重组人血白蛋白的产业化实现方法

#分会# S-A- 05 重组人血白蛋白的产业化实现方法 项 炜 (上海安睿特生物医药科技有限公司,上海 210010) 关键词: 重组人血白蛋白; 分离纯化;批量生产 中图分类号 : R457 R392-33 文献标识码: A 文章编号: 1004-549X ( 2010) 10-0786-02 人血清白蛋白 ( human serum album in, HSA )是 一个由 585个氨基酸组成的单链多肽,分子量 6615 kD。有 3个结构域,整个分子盘旋成球型。单链分 子内的半胱氨酸残基间有 17对二硫键交叉连接, 1 个半胱氨酸位点 ( C ys34), 1个色氨酸位点 ( T rp24)。 人血清白蛋白是人血浆中最丰富的蛋白成分,占血 浆总蛋白的 60%, 每升成人血液中约有 40g白蛋 白,占血清总蛋白的 ( 58 ? 4)%。它主要由肝细胞 合成, 分泌进入血液循环系统。白蛋白是血液缓冲 系统的组分之一,具有营养作用,是维持血液胶体渗 透压的主要成分和运输内源性及外援性物质的重要 载体。目前人血清白蛋白市场需求量大, 无法满足 市场的需要。人源白蛋白制品的缺点主要集中在以 下 2个方面: 1) 产量低, 价格高。鉴于人血大量供 应有困难,所以产量无法大规模提高,无法完全满足 市场需求; 2) 血源污染。与之相比,采用基因工程 生产出来的人血清白蛋白 (重组人血清白蛋白, re- comb inantHSA, rHSA ) 除了生物活性可以与人源 白蛋白相同,还具有可以大规模生产,产品不会受病 原体的污染等优点。所以, rHSA的市场前景将十分 广阔。日本三菱田边制药株式会社 (原日本绿十字 株式会社 )从 1992年开始,历经 15年,超过了 6 000 例临床试验,于 2008年全球首次上市基因重组人血 白蛋白 (商品名 MEDWAYm )。下面简述 rHSA实现 产业化的关键点和解决方法。 1 人血白蛋白的结构与生理药理特点决定了纯化 的难度 由于临床使用剂量为 ( 5) 1215) g /瓶, 远远大 于所有的重组蛋白,极其微量的百分比不纯物质,在 单一剂量中就是微克甚至毫克级的, 所以要求 rHSA 的纯度要大于 > 991999 999%。白蛋白具有广泛的 结合能力, 能结合许多内源性和外源性物质 (脂肪 酸、胆红素、乙酰胆碱、药物、染料及金属离子等 ) , 能结合大、中、小分子的化合物, 也能同难溶于水和 溶于水的物质相结合, 具有重要的生理意义和临床 意义。白蛋白能与许多化合物结合, 可能与 /构象 适应性 ( conf igura tiona l adaptab ility) 0有关。 /构象 适应性0是一种精巧的构象变化。在生理情况下, 白蛋白结合部位易变, 几乎能以相同能量产生不同 的构象。白蛋白结合部位具有 /构象适应性 0, 因为 它螺旋内维系力量较弱,当与某些化合物结合时,螺 旋分开,肽链内残基侧链方位改变,导致分子表面活 性基团适宜分布, 新的结合位点随之产生。白蛋白 结合反应中,结合位点被产生和被修饰,发生构象变 化和协同效应 [ 1]。白蛋白的广谱结合能力意味着 白蛋白自身结合了在发酵和纯化过程中有可能出现 的未知杂质。这种结合分 2个部分,一个是范德华 力的结合;另一个是 HSA存在的自由巯基结合的其 他蛋白或自身的聚合体。以往的重组蛋白发酵和纯 化中考虑的提高宿主细胞的表达量和去除发酵液中 的有关杂质, 而 rHSA不仅仅要去除发酵液中的有 关杂质,最难解决的是要去除 rHSA结合和聚合的 杂质。这是贯穿 rHSA发酵纯化工艺的核心要素。 2 rHSA发酵纯化的解决方案 rHSA发酵纯化的难点在于结合和聚合的杂质。 在生产的实践中发现, 毕赤酵母产生的色素非常牢 固地结合在 rHSA上,采用了各种方法都很难除去。 而难以检测的酵母小分子肽聚合 rHSA,是影响纯度 的检测不到的物质。迄今为止, 国内申报辅料和培 养基 rHSA的颜色为深棕色, 也没有针对性去除酵 母小分子肽聚合 rHSA。我们在吸收日本绿十字株 式会社技术的基础上, 创新出一整套专利技术。该 技术从 4个方面解决了这个问题。首先, 从源头上 解决问题,改构毕赤酵母,减少毕赤酵母分泌色素和 杂质的量;其次,采用 25 e 低温发酵,减少色素分泌 和色素的结合能力;第三,在纯化中采用了半解聚与 活性位点替换封闭法,替换出色素和杂质,封闭活性 位点,阻止杂质和色素的再次结合与聚合; 最后, 采 用一种特殊的混合大孔树脂彻底清除极其微量的结 合杂蛋白与色素, 该混合大孔树脂的特点是 rHSA #786# 中国输血杂志 2010年 10月第 23卷第 10期 Ch in J B lood Tran sfu sion Oct, 2010, Vo.l 23, N o. 10 在通过一种大孔树脂表面时能够轻微解聚 rHSA,另 外几种大孔树脂将各种杂质 (色素、微量酵母蛋白、 微量多糖类物质和金属离子 )牢牢地吸附住。 3 质控是 rHSA成功上市的关键因素 [ 2] 由于 rHSA对纯度要求的特殊性, 质控的分析 方法是 rHSA合格产品的关键因素。日本上市产品 的质量标准如下: (以 250 mg /m l为浓度为准 )色度 A350 /A280 < ( 0. 01) 0. 05 ) ; 宿主蛋白含量 EIA 测定, 检测出宿主蛋白 < 011 ng /m ;l多糖含量 (结 合 ) < 1 ng /m l ( ConA亲和色谱法 ); 多糖含量 (游 离 ) < 1 Lg /m l (硫酸苯酚法 ) ; 宿主残留 DNA [ 4 pg; 脂肪酸 [ 0. 1 mol /mo l rHSA。在 rHSA的质量标 准中最难分析的是酵母宿主蛋白, 目前国内申报 rHSA分析使用的是美国 Cygnus公司的 Pich ia Pas- to risHCP EL ISA k i,t其检测限是 0. 1 ng /m l。但是 Cygnus的抗原是混合毕赤酵母, 并非 rHSA的专属 毕赤酵母, 其检测的结果在检测限附近没有意义。 我们研制的双抗 E IA专属毕赤酵母的分析检测限 是 0. 1 ng /m ,l已经符合日本上市产品的要求,但是 我们考虑到即使在 0. 1 ng /m l也不能完全满足 rH- SA的纯度要求,换句话说, 纯度在 99. 999 999%的 产品在临床中仍然会出现少量的发热、皮疹等过敏 症状 [ 3]。为此,我们发明了适配子法分析 rHSA杂 质,一次性分析出所有 DNA、糖类和宿主蛋白等杂 质。该方法不仅仅将杂质的检测限提高到 0. 01 ng / m ,l而且还能分析出这些杂质的种类,关键是包括了 对动物不产生抗原性的物质 ( E IA分析不出的物 质 )。采用我们发明的方法,进一步提高了日本 rH- SA的质量标准, 这将在临床中大大减少副作用的发 生,增加安全性。 4 日本规模生产 rHSA的特点 日本三菱田边制药株式会社于 1998年在北海 道千叶县投资建厂, 2000年完成,总投资 1134亿美 元, 4 @ 80吨发酵罐, 全自动纯化流水线,采用 GE公 司 Stream line固液分离系统, I期年产 1215吨 ( 100 万瓶 )。 5 国内外 rHSA研究的进展 除了日本三菱田边制药株式会社已经上市 rH- SA注射液以外,英国的诺维信公司已经上市了酿酒 酵母 rHSA的培养基级、辅料级和人干细胞培养级 3 个产品。日本的血清疗法研究所的 rHSA进入 II期 临床。国内华药的研究进度较快,已经申报培养基 级和辅料级的 rHSA ( CXFL0900002, CXFL0900003 重组人血白蛋白 药用辅料 新药 2010-01-28), 并在 石家庄开发区建设了年产 15吨规模的生产线。海 正制药的速度较慢, 预计在 2012年申报培养基级和 辅料级的 rHSA。华药和海正等企业未能注册注射 用的 rHSA的原因就是没有解决如上所述的关键性 技术。 6 结论 rHSA是重组蛋白生产中最难产业化的产品, 其 难点涉及到上游构建、发酵、纯化、分析以及规模生 产的方法等等。上海安睿特生物医药科技有限公司 融入了最新的科技手段, 创新出一套完整的自有知 识产权的生产制造 rHSA的产业化方法, 该方法不 仅仅提高了注射用 rHSA的产品质量,还使得产品 的成本控制在 10元人民币 /g以下 (包括了折旧和 生产成本等 ) , 在近期内实现注射用 rHSA的产业 化。 参 考 文 献 [ 1] Schw ick HG, H auptH1Chem istry& funct ion of hum an plasm a pro- tein s1Angew Ch em Int Ed E ng,l 1980, 19: 87-991 [ 2] W ataru O, Yosh ihito N, Kazuya T, et a l1Physicochem ical and im- munochem ical properties of recom b inan t hum an serum album in from p ich ia pastoris, Analyt ical B iochem is try, 1998, 56: 56-621 [ 3] 医薬品„Ó Ÿ³ Åーµ ‰ーÀ hum an serum album in ( genet ical recomb inat ion) 日本病院薬剤師会N IF記載要領 ( ) K 準拠 7 F作成, 1998, 91 #787#中国输血杂志 2010年 10月第 23卷第 10期 Ch in J B lood Tran sfu sion Oct, 2010, Vo.l 23, N o. 10