 41 59． 15 ± 20． 44□2)a)* 92． 51 ± 34． 80□3)a)* 37． 22 ± 11． 54■□3)a) 葛花解酲汤中剂量 8 170． 13 ± 56． 27□3)a)* 67． 62 ± 19． 86 114． 81 ± 41． 14 46． 78 ± 13． 09 葛花解酲汤小剂量 9 210． 76 ± 72． 71 77． 05 ± 33． 08 121． 74 ± 45． 11 51． 61 ± 15． 28 n为各组除去死亡动物之后实际检测数(动物死亡原因包括醉死或操作意外死亡) ;■本指标最佳效果方剂;□本方剂本指标最佳效果剂量;与正 常对照组比较，a)P ＞ 0． 05，b)P ＜ 0． 05，c)P ＜ 0． 01;与模型对照组比较，1)P ＞ 0． 05，2)P ＜ 0． 05，3)P ＜ 0． 01;与本指标最佳效果方剂比较，* P ＞ 0． 05 3． 2 小鼠肝组织 TNF － α mRNA、IL － 1β mRNA、IL － 6 mRNA、IL － 8 mRNA表达的检测结果 见表 2。正常对照组少数小鼠肝组 织中门静脉及中央静脉周围细胞有少量 TNF － α mRNA、IL － 1βmRNA、IL － 6 mRNA、IL － 8 mRNA表达，着色较淡;模型对照组 小鼠肝组织 TNF － α mRNA、IL － 1βmRNA、IL － 6 mRNA、IL － 8 mRNA分布于肝细胞、汇管区及中央静脉周围等，着色深。与模 型对照组比较，3 首方剂在一定剂量下都能显著降低小鼠肝脏 TNF － α mRNA、IL － 1β mRNA 和 IL － 6 mRNA 的阳性表达(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01) ;与模型对照组比较，只有葛根散大剂量组能明 显降低小鼠肝脏 IL － 8 mRNA的阳性表达(P ＜ 0． 05) ;各有效方 剂最佳效果剂量组之间比较，对以上各项检测指标的影响无显著 差异(P ＞ 0． 05)。 ·2711· 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 5 表 2 各组小鼠肝组织 TNF － αmRNA、IL － 1β mRNA、IL － 6mRNA、IL － 8mRNA的表达(珋x ± s) 组别 n TNF － α mRNA IL － 1β mRNA IL － 6 mRNA IL － 8 mRNA 正常对照 10 0． 50 ± 0． 533) 0． 40 ± 0． 523) 0． 40 ± 0． 703) 0． 30 ± 0． 483) 模型对照 9 4． 78 ± 0． 67c) 4． 56 ± 0． 88c) 4． 44 ± 0． 88c) 4． 33 ± 0． 71c) 葛根散大剂量 9 2． 89 ± 0． 93■□ 3)c) 3． 00 ± 0． 71■□ 3)c) 2． 89 ± 0． 78■□ 3)c) 3． 22 ± 0． 97■□ 2)c) 葛根散中剂量 10 3． 20 ± 0． 63 3． 30 ± 0． 68 3． 10 ± 0． 74 3． 50 ± 0． 97 葛根散小剂量 9 3． 44 ± 0． 88 3． 56 ± 1． 01 3． 44 ± 0． 88 3． 67 ± 0． 71 石膏汤大剂量 9 3． 78 ± 0． 97□ 2)c)* 3． 33 ± 0． 71 3． 22 ± 0． 67□ 3)c)* 3． 89 ± 0． 60□ 1)c)* 石膏汤中剂量 8 4． 13 ± 0． 64 3． 25 ± 0． 89□ 3)c)* 3． 38 ± 0． 92 4． 00 ± 0． 76 石膏汤小剂量 8 4． 38 ± 0． 52 3． 75 ± 1． 04 3． 63 ± 0． 92 4． 25 ± 0． 46 葛花解酲汤大剂量 10 3． 00 ± 0． 67□ 3)c)* 3． 10 ± 0． 74□ 3)c)* 2． 90 ± 0． 74□ 3)c)* 3． 70 ± 0． 68□ 1)c)* 葛花解酲汤中剂量 8 3． 13 ± 0． 64 3． 25 ± 1． 04 3． 13 ± 0． 84 3． 88 ± 0． 84 葛花解酲汤小剂量 9 3． 33 ± 1． 00 3． 44 ± 1． 13 3． 44 ± 0． 88 4． 11 ± 0． 60 n为各组除去死亡动物之后实际检测数(动物死亡原因包括醉死或操作意外死亡) ;■本指标最佳效果方剂;□本方剂本指标最佳效果剂量;与正 常对照组比较，a)P ＞ 0． 05，b)P ＜ 0． 05，c)P ＜ 0． 01;与模型对照组比较，1)P ＞ 0． 05，2)P ＜ 0． 05，3)P ＜ 0． 01;与本指标最佳效果方剂比较，* P ＞ 0． 05 4 讨论 急性酒精中毒，俗称酒醉，是指饮入过量的酒精或酒类饮料 后所引起的中枢神经系统兴奋及随后的抑制状态，目前已成为损 害人体健康的重要因素之一。肝脏是酒精损害最主要的脏器，随 着研究酒精性肝损伤发生发展机制的不断深入，细胞因子所起的 作用越来越受到重视，并成为研究热点。其中，TNF － α、IL － 1β、 IL － 6、IL － 8 等细胞因子主要介导了肝组织的损伤。TNF － α 在 肝脏主要由库普弗细胞产生，被广泛认为是导致肝细胞炎症和肝 细胞死亡的主要细胞因子。TNF － α作为炎性细胞因子诱导肝细 胞坏死和凋亡，趋化中性粒细胞和淋巴细胞浸润。有研究表 明［5］，TNF － α可导致肝脏线粒体形态异常，抑制线粒体的正常 呼吸功能，促进 IL － 1、IL － 6 等其他细胞因子的分泌，导致肠腔 渗透性增加和自由基的产生，从而加重肝组织的炎症和损伤。IL － 1β是 IL － 1 基因家族成员之一，它不仅能够协同其他细胞因 子促进 B、T 细胞活化，而且能够诱导其他炎性介质产生。IL － 1β的过度表达是引起肝损伤的重要因素之一。IL － 6 系肝损伤 急性期细胞因子，在酒精的刺激下由库普弗细胞等产生，与 IL － 1、TNF － α等一起参与肝细胞的变性、坏死。在酒精性肝损伤病 人，可见血清 IL － 6 水平的明显增高［6］。IL － 8 由 TNF － α、IL － 1 等诱导产生，为中性粒细胞活化及趋化性刺激因子，可促使炎症 细胞如活化的中性粒细胞聚集至肝脏而引起炎症。由此可见， TNF － α、IL － 1β、IL － 6、IL － 8 等细胞因子是导致酒精性肝损害 的重要免疫因素。 本实验结果显示(表 1 ～ 2) :与正常对照组比较，模型对照组 小鼠血清 TNF － α、IL － 1β、IL － 6、IL － 8 水平及肝组织 TNF － α mRNA、IL － 1β mRNA、IL － 6 mRNA、IL － 8 mRNA 表达均明显升 高(P ＜ 0． 01) ，提示酒精导致小鼠出现了明显的细胞因子水平失 调。与模型对照组比较，3 首方剂在一定剂量下都能明显降低小 鼠血清 TNF － α、IL － 1β、IL － 6、IL － 8 水平及肝脏 TNF － α mR- NA、IL － 1β mRNA、IL － 6 mRNA表达(P ＜ 0． 05 或 P ＜ 0． 01，石膏 汤对小鼠血清 IL － 1β的影响除外:P ＞ 0． 05) ，提示 3 首方剂对减 轻细胞因子产生的损伤效应可能具有重要作用。与模型对照组 比较，只有葛根散大剂量组能明显降低小鼠肝脏 IL － 8 mRNA的 阳性表达(P ＜ 0． 05) ，提示 3 首方剂降低血清细胞因子水平的原 因不只是源于对肝组织细胞因子表达的影响。实验结果还显示， 各有效方剂对各项指标的影响无明显差异(P ＞ 0． 05) ，各项指标 降低幅度最大的情况集中在葛根散和葛花解酲汤，我们前期实验 研究发现，3 首方剂中葛根散和葛花解酲汤对乙醇致小鼠急性肝 损伤的保护作用最明显，综合本实验结果，提示葛根散和葛花解 酲汤对肝脏的保护作用比石膏汤强。 我国防治酒伤的历史悠久，有关酒伤防治的方药较多，葛根 散、葛花解酲汤、石膏汤均为中医药治疗酒伤的常用方剂，其中葛 根散和葛花解酲汤是解酒经典名方，石膏汤为近代解酒验方。本 文研究以上方剂对实验小鼠细胞因子水平的影响，初步探讨了 3 首方剂防治急性酒精中毒的部分免疫学机制，为该 3 首方剂的进 一步深入研究和临床应用提供了实验依据。 参考文献: ［1］ 庄 辉．酒精性肝病的流行病学［A］．江正辉，王泰龄．酒精性肝病 ［M］．北京:中国医药科技出版社，2001:3． ［2］ 沈 洪，张 蓓．急性肝损伤研究进展［J］．现代中西医结合杂志， 2009，18(18) :2211． ［3］ 邓 源，袁伯俊，张淑英．解酒灵对乙醇致鼠肝急性损伤的保护作 用及机制的探讨［J］．中国新药杂志，2000，9(6) :388． ［4］ 张 洁，陈芝芸，严茂祥，等．三七对酒精性脂肪肝大鼠肝脏 TNF － α、IL － 6、IL － 8 基因表达的影响［J］． 中华中医药学刊，2009，27 (7) :1457． ［5］ 许东升．酒精性肝病发病机制的研究概况［J］． 胃肠病学，2004，9 (1) :49． ［6］ Tiberio G A，Tiberio L BenenttiA，et al． Interleukin － 6 sustains hepatic R egeneration in cirrhoticra［J］． Hepatogastroenterolog，2007，54 (75) :878． ·3711· LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 5 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 5 期