线粒体与细胞凋亡调控

生命科学 Chinese Bulletin of Life Sciences 第 20卷 第 4期 2008年 8月 Vol. 20, No. 4 Aug., 2008 线粒体与细胞凋亡调控 朱玉山1， 佺陈　 1,2* (1南开大学生命科学学院，天津 300071；2中国科学院动物研究所， 生物膜与膜生物国家重点实验室，北京 100101) 摘　要：细胞凋亡是一个受到一系列相关基因严格调控的细胞死亡过程。线粒体是细胞凋亡调控的活 动中心。在凋亡因子的刺激下，线粒体释放出不同促凋亡因子如细胞色素 C、Smac/Diablo等，激活 细胞内凋亡蛋白酶 Caspase。我们发现，活化后的 Caspase可以反过来作用于线粒体，引发更大量线 粒体细胞色素 C的释放，构成细胞色素 C释放的正反馈调节机制，从而导致电子传递链的中断、膜电 势的丧失、胞内 ROS的升高以及线粒体产生 ATP功能的完全丧失。Bcl-2家族蛋白在细胞色素 C释放 和细胞凋亡调控中起关键作用。 关键词：线粒体；细胞色素 C；细胞凋亡；C a s p a s e；B cl - 2 中图分类号：Q2 44；Q2 55　　文献大标题：A Mitochondria and apoptosis regulation ZHU Yu-shan1, CHEN Quan1,2* (1 College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2 National Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China) Abstract: Apoptosis is a highly regulated form of programmed cell death, which plays a key role in the development and homeostasis of multicellular organisms. Mitochondria play a central role in the regulation of apoptotic cell death. Upon death stimuli, different apoptogenic factors such as cytochrome c and Smac/Diablo are released during the early stages of apoptosis. A small amount cytochrome c may be sufficient for activating caspases. Once activated, caspases can positively feedback to attack mitochondria leading to a more profound loss of cytochrome c and consequently mitochondrial dysfunction. This caspase-mediated late stage of cyto- chrome c release causes the complete disruption of mitochondrial electron transport chain, leading to the increase in cellular ROS and complete loss of ATP generation, late stage of apoptotic events or secondary necrosis. Bcl-2 and its family proteins are important for regulating cytochrome c release and apoptotic processes. Key words: mitochondria; cytochrome c; apoptosis; caspase; Bcl-2 文章编号 ：1004-0374(2008)04-0506-08 收稿日期：2008-07-17 基金项目：“973”项目(2006CB910102) ；国家自 然基金项目(30630038 & 30400098) ；科学院知识创 新项目(KSCX2-YW-R-02) *通讯作者：E-mail: chenquan@nankai.edu.cn “细胞凋亡(apoptosis)”是“程序性细胞死亡 (programmed cell death)”的一种形式之一，是细 胞一种生理性、主动性的细胞“自杀行为”。 细 胞程序化死亡最早是由 Lockshin和Wiliams在 1965 年提出。随后在 1972年Kerr等从形态学的角度描 述了细胞的生理死亡，并将这种细胞死亡命名为凋 亡(apoptosis)。细胞凋亡是机体在生长、发育和受 到外来刺激时清除多余、衰老和受损伤的细胞以保 持机体内环境平衡和维持正常生理活动过程的一种 自我调节机制。这种调节机制的异常与多种疾病的 发生有关，如癌症的发生与细胞凋亡的抑制有关， 而老年性痴呆与神经细胞凋亡过度有关。目前对细 胞凋亡的研究已经涉及到肿瘤生物学、发育生物 507第4期 朱玉山，等：线粒体与细胞凋亡调控 学、神经生物学、免疫生物学等方面，已经取得 很多突破性的成果。2002年诺贝尔生理学或医学奖 分别授予来自英国的 Sydney Brenner、来自美国的 H. Robert Horvitz和来自英国的 John E. Sulston，以 表彰他们发现了在器官发育和“程序性细胞死亡” 过程中的基因调控。 1　线粒体与细胞凋亡 细胞凋亡受到一系列相关基因严格调控。不同 的凋亡信号在细胞中引发不同的凋亡信号转导通 路。根据凋亡信号的来源可以将细胞凋亡信号转导 通路分成两条：外源通路(死亡受体通路)和内源通 路(线粒体通路)。这两条通路最后都汇集于下游的 效应 Caspase，即凋亡蛋白酶 Casapse的激活。活 化 Caspase在细胞中能够切割 400 多种底物，如 Lamins、信号分子如蛋白激酶、骨架蛋白、DNA 修复酶以及包括调控mRNA剪切、DNA复制的功能 蛋白。这些重要蛋白质的降解和核酸酶的激活最终 导致细胞凋亡[1]。 线粒体是细胞的能量工厂，是真核细胞生存的 基础。越来越多的实验证据表明，线粒体是细胞凋 亡调控的活动中心。线粒体在细胞凋亡中的作用主 要表现为 [ 2 ]：第一，在凋亡发生过程中，多种促 进细胞凋亡的蛋白转移至线粒体，从而使线粒体膜 的通透性和完整性受到破坏。由于内膜对氢离子的 通透性增加引起线粒体膜电位消失； Bcl-2家族蛋 白主要通过调节线粒体的功能来调控细胞的凋亡； 第二，有多种凋亡诱导因子从线粒体释放，如细胞 色素 C(cytochrome c)、AIF(apoptosis-inducing factor)、Smac/Diablo(second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP binding protein with low pI)和 Caspase前体蛋白 procaspase-2,-3,-8和 -9等在 凋亡发生过程中从线粒体膜间隙被释放到细胞质 中，随后引起典型的凋亡变化；第三，有一些凋 亡诱导物能够诱导线粒体上的膜透过性转变孔 (permeability transition pore，PTP)开放，导致线粒 体膜电位消失和释放促凋亡蛋白。 由于诱变剂﹑化疗药物和电离辐射造成细胞内 不可修复的基因组损伤会激活凋亡的内源通路，即 线粒体通路。线粒体这种特殊的细胞器在其中起着 关键性的调控作用。在多种形式的刺激信号作用于 线粒体后，将会引起线粒体释放细胞色素 C[3]、AIF [4]、Smac/Diablo[5]和 procaspase-2,-3,-8和 -9[6,7]等促 凋亡因子。最新研究发现，线粒体在凋亡发生时还 可能释放一种核酸内切酶 endonuclease G[8,9]。Endo- nuclease G的相对分子质量为 26 k，以同源二聚体 形式存在并行使其功能，它能选择性地在鸟嘌呤富 集区(dG)n (n=9)切割DNA双链。 细胞色素C从线粒体被释放出来后，与Apaf-1 (apoptosis protease activating factor-1)在ATP/dATP 存在下发生构像变化并形成巨大的复合体(700 k/1.4 M)，称为凋亡体(apoptosome)，同时凋亡体吸引 Caspase-9前体加入该复合体，Caspase-9前体聚合 后被反式催化激活。活化的 Caspase-9继而作用于 下游的效应 Caspase(Caspase-3,-6和 -7)，引起细胞 凋亡。AIF是一种不依赖于 Caspase的凋亡效应因 子，当它从线粒体释放出来，并从细胞质移位至细 胞核时，会引起染色质凝集，并将DNA降解为 50 Kb的大片断[6,7,10-13]。 在细胞中还存在一些抑制凋亡蛋白IAP(inhibitor of apoptosis proteins)，它们可以与细胞色素 C和 Apaf-1激活的 Caspase-9结合，并且阻止活化的 Caspase-9激活 Caspase-3前体蛋白，使凋亡不能进 行下去。Smac/Diablo在凋亡发生时与细胞色素C一 起被释放，它能与 IAP 等抑凋亡蛋白结合，释放 Caspase-9，Caspase-9随后激活 Caspase-3，使凋 亡进行下去。另外，这些 I A P 蛋白不但能抑制 Caspase的活性，而且能介导Caspase在细胞内的降 解过程，维持 Caspase在细胞内的合适含量，可防 止由于细胞中少量Caspase的意外激活而导致的细胞 凋亡 [ 1 4 ]。 内源和外源两条凋亡通路并不是孤立存在的， 它们互相之间存在着交流(cross-talk)。细胞膜上的 死亡受体与配体结合后引起 Caspase-8的激活，活 化的 Caspase-8能切割Bid。Bid是Bcl-2家族中的一 种促凋亡蛋白，切割后产生的羧基端片段(tBid)可以 转移到线粒体，与线粒体外膜结合并随后引起线粒 体释放细胞色素 C等促凋亡物质，从而引发典型的 凋亡反应[15,16]。 2　线粒体细胞色素C释放 线粒体是调控细胞凋亡的中心，细胞色素C释 放是线粒体凋亡途径的标志事件。关于细胞色素 C 释放的机制，目前有不同的假说，但尚无定论。第 一种是 Bax依赖的线粒体外膜通透模型。鉴于 Bax 和Bak等在细胞色素C释放中的不可或缺的作用，有 人提出 Bax可以在线粒体膜上形成多聚体并形成大 通道使细胞色素 C等促凋亡物质从线粒体内外膜之 间释放[17,18]。也有人提出，Bax和 Bak等正常情况 下能与抑凋亡蛋白分子 Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1相互结 508 生命科学 第20卷 合。而仅含 BH3结构域的 Bcl-2家族促凋亡蛋白 tBid、Bim等能与 Bcl-2/Bcl-xL/Mcl-1相互作用，使 Bax/Bak等从抑凋亡蛋白游离，进而形成多聚体， 促使线粒体膜通透，导致细胞色素C释放。Shimizu 等[19]认为 Bax或Bak与VDAC结合后，可以调节线 粒体的膜电位，并导致细胞色素 C从 Bax/Bak和 VDAC共同形成的大通道释放，该小组应用电生理 方法检测记录到了这样一个大通道的存在。目前我 们课题组相关研究结果认为细胞凋亡时，Bax从胞 浆转移到线粒体上，促使细胞色素 C释放。同时我 们对 Bax的激活机制研究发现，H2O2处理细胞后， 明显观察到 Bax从胞浆转移到线粒体上，同时伴随 细胞核的破碎和皱缩。同时，发现 Bax的 62位半 胱氨酸是其转位所必需的，而 126位半胱氨酸对其 转位没有作用[20]。也有研究报道发现 Bid/tBid也可 以在人工脂质体或平面膜上形成通道，Bid/tBid形成 的通道有可能参与Bid/tBid诱导的线粒体释放细胞色 素 C 的过程[21,22]。尽管如此，我们还观察到，在 Bax/Bak缺失的细胞中，棉酚仍能诱导细胞色素C释 放，很可能是通过诱导 Bcl-2构象变化来促进线粒 体细胞色素 C释放。这说明 Bax和 Bak对线粒体细 胞色素 C释放不是绝对必需的。第二种模型认为， PTP参与的外膜破裂，PTP开放使线粒体肿胀，外 膜破裂，引起内外膜间细胞色素 C 释放。 3　Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡 在细胞凋亡过程中，Bcl-2家族蛋白起着至关 重要的调节作用。对于 Bcl-2家族蛋白的研究是细 胞凋亡研究领域中最为热门的课题之一。 Bcl-2、Bcl-xL等细胞凋亡负调因子在许多类型 的细胞受到外界刺激时能保护细胞免于凋亡。它们 主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜 上。其疏水性 C末端定位于细胞内膜系统上，而N 末端朝向细胞质。与膜的结合对于其发挥功能是极 其重要的。实验表明，失去膜定位能力的 Bcl-2蛋 白的抗凋亡能力减弱了许多[23,24]。BH4结构域是Bcl- 2等抗凋亡蛋白所特有的(Bcl-Xs除外)。虽然BH4不 是形成二聚体所必需的区域，但它的缺失或使蛋白 质丧失功能，或产生一个促凋亡而不是抗凋亡的突 变体[25]。这说明 BH4对于 Bcl-2或 Bcl-xL发挥其抗 凋亡功能是必需的。 线粒体膜上的Bcl-2至少在三个水平上发挥功能 来抑制凋亡：(1)主要通过与 Bax/Bak相互作用来抑 制细胞凋亡；Bax是一种可溶性的蛋白分子，主要 位于细胞质中，但当凋亡发生时，它能从胞浆转移 到线粒体并与线粒体膜相结合[26]。实验证明，位于 线粒体膜上的Bcl-2能与Bax相互作用，而后者也必 须在线粒体上才能发挥其诱导凋亡的作用。同时把 微量的重组 Bax加入到分离的线粒体中能够诱导细 胞色素 C的释放和 Caspase激活，而只含有 Bax的 BH3结构域的多肽则没有这种功能。Bax与Bcl-2相 反，能促进 PTP开放，并促进线粒体促凋亡因子 的释放，Bax的促凋亡作用能被 Bcl-2所抑制。并 且，只有定位于线粒体上的 Bcl-2和 Bcl-xL才能拮 抗 Bax蛋白和阻止细胞色素 C释放、Caspase激活 和凋亡，Bcl-2∆TM则无此功能[27]；(2)Bcl-2能改变 线粒体巯基的氧化还原状态来调控线粒体膜电位从 而调控细胞凋亡。在细胞凋亡过程中，线粒体的巯 基可能组成了胞内氧化还原电位的传感器，Bcl-2可 能是通过抑制谷胱甘肽(GSH)的外泄，降低胞内的 氧化还原电位来抑制细胞凋亡的；(3)Bcl-2能通过抑 制 PTP开放来抑制促凋亡蛋白从线粒体中释放，从 而保护细胞免于凋亡；有证据显示，Bcl-2还能将 凋亡蛋白前体Apaf-1等定位至线粒体膜上，使其不 能发挥促凋亡作用。 通过质膜研究发现Bax能够在脂质双层形成孔 道，促进脂质体包埋的荧光素释放，同时这一过程 被 Bcl-2所抑制。Narita发现在分离的线粒体体系 下，Bax和 Bak与 PTP的组分VADC结合而促进细 胞色素 C释放，细胞色素 C释放会引起如膜电势的 丧失、细胞器的肿大等典型的 PTP改变。上述过 程都是线粒体依赖的和能够被CsA和Bongkrekic acid 所抑制，抗VADC抗体也能够抑制Bax诱导的细胞 色素 C的释放和膜电势的丧失。也有研究发现与以 上结果相反通过镁离子促进介导细胞色素 C 的释 放。以上研究说明体内存在至少有两种不同的细胞 色素C释放机制：一种是钙离子介导的并被CsA抑 制的途径，另一种是 Bax依赖和镁离子介导而非 CsA所抑制的途径[28]。 许多实验结果证明，Bax在凋亡信号诱导下可 以发生构像变化(conformational change)，从而能够 直接结合到线粒体上形成 Bax寡聚体孔道，诱导细 胞色素 C 释放 [ 2 9 - 3 1 ]。据报道，全长的 B i d 和经 Caspase-8切割形成的 tBid能够诱导Bax发生构像变 化，而Bcl-2则能够通过与Bax竞争结合形成异源二 聚体抑制细胞凋亡。Bax和Bcl-2之间尽管存在着竞 争，它们也可能独立地调控细胞凋亡。 4　Caspase的活化与线粒体结构蛋白 最近的研究表明，活化的 Caspase-3可以反过 509第4期 朱玉山，等：线粒体与细胞凋亡调控 来作用于线粒体，引发线粒体细胞色素 C的释放， 细胞色素C经Caspase级联反应又可以激活Caspase- 3，构成细胞色素C释放的正反馈调节机制[32,33]。我 们最近发现线粒体复合物III的一个亚基能够被活化 的Caspase-3特异性切割介导细胞色素C的释放。线 粒体细胞色素C释放会促进相应的Caspase激活，同 时激活的 Caspase直接攻击线粒体，进一步引发更 多的促凋亡因子从线粒体释放，从而形成凋亡信号 的正反馈。线粒体在这里成为细胞凋亡信号的放大 器。我们以前的实验结果显示，在凋亡早期只有少 量的细胞色素 C的释放，线粒体保持氧化磷酸化功 能，提供凋亡需要的能量；一旦 Caspase激活后反 馈攻击线粒体从而导致更多的线粒体细胞色素 C释 放到胞浆中，导致凋亡信号放大，细胞线粒体功能 丧失和细胞死亡。 Ricci等[34]发现线粒体复合物I的一个亚基p75能 够被Caspase-3切割为相对分子质量为 47k和 28k两 个片段，进而影响细胞色素 C的释放和 ROS的产 生。颗粒酶A能够通过切割新线粒体复合物 I的亚 基 -基质蛋白NDUFS3作用于线粒体，从而介导线 粒体ROS的产生和膜电势的丧失，特异性表达到其 突变体能够抑制颗粒酶A诱导的细胞凋亡，但是颗 粒酶 B却能够使之诱导凋亡[35]。 凋亡的过程是通过激活如 C a s p a s e - 3，- 7 (executioner caspase)和相应底物的切割过程。因 此，凋亡过程中的核心事件就是 Caspase底物的切 割。研究主要集中在理解 Caspase如何识别底物、 如何切割以及如何导致凋亡表型。目前已经知道大 约有 400个蛋白被证明是 Caspase的底物并被其切 割。通过正常细胞与凋亡细胞 2D胶比较会发现几 百个变化蛋白点。虽然这些蛋白不能够完全证实是 Caspase的靶点，但是这种蛋白质组学的方法已经 证实其中有很多是 Caspase的底物[1,36]。 虽然目前很多蛋白被证明是 Caspase的底物并 被切割，但是有些蛋白在凋亡过程中并不被切割或 者很晚才被切割，以及不同细胞结果不同。如 β - actin只有在卵巢癌细胞才被切割，在其他细胞并没 有被切割。同时，切割位点并不是非常保守的，如 Cylin A在蟾蜍的卵母细胞凋亡过程被切割但是其他 哺乳动物细胞并没有发生；还有些蛋白如DNase-X 蛋白序列中含有一个或者多个经典切点，但是在凋 亡细胞中尽管有大量的 Caspase激活也不能够被切 割。而且，多数蛋白如果首先被 Caspase切割，其 他位点也会被其他蛋白酶切割。例如 Ac i nu s 被 Caspase-3切割是非常必要但又不足以激活DNA凝集 活性，为使之全部激活需要一个附加且仍然不知道 的丝氨酸蛋白酶的参与，只有把二者结合起来才能 产生成熟的片段进入细胞核发生核固缩。 4.1　Caspase底物与细胞形态变化　许多蛋白为什么 被 Caspase切割原因是不清楚的，但是有时一些蛋 白水解是与细胞死亡的形态变化紧密联系的。典型 的例子是DNase抑制子 ICAD，Caspase-3切割 ICAD 之后激活 CAD核酸酶介导凋亡的DNA片段化，另 外Acinus与Helicard(DNA螺旋酶)的切割后发生染色 体凝集和细胞核重塑；其他如 Gelsonl i n和激酶 ROCK-1、PAK2的切割与典型的形态——膜出芽有 关，Gelsonlin被 Caspase-3切割产生一个相应活化 片段使 F-actin去寡聚化，而无Gelsonlin表达中性 白细胞凋亡过程中表现膜出芽显著延迟，说明膜出 芽需要 Caspase激活 Gelsonlin介导的 actin识别。 Caspase也可以切割激活ROCK-1导致Myosin轻链的 磷酸化而最终产生膜出芽。 Caspase可以切割破坏细胞骨架蛋白如中间纤维 cytokeratin-18和 Vimentin，或者GAS2和 Plectin， 这些蛋白都与纤维组织有关。这种切割会导致凋亡 细胞形状改变。有研究报道 Caspase攻击大脑皮层 actin网络如Fodrin和中心黏附复合物——胞浆基质 中的肌动纤维和膜蛋白。这些中心黏附复合物有 Cas和 Paxillin，这些蛋白的切割与细胞收缩、细胞 吸附和极其重要的阻断抗凋亡整合蛋白信号传导密 切相关。同时参与细胞黏附、通讯的骨架蛋白还有 β-catenin、E-cadherin、plakoglobin和 desmoglein， 它们都是 Caspase的底物。 在凋亡过程中，经常会发生内质网和高尔基体 结构的破坏，Golgin-160和GRASP65的切割已经被 证明会引起高尔基复合体去组装，Bap31的蛋白水解 会破坏内质网和高尔基复合体之间的物质运输，而 Rabaptin-5或 kinectin的切割会妨碍囊泡的运输加工。 Caspase会切割大量核蛋白并破坏其功能，如 导致 lamina去组装和核孔复合体对物质的运输。通 过对PARP-1、ATM和DNA-PK的切割阻碍对DNA 的修复，会进一步促进凋亡；其他如涉及到 DNA 合成和复制 有关DNA聚合酶Pole、MCM3等。RNA 相关的RNA螺旋酶A和剪切因子U1 70-KDa snRNP 都会导致 RNA合成、加工和运输中断。 4.2　Caspase底物与信号传导通路　大量的信号传导 中的蛋白涉及 Caspase切割，导致功能的抑制或者 中间体的活化。有些已经被确定的 Caspase切割激 510 生命科学 第20卷 活的蛋白会涉及到凋亡信号的放大。Caspases关闭 细胞保护机制而激活细胞死亡信号通路，典型凋亡 抑制子Bcl-2蛋白和Caspase-8的抑制子 c-FLIP能够 被 Caspase切割。Caspase切割 Bcl-2和 Bxl-xL的N 端BH4结构域导致抗凋亡的功能的丧失，甚至转变 为促凋亡因子，相似的还有受体依赖途径的 Caspase-8切割Bcl-2家族Bid产生活化的 tBid诱导细 胞线粒体细胞色素 C的释放。这种抗凋亡与促凋亡 因子之间的转变组成凋亡信号通路的正反馈通路。 在凋亡过程有些转录因子和激酶失去活性，如 Akt和 Raf-1就被 Caspase-3切割导致活性丢失。这 些激酶被促凋亡分子如 Bad失活，它们的降解可能 组成凋亡信号的正反馈机制。有些蛋白抑制Caspase 活性如热休克蛋白和 cAMP应答因子 CREB。 在NF-κB信号通路中，如 Caspase的切割会产 生转录因子的抗凋亡功能完全丧失：(1) 对NF-κBp65 亚基的切割会产生一个相反功能片段，仍然能够结 合DNA，但已经基本没有转录功能；(2) NF-κB 抑 制子 IκB-α可以被蛋白酶体诱导降解，其 N 端被 Caspase切割产生一个超级抑制子，其不具有清除 蛋白酶体的功能；(3)在受体介导的信号途径也有接 头蛋白 TRAF-1和 RIP-1的切割参与，破坏NF-κB 的激活和抗凋亡能力。 有些底物不仅 Caspase被切割之后丧失功能， 而且导致其他的蛋白或蛋白酶激活，这些主要是通 过 Caspase去除抑制或者调控区 domain。如 PKC和 MAP激酶通路是通过切割得到激活的N-端调控区和 C-端催化区(p21激活的激酶 PAK2和 ROCK-1)， PAK2和ROCK-1的激活对细胞骨架重组和质膜出芽 是非常重要的。如MEKK1，如果表达 Caspase切 割激酶片段诱导 Caspase激活，而导致凋亡信号的 正反馈调控。如果抑制MEKK1或者Caspase活性都 会抑制细胞失巢凋亡现象的发生(细胞失巢凋亡， 凋亡细胞发生从基底膜脱落过程，MEKK1是激活 的)。在凋亡上游信号 SAPK/JNK通路中，通过磷 酸化激活的 JNK而后通过 Bcl-2使之失活。 蛋白在很多激酶通路中具有抗凋亡功能，其中 最令人意想不到的是磷酸酯酶 PP2A，通过 Caspase 激活之后能拮抗激酶的残余活性。蛋白质的磷酸化 拮抗Caspase底物的蛋白水解，最有说服力的是Bid 通过 c a s e i n 激酶 I 或 I I 使之磷酸化而不能够被 Caspase-8切割。另外MAX，是 c-Myc网络的转录 因子，也是只有在去磷酸化时才能被 Caspase切 割。最近非常引人注目的发现是 C/EBPβ本身不能 够被 Caspase切割，但是惊奇的是磷酸化后作为 Caspase的抑制子。在C/EBPβ的KTVD序列的苏氨 酸磷酸化产生非切割的相似XEXD切割点，可以结 合 Caspase，因此抑制 Caspase功能，这类 Caspase 的底物也代表新的存活机制。 5　线粒体分裂与细胞凋亡 线粒体的分裂或者片断化一般都与细胞凋亡密 切联系。线粒体分裂可能是细胞凋亡的早期事件， 发生在 Caspase活化和膜皱缩之前。这个过程似与 细胞色素 C的释放密切相关。但是有些其他试剂如 Antimycin A引起线粒体的片断化是可逆的，病毒感 染之后引起线粒体片断化并不能够使细胞发生凋 亡。线粒体片断化是否是细胞凋亡和细胞色素 C释 放的必需步骤[37,38]还有待进一步分析。 最近我们采用GFP标记的细胞色素C体系实时 观察在凋亡诱导剂 staurosporine、etoposide等处理 细胞，可以检测到 Caspase-3/-7的激活和细胞色素 C从线粒体释放的过程，这一过程伴随线粒体片断 化和线粒体功能的丧失。在不同凋亡诱导剂处理细 胞时，Drp1会被募集到线粒体的外膜上，与Bax和 Mfn2在分裂点共定位。通过Drp1的负调控突变体 (Drp1K38A)或者提供RNAi下调表达能够延迟线粒体 片断化、细胞色素C释放和Caspase活化，证实Drp1 是细胞凋亡过程中线粒体发生片断化所必需的。同 时通过对内源性的Drp1突变使之丧失功能表现抑制 H2O2诱导的细胞凋亡和死亡。通过RNAi抑制Drp1 的活性发现抑制 Bax的转位和细胞色素 C的释放。 通过表达Drp1的磷酸化突变体Drp1S656D导致 细胞线粒体丝状延伸，增加抑制由 staurosporine 和 etoposie诱导细胞凋亡。而如果通过Drp1S656A突 变体使其PKA磷酸化位点丧失会增加对凋亡的敏感 性。Drp1的 SUMO化也与细胞凋亡密切相关。在 凋亡过程中，Drp1的SUMO化增加同时伴随线粒体 的分裂。抑制Drp1或者 Fis1的表达都能够抑制线 粒体分裂和细胞凋亡，但是它们确实作用凋亡的不 同阶段。只有抑制 Fis1的表达才能够抑制Bax的转 位和构象变化。同时或者先后消耗胞内 F i s 1 和 OPA1，会逆转线粒体的丝状延伸。说明线粒体过 度融合也会引起细胞衰老的相关变化。但是同时通 过RNAi抑制Fis1和OPA1表达并不能够逆转凋亡抑 制[ 37 ,3 8]。 6　自吞噬(autophagy)与细胞凋亡 目前对自噬及自噬性程序性细胞死亡的研究已 经成为热点。 自吞噬是细胞内不断发生的正常生理 511第4期 朱玉山，等：线粒体与细胞凋亡调控 现象，是细胞自我保护的一种重要机制。有证据表 明，过度的自吞噬可能导致细胞自吞噬死亡 (autophagic cell death)。关于自吞噬死亡的分子调 控、信号转导过程、病理生理学意义的研究最近有 多篇文章发表在Nature、Cell等高水平杂志上。自 吞噬死亡与细胞凋亡这两种程序性细胞死亡方式在 形态、生化指标、参与分子和机理方面均存在不 同。近年来越来越多的研究提示二者在某些情况下 可以相互拮抗或促进，可先后发生或同时共存于同 一细胞，相同诱导因素在不同细胞中可分别诱发自 噬或凋亡；参与自噬和凋亡的分子也可能存在交 叉，这些分子在自噬与凋亡两种程序性细胞死亡中 可发挥正向或负向作用。随着研究的深入，自噬与 凋亡之间的相互关系似乎变得越来越复杂了。 在1999年Beth Levine围绕着细胞自噬作用的机 理、发生条件、自噬与细胞调亡的区别与内部联 系、自噬作用与癌症的关系、自噬作用怎样来预防 癌症的发生、是否能“打开”和“关闭”自噬 作用的进程来控制癌症的发生发展、是否能利用自 噬作用对癌症进行靶向治疗、下一步的研究方向、 临床试验是否有助于解决细胞自噬与癌症关系等方 面的问题，进行了系统的阐述。发现 Beclin-1调节 自吞噬死亡和抑制肿瘤之间存在密切关系。 哺乳动物Beclin-1是酵母Apg6/Vps30基因的同 源物，双杂交筛选试验证明Beclin-1是Bcl-2的一个 相互作用蛋白。Beclin-1基因敲除小鼠的胚胎干细 胞研究发现 Beclin-1-/-小鼠死于胚胎早期，Beclin-1+/- 小鼠虽然表型正常，但其自发性肿瘤发生的频率却 很高，说明 Beclin-1是一个重要的肿瘤抑制基因， 其杂合性缺失是细胞发生恶性转化的原因之一。近 一步的研究指出，Beclin-1-/-小鼠 autophagy缺陷， 细胞凋亡正常，说明Beclin-1是 autophagy的调控基 因。通过深入研究 Beclin-1、自噬以及恶性肿瘤的 关系，必将对恶性肿瘤的发生和治疗奠定基础。 Liang等[39-41]发现UVRAG (a novel coiled-coil UV irradiation resistance associated gene)具有对 Beclin1- PI(3)KC3复合体正调控功能；作为潜在的肿瘤抑制 因子，在人结肠癌具有非常高的突变。UVRAG 主 要通过Beclin1-PI(3)KC3介导调控细胞自噬或者抑制 人结肠肿瘤细胞增殖和成瘤。进一步的研究发现 UVRAG 可以与VPs(内涵体融合主要组分)相互作 用，这种作用会刺激 Rab7 GTPase 活性以及自噬 体与后来的内涵体 /溶酶体融合，因此促进自噬物 的降解和运输，而且UVRAG-Beclin1-PI(3)KC3复合 体也会加速内涵体 /溶酶体融合，促进自噬物的快 速降解；因此UVRAG是一个多功能效应器，不仅 调控自噬和自噬小体的形成和成熟，而且调控内涵 体融合。 2006年，Yousefi等[42]研究发现自噬相关基因 ATG5产物(调控自噬小体形成所必需的)被Caplain特 异性切割成 24k的切割蛋白，能够从胞浆转位到线 粒体上与抗凋亡分子Bcl-xL调控细胞色素C的释放 和 Caspase活化，进而显著性促进细胞凋亡。发现 了ATG5 作为细胞自噬和凋亡的转换开关的重要调 控功能。 Wang研究小组最近发现 Bif-1(also known as Endophilin B1)能够通过UVRAG与Beclin-1相互作用 调控细胞自噬作用，是一个潜在的自噬和肿瘤抑制 因子的激动剂[43,44]。 Bcl-2在细胞自噬的调控中具有非常重要的作 用。最近Wei 等研究发现饥饿能够诱导的 Bcl-2 T69、S70和S87位磷酸化，进而破坏Bcl-2与Beclin-1 相互作用而发生自噬。同时这一过程是 JNK1所介 导的，而不是 JNK2[43,45]。 线粒体自噬的研究是另外一个热点，最早在酵 母体系而后在细胞内发现。但是对于这一生理过程 的主要机理研究还不是很清楚。首先Kissova等发 现在酵母细胞中，Uth1p介导线粒体自噬现象；而 突变Uth1p之后，无论是饥饿还是 Rapamycin都不 够诱导线粒体自噬的产生，而Uth1p主要具有延长 寿命、抑制氧化损伤以及细胞凋亡的功能，因此 Uth1p是主要介导寿命、自由基产生和线粒体依赖 细胞凋亡和自噬的中间枢纽[46, 47]。最近有研究发现 过表达 Fis1[48]可以检测到线粒体自噬过程，以及帕 金森疾病密切相关的磷酸化的ERK1/2可以定位于发 生自噬的线粒体上。 7　细胞凋亡研究与抗肿瘤药物的开发 重新激活肿瘤细胞内部的凋亡程序是研究者对 癌症治疗最有效的治疗手段。但是目前的化疗药物 除了能够诱导肿瘤细胞凋亡外，也会损伤正常的细 胞组织，具有很大的毒副作用，这主要是由于这些 药物没有特定的作用组织靶点。因此，针对肿瘤细 胞凋亡异常的信号分子，找到合适的细胞凋亡相关 调节分子靶点，才能够开发出具有特异性的新型药 物。很多研究证明 IAP家族蛋白在通过对细胞凋亡 的抑制影响肿瘤的形成中起着非常重要的作用，而 IAP是通过直接对Caspase或者procaspase的抑制或 者通过调控 NF-κB发挥其功能。因此，IAP可以 512 生命科学 第20卷 作为肿瘤治疗的潜在的靶目标，如通过 RNAi抑制 IAP的表达或者开发拮抗 IAP活性的小分子化合 物 [ 4 9 ]。 研究小分子化合物使模拟拮抗 Smac抑制 IAPs (XIAP、cIAP1、 cIAP2)活性变为可能。Smac及其 合成类似物都能够与 IAPs Bir结构域相互作用。模 拟成熟的 Smac的N端AVPI结构的Smac mimetic诱 导Caspase-8依赖的细胞凋亡。一方面Smac mimetic 在胞内能够刺激 cIAPs自动泛素化降解，又反过来 导致NIK的稳定和加速RIP1的募集。另一面拟Smac 会增加 TNFα诱导细胞凋亡的敏感性。在细胞凋亡 受 Caspase广谱抑制及 Z-VAD抑制后， Samc mi- me t i c 能够诱导一些细胞发生不依赖于 TN Fα 和 RIPK1的细胞坏死[50-53] 。 另外，以 Bcl-2作为靶点的肿瘤治疗研究得到 发展。通过降低胞内 Bcl-2/Bcl-xL蛋白的表达水 平，如 Bcl-2反义寡核苷酸，从而增加肿瘤细胞凋 亡敏感性。此方法已应用于对恶性黑色素瘤的治 疗。二是寻找 Bcl-2/Bcl-xL的小分子抑制剂，阻断 Bcl-2/Bcl-xL蛋白的抑凋亡活性。如首先筛选出的 小分子化合物HA14-1，能够诱导对 eoptoside具有 抗性的高表达Bcl-2的HL-60细胞凋亡。如BH3I-1、 BH3I-2、antimycin、chelerythrine、TW37、GX015- 070、ABT-737、gossypol及其类似物，这些化合 物具有与促凋亡蛋白的 BH3结构域竞争结合 Bcl-2/ Bcl-xL，封闭 Bcl-2/Bcl-xL蛋白活性，进而促进细 胞凋亡。在这些化合物中，如棉酚及其类似物被发 现具有抗肿瘤的活性，包括结肠、前列腺、胰腺、 淋巴等肿瘤细胞。最近通过计算机模拟Bim的BH3 结构域合成的棉酚类似物 TW-37，具有与 Bcl-2、 Bcl-xL和Mcl-1非常高的结合度[54]。已经发现 TW- 37与MEK的抑制剂结合抑制肿瘤细胞的生长，或 者通过NF-κB抑制前列腺肿瘤细胞生长[55]。另外， GX015-070已经被应用于临床试验治疗小细胞肺癌 和肝恶性肿瘤细胞。 8　结语 近年来，对于细胞凋亡的研究已经在肿瘤生物 学、发育生物学、神经生物学、免疫生物学等方 面取得很多突破性的成果。特别是关于细胞自噬和 凋亡相互转换的机制发现以及对Samc的模拟研究重 大发现，给我们在未来对于肿瘤的发生和治疗提供 很多借鉴意义。 [参　考　文　献] [1] Fischer U, Janicke RU, Schulze-Osthoff K. 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