蛋白质芯片

null蛋白 质 芯 片 Protein chip 课程：分子生物学蛋白 质 芯 片 Protein chip 课程：分子生物学 姓名:涂振波 班级：10级水产班 学号:1011471001 内容提要内容提要蛋白质芯片概述 蛋白质芯片的关键技术 蛋白质芯片的应用 展望 蛋白质的概述蛋白质的概述蛋白质芯片，又称为蛋白质微阵列(protein micro array)是大量的蛋白质分子(例如抗体或抗原分子)或肽链有序排列固定在载体薄片上形成的。利用蛋白质或肽能特异性地与配体分子(如抗体或抗原)结合的原理，芯片上的蛋白质分子或肽链与样品中的相关成分发生反应，然后加入标记分子，并用阅读仪分析和存储结果，这就是蛋白质芯片的工作原理。构建蛋白质方阵需解决三个问题，一保持蛋白的活性，二保证蛋白质正确定位，三与现存的基因微型方阵研究工具相兼容。蛋白芯片是近年来蛋白质组学研究中兴起的一种新方法。它是在基因芯片的基础上发展起来的。与传统的研究方法相比有以下特点：(1)蛋白芯片是一种高通量的研究方法，能在一次实验中提供大量的信息，使我们能够全而、准确地研究蛋白达谱；(2)灵敏度高，它可以检测出蛋白样品中微量蛋白的存在，检测水平已达ng级；(3)所需的样品量极少。蛋白质芯片的分类蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片 蛋白质芯片的分类Methods for Protein AnalysisGel electrophoresis, northern/western blot (fluorescence/radio active label) X-ray crystallography 2D - mass spectrometry Protein microarrays SELDI MS protein chips Methods for Protein Analysis蛋白质芯片的定义蛋白质芯片的定义蛋白质芯片, 又称蛋白质阵列或蛋白质微阵列，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。 nullnull蛋白质芯片的关键技术蛋白质芯片的关键技术提出生物学问题 （实验目的）样品预处理 （重组蛋白，制备一、二级抗体， 荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应 化学偶合，加底物， 反应温度和时间， 冲洗条件检测 （荧光和比色扫描或拍照， 参数设置）数据分析和建模 （图象量化，化， 采集蛋白信息，建立模型）12345蛋白质芯片制备6蛋白质芯片的制备蛋白质芯片的制备固相载体及其处理 载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片） 蛋白质的预处理 选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解 点制微阵列 可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等 固定微阵列上的蛋白样点 膜为载体：芯片放入湿盒， 37°C 1h 载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白 微阵列的封闭 主要封闭试剂：BSA或Gly nullnullnull蛋白质芯片比较蛋白质芯片比较 表面 蛋白固定方式 优点 缺点 PVDF 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，分布随机 Nitrocellulose 吸附 无需蛋白修饰过程，高结合容量 非特异吸附，高背景，低密度 无需蛋白修饰过程，高密度， 非特异吸附，分布随机 高分辨检测 Epoxy-activated 高密度，高分辨检测 分布随机，表面有吸附 PDMS nanowell 高密度，适合复杂的生化分析 Gold coated silicon 高密度，低背景，易与SPR或MS 联用 分布随机，制作难，未商品化 Avidin coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需生物素化 Ni-NTA coated 亲和结合 蛋白连接强度高、特异和高密度，低背景 蛋白需His x6标记 表面蛋白分布均一容量 Agarose thin film 制作难，未商品化 3D gel pad吸附，共 价偶联Poly-lysine coated Aldehyde-coated共价 偶联扩散 无需蛋白修饰过程，高结合容量 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用疾病诊断和预警 药物开发 蛋白质组学 null定量检测组织提取液中的肿瘤标记物定量检测组织提取液中的肿瘤标记物孵育后的微阵列荧光图 A 含抗原 B 无抗原微阵列方法与ELISA方法检出结果比较疾病诊断uPA 尿激酶型纤溶酶原激活因子 PAI-1血浆纤溶酶原激活因子抑制因子 VEGT 血管内皮生长因子高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂高通量筛选蛋白-蛋白作用抑制剂药物开发Jung SO, et al., Proteomics 2005, 5, 4427–4431.A 1500 个点阵的微阵列 B 局部点阵放大图及SPR信号His6-RB/GST-E7相互作用抑制剂筛选微阵列图 加入His6-RB加入含 PepC抑制剂的His6-RB 人动脉平滑肌细胞蛋白谱 人动脉平滑肌细胞蛋白谱蛋白质组学 揭示了oxidized low density lipoprotein诱导人动脉平滑肌细胞的作用模式 细胞经oxidized low density lipoprotein作用后的蛋白谱检出298个蛋白 54个蛋白表达量发生变化4.7% 抗原（一组细胞-细胞间相互作用分子）表达上调； 13.4%抗原（结构蛋白，体液响应蛋白）表达下降 技术难点技术难点成本过高, 需一系列昂贵的尖端仪器 芯片的标准化问题 提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等展望—蛋白质芯片未来的发展重点 展望—蛋白质芯片未来的发展重点 建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。 改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。 提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。 研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。    nullThank you ！