磷酸钙转染法

磷酸钙转染法 ： 质粒 DNA 指数生长的真核细胞 2 M CaCl2 2×HBS （pH 7.05） : 2×HBS （pH7.05）：900 ml超纯水中加入 NaCl 16.3 g, KCl 0.74 g, Na2HPO4 0.214 g，Glucose 2.4 g和 HEPES 10 g，调 pH至 7.05，定容至 1 升，过滤（0.2 μm滤 膜）后储存于 4℃备用。 方法： 1. 细胞分盘： 通过胰酶消化收集细胞，用适当的完全培养基以 1×105至 4×105 细胞/cm2的密度平铺细胞于 60 mm组织培养皿上（根据实验需要选择培养皿， 使细胞贴壁后所占面积达到培养皿总面积的 40－70％）。将细胞置于含 5％ CO2的 37℃温箱中孵育 8-24 h,当细胞贴壁完全后即可开始转染。转染前 2 h换 液（用 4 ml新鲜的完全培养基置换旧的培养基）。 注：为得到较高的转染效率，尽量使用指数生长的细胞，转染时细胞的密度不 超过 80％。 2. 制备磷酸钙－DNA沉淀：以 60 mm组织培养皿用 500 μl反应总体积为例。在 灭菌水中加入质粒 DNA（总量 4－10 μg为佳），再加入 31 μl 2 M CaCl2，使三 者总体积达到 250 μl，混匀。将等体积 2×HBS盐溶液逐滴加入，同时轻弹管 壁，使每滴加入后及时混匀。静置 2 min后，立即将这 500 μl的磷酸钙－DNA 悬液逐滴加入上述单层细胞的细胞培养基中，轻轻摇动平皿混匀。 注：可以观察到滴入的部位培养基瞬间会出现浑浊的橘黄色，应尽快将其混匀， 避免形成过大的颗粒，影响转染效率。 3．若转染的细胞不用转染促进剂处理，则置于含 5％ CO2的 37℃温箱孵育。8 h 后吸去培养基与 DNA沉淀，加入 5 ml 37℃预热的完全培养基，继续将细胞放 置温箱孵育，16-40 h观察其转染效率。 参考：分子克隆实验指南第三版（p1284～1285）