丹参酮_A对兔动脉粥样硬化斑块胶原含量的影响

转录阶段发挥生物效应的成分未必能够完全体现在最终的功 能上 ,而有些成分可能只针对蛋白翻译或合成后的环节起作 用 ,并没有影响基因的转录过程 ,因此 ,在前期基因表达层面的 实验中未能显示出差异 ,当然 ,其更确切的分子机理仍需进一 步深入研究。 参考文献 1　 Clapham DE. SnapShot: mammalian TRP channels. Cell, 2007; 129 (1) ∶ 220 2 　 Caterina MJ. Transient recep tor potential ion channels as participants in thermosensation and thermoregulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Phys2 iol, 2007; 292∶ R64～R76 3 　Woods, AJ, Stock, MJ, Gup ta, AN, et al. Thermoregulatory effects of resiniferatoxin in the rat. Eur J Pharmacol, 1994; 264 (2) ∶ 125～133 4 　 Caterina MJ. Transient recep tor potential ion channels as participants in thermosensationand thermoregulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physi2 ol , 2007; 292∶ R642R765 　 SidorovVY, HolcombMR, WoodsMC, et al. Effects of unipolar stimu2lation on voltage and calcium distributions in the isolated rabbit heart. BasicRes Cardiol, 2008; 103 (6) ∶ 537～5516 　W elling A, Felbel J, Peper K, et al. Hormonal regulation of calciumcurrent in freshly isolated airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung CellMol Physiol, 1992; 262 (3) ∶ 351～3597 　隋　峰 , 杜新亮 , 张畅斌 , 等. 一种原代培养大鼠 DRG神经元的新方法. 中国药理学通报 , 2009, 25 (7) ∶ 971～9738 　 Okada T, Shim izu S, W akamoriM, et al. Molecular cloning and func2tional characterization of a novel recep tor2activated TRP Ca2 + channel frommouse brain. J B iol Chem, 1998; 273 (17) ∶ 10279～102879 　 Ana YE, Kevin S. Calcium feedback mechanism s regulate oscillatoryactivity of a TRP2like Ca2 + conductance in C. elegans intestinal cells. JPhysiol, 2005; 567 (1) ∶ 239～25110 　 Chen G, Charles Y. Tandem transcrip tion and translation regulatorysensing of uncharged tryp tophan tRNA. Science, 2003; 5630∶ 211～213 丹参酮ⅡA对兔动脉粥样硬化斑块胶原含量的影响 易利平 1 ,严明生 2 ,卢来春 3 3 (1四川省泸州市中医院检验科 ,泸州 　646000; 2四川省遂宁市人民医院检验科 ,遂宁 　629000; 3第三军医大学新桥医院药学部 ,重庆 　 400038) 　　摘 　要 　目的 :观察丹参酮 ⅡA对兔动脉粥样硬化斑块胶原含量的影响 ,并对其机制进行初步探讨。方法 :日本大耳兔随机 分为对照组和丹参酮 ⅡA (7、20、60mg/kg) 4组 ,高胆固醇饮食 10周建立兔动脉粥样硬化 ( atherosclerosis, AS)病变模型后药物干预 4 周 ,取主动脉内膜组织分别采用 Woessner方法、免疫组织化学方法和 realtime RT2PCR法检测斑块组织中胶原含量 ,MMP21蛋白 , IL2 10、IL21 mRNA表达 ,W estern2blot方法检测斑块组织中 PPAR2γ蛋白表达。结果 :丹参酮 ⅡA低剂量能明显提高斑块中胶原蛋白含 量、PPAR2γ蛋白和 IL210 mRNA表达 ,明显降低斑块组织中 MMP21和 IL21 mRNA的表达 ;中、高剂量组能显著提高斑块中胶原蛋白 含量、PPAR2γ蛋白和 IL210 mRNA表达 ,显著降低斑块组织中 MMP21和 IL21 mRNA的表达。结论 :丹参酮 ⅡA能提高动脉粥样硬化 斑块中胶原蛋白含量 ,其机制可能与抑制炎症反应 ,降低 MMP21表达有关。 　　关键词 　丹参酮 ⅡA;动脉粥样硬化 ; PPAR2γ;白细胞介素 210;白细胞介素 26;基质金属蛋白酶 21 　　动脉粥样硬化 ( atherosclerosis, AS)斑块不稳定及其破裂是 导致心脑血管事件的重要原因 [ 1 ]。斑块中的胶原含量与斑块 的稳定性密切相关 ,胶原是纤维帽的主要成分之一 ,胶原含量 越少 ,纤维帽越薄 ,斑块越容易破裂 [ 2 ]。本实验拟选取 AS斑块 中的胶原含量为主要研究对象 ,探讨丹参酮 ⅡA对 AS斑块稳 定性的影响 ,以期为寻找有效改善 AS斑块稳定性的新药物提 供实验依据。 1　材料与方法 1. 1　试验药物 　丹参酮 ⅡA ,中山大学药学院 ,批号 : 200503 。 1. 2　动物 　日本大耳兔 , SPF级 ,雄性 , 2. 0 ±0. 2 kg,第三军 医大学实验动物中心提供 ,许可证号 : SYXK(军 ) 20022029。 1. 3　试剂 　标准羟脯氨酸 ( Sigma, USA) , PPARγ、GAPDH一抗 ( santa cruz公司 ) , MMP21山羊抗兔一抗 (美国 santa公司 ) ;小 鼠抗山羊二抗、DAB试剂盒 (北京中杉金桥生物技术公司 ) ; Tr2izol(德国 Roche公司 ) , Rnasin ( Takara公司 ) ,逆转录试剂盒、荧光定量 Realtime PCR试剂盒为上海东洋坊科技有限公司产品。1. 4　仪器 　紫外分光光度计 (上海亚研公司 ) , L ightCycler Ⅱ型实时荧光定量基因扩增系统 (德国 Roche公司 )。1. 5　方法 　日本大耳兔 32只随机分为对照组和丹参酮 ⅡA高、中、低剂量组 4组。对照组 8只 ,高胆固醇饲料 [ 0. 5%胆固醇 , 10%鸡蛋 (去蛋清 ) , 5%猪油 ] 150g/d喂养 10周 ,再给予普通饲料 150g /d喂养 4周。喂饲普通饲料同时给予双蒸水 10m l灌胃 ,每天一次。丹参酮 ⅡA高、中、低剂量组各 8只 :高胆固醇饲料 150g/d喂养 10周 ,再给予普通饲料 150g /d喂饲 4周 ,喂饲普通饲料同时分别给予丹参酮 ⅡA 7、20、60mg/kg,混于 10m l双蒸水中 ,每天一次灌胃。1. 5. 1　Woessner方法测定羟脯氨酸 　从血管内膜上刮取粥样组织 ,标本脱水、脱脂、烘干、称重 ,加 100倍于样本量的 6 mol/L 02 中药药理与临床 2009; 25 (5) 3 通讯作者 gxh 高亮 gxh 高亮 gxh 高亮 盐酸在 110℃分解 24 h,旋转蒸发仪去除盐酸 ,双蒸水溶解残留 物 ,加氯胺 T溶液室温静置 20 m in,加过氯酸溶液室温静置 5 m in,加对苯胺基苯甲醛溶液在 60℃温箱加热 20 m in,取出冷却 后 ,在波长 560 nm处测定吸光值 ,通过羟脯氨酸标准曲线计算 出待测液内的羟脯氨酸浓度 ,以此推算组织总胶原蛋白含 量 [ 3 ]。 1. 5. 2　 RNA的提取及荧光定量逆转录聚合酶链反应 　从血 管内膜上刮取约 30mg粥样组织置于研磨钵中 ,加入液氮研磨 , 匀浆移入 1. 5m l EP管中 ,加入 1m l Trizol,用加样枪吹打混匀直 至细胞全部破裂溶解 ,室温静置 5 m in,加入 0. 2 m l氯仿 ,摇匀 , 于室温下静置 15m in, 4℃ 10000g离心 15 m in,将上层水相转移 至新的离心管中 ,加入等体积的异丙醇 ,摇匀 ,室温静置 10m in 后 , 4℃ 10000g离心 10m in,弃掉上清液 , 75%乙醇清洗 1次 ,将 RNA沉淀晾干 ,用 20μl无 RNA 酶去离子水溶解 , 270℃保存待 用。逆转录按试剂盒说明书进行。荧光定量聚合酶链反应参见 试剂盒说明书 : 1μl cDNA样本作为 PCR扩增模板 ,阴性对照扩 增模板为去离子水 ;扩增条件为 94℃预变性 5 m in;随后 94℃ 30 s,退火温度 30 s, 72℃ 20 s,共 36个循环 ;最后 72℃延伸 10 m in[ 4 ]。采用 " p rimer p rem ier 5. 0"软件设计引物 (表 1) ,引物由 上海博尚生物公司合成。 　　表 1　引物序列 基因 长度　　 (bp) 　　 上游引物 下游引物 退火温度 (℃) IL210 104　　 CAGTGGAGCAGGTGAAGAATGAT CACGTAGGCTTCTATGCAGTTGA 59. 0 IL21 103　　 GTTGCCTTCTTGGGACTGATGT ATACTGGTCTGTTGTGGGTGGT 58. 2 β2actin 144　　 AGATTACTGCCCTGGCTCCTAG CATCCGTACTCCTGCTTGCTGAT 59. 0 1. 5. 3　免疫组织化学方法 　主动脉经 4%中性福尔马林固定 后 ,石蜡切片进行免疫组织化学方法测定 MMP21表达 ( SP法 , 阴性对照一抗用 0. 01M PBS代替 )。显微镜下拍照后用 " Image Pro Plus 4. 5"软件进行图像分析 ,测定阳性物质表达面积和积 分光密度 [ 5 ]。 1. 5. 4　W estern2blot方法 　从血管内膜上刮取粥样组织 ,分别 提取各组细胞总蛋白 (考马斯亮蓝 G2250染料法 ) ,测定蛋白质 浓度。进行 SDS2PAGE蛋白电泳 ,转膜 ,封闭。加入一抗 ( PPARγ或 GAPDH单克隆抗体稀释度分别为 1: 500和 1: 1000)、 二抗 ,最后进行 DAB显色 ,显色带经扫描仪后用 BandScan 5. 0 软件进行灰度值半定量分析。以 GAPDH做内参照 , PPARγ与 GAPDH片段的条带光密度 ( IOD)比值为相对值分别进行比较。 2　结果 2. 1　丹参酮 ⅡA 对斑块中胶原含量的影响 　本实验采用 Woessner方法测定斑块中羟脯氨酸的含量 ,从而推算出胶原含 量。结果如表 2所示 :丹参酮 ⅡA干预后 ,明显升高了斑块中的 胶原蛋白含量 ,其中低剂量组升高了 22. 45% ,中、高剂量组分 别升高了 48. 69%、51. 54%。 　　表 2　丹参酮ⅡA对斑块中胶原含量的影响 ( €x ±s, n = 8) 组别 剂量 (mg/kg) 胶原蛋白含量 (mg/g) 对照　 12. 96 ±2. 57 丹参酮ⅡA 7 15. 87 ±2. 753 丹参酮ⅡA 20 19. 27 ±2. 853 3 丹参酮ⅡA 60 19. 64 ±3. 463 3 　　3 P < 0. 05, 3 3 P < 0. 01 vs对照组 (下同 ) 2. 2　丹参酮 ⅡA对斑块中 IL210、IL21 mRNA表达的影响 　本 实验采用荧光定量逆转录聚合酶链反应分别检测了丹参酮 ⅡA 干预组和对照组斑块中 IL210、IL21 mRNA的表达 ,结果如表 3 所示 :丹参酮 ⅡA干预后 ,明显降低了斑块中 IL21 mRNA的表 达 ,其中低剂量组降低了 20. 83% ,中、高剂量组分别降低了 45. 83%、54. 17%。明显升高了斑块中 IL210 mRNA的表达 ,其中低 剂量组升高了 23. 68% ,中、高剂量组分别升高了 52. 63%、65. 79%。 　　表 3　丹参酮ⅡA对斑块中 IL210、IL21 mRNA表达的影响 ( €x ±s, n = 8) 组别 剂量 (mg/kg) IL210 ( beta actin) IL21 ( beta actin) 　 对照 0. 038 ±0. 006 0. 024 ±0. 006 丹参酮ⅡA 7 0. 047 ±0. 0073 0. 019 ±0. 0043 丹参酮ⅡA 20 0. 058 ±0. 0133 3 0. 013 ±0. 0033 3 丹参酮ⅡA 60 0. 063 ±0. 0153 3 0. 011 ±0. 0023 3 2. 3　丹参酮 ⅡA对斑块中 MMP21表达的影响 　本实验采用 免疫组织化学法检测了丹参酮 ⅡA 干预组和对照组斑块中 MMP21的表达 ,结果如表 4所示 :丹参酮 ⅡA干预后 ,明显降低 了斑块中 MMP21表达面积和积分光密度 ,其中低剂量组分别降 低了 19. 99%、23. 59% ,中、高剂量组分别降低了 49. 14%、53. 90% , 52. 79%、60. 83%。 　　表 4　丹参酮ⅡA对斑块中 MMP21表达的影响 ( €x ±s, n = 8) 组别 剂量 (mg/kg) 表达面积 ( ×103μm2 ) 积分光密度 ( ×106 ) 对照 34. 21 ±6. 18 48. 92 ±11. 76 丹参酮ⅡA 7 27. 73 ±5. 443 37. 38 ±7. 873 丹参酮ⅡA 20 17. 40 ±3. 853 3 22. 55 ±5. 413 3 丹参酮ⅡA 60 16. 15 ±3. 563 3 19. 16 ±3. 963 3 2. 4　丹参酮 ⅡA对斑块中 PPAR2γ表达的影响 　本实验采用 W estern2blot法检测丹参酮 ⅡA干预组和对照组斑块中 PPAR2γ 的表达 ,结果如表 5所示 :丹参酮 ⅡA干预后 ,明显升高了斑块 中 PPAR2γ的表达 ,其中低剂量组分别升高了 21. 62% ,中、高剂 量组分别升高了 110. 81%、127. 03%。 　　表 5　丹参酮ⅡA对斑块中 PPAR2γ表达的影响 组别 剂量 (mg/kg) PPAR2γ/GAPDH　　 对照 0. 37 ±0. 062 丹参酮ⅡA 7 0. 45 ±0. 0683 丹参酮ⅡA 20 0. 78 ±0. 123 3 丹参酮ⅡA 60 0. 84 ±0. 153 3 3　讨论 　　AS不稳定斑块破裂后产生的一系列并发症 ,引起心、脑血 管栓塞 ,现有的研究绝大部分局限于对尸检标本的研究 ,通过建 立动物模型对此进行研究较少。本实验通过成功建立动脉粥样 硬化成熟病变模型 ,在此基础上进行丹参酮 ⅡA干预 ,研究丹参 酮 ⅡA对动脉粥样硬化斑块稳定性的影响。 12中药药理与临床 2009; 25 (5) gxh 高亮 　　PPARγ是核激素受体超家族的成员之一 , PPARγ活化和表 达上调后可发挥抗炎活性 ,一定程度上减少炎症细胞募集、炎 症介质的产生 ,抑制局部炎症反应 [ 6 ]。本实验研究发现 ,丹参 酮 ⅡA能显著升高 AS斑块 IL210 mRNA表达 ,降低斑块组织中 IL21 mRNA的表达 ,说明丹参酮 ⅡA能显著抑制斑块中的炎症 反应 ,其主要机制可能是其上调 PPARγ这一炎症反应信号通路 上游因子 ,从而导致了炎症因子 IL26的降低和抗炎因子 IL210 的增加。斑块内的炎症因子可以刺激平滑肌细胞、内皮细胞等 产生 MMPs,可有效地降解胶原和纤维帽内其他细胞外基质 ,使 得纤维帽变薄 ,纤维帽的不断变薄将最终导致粥样斑块的破 裂 [ 7 ]。胶原是纤维帽的主要成分之一 ,纤维帽对斑块起保护作 用 ,纤维帽越厚 ,斑块越稳定。破裂的 AS斑块的纤维帽通常胶 原含量较低 ,能合成胶原 SMC数目也较少 [ 8 ]。本实验研究发现 丹参酮 ⅡA能显著增加 AS斑块中的胶原含量 ,提示丹参酮 ⅡA 对 AS斑块有稳定作用。其主要机制可能是丹参酮 ⅡA上调 PPARγ,抑制炎症反应 ,从而降低了 MMP21的生成 ,抑制了斑块 中胶原的降解。 　　本实验表明丹参酮 ⅡA能显著抑制 AS斑块中炎症反应 , 减少斑块中胶原的降解 ,提升 AS斑块的稳定性。 参考文献 1　周志斌 , 郭毅. 不稳定性动脉粥样硬化斑块的特点及主要形成机制 . 国外医学脑血管疾病分册 , 2004; 12 (2) ∶ 137～140 2　 V iles2Gonzalez JF, Fuster V, Badimon JJ. L inks between inflammation and thrombogenicity in atherosclerosis . Curr Mol Med, 2006; 6 ( 5) ∶ 489 ～499 3　永井裕 , 藤本大三郎. 刘平 , 译. 胶原蛋白实验方法 . 上海中医学 院出版社 , 1992∶ 51～52 4　 van der Ploeg JR, Giertsen E, Lüdin B, et al. Quantitative detection of Porphyromonas gingivalis fimA genotypes in dental p laque . FEMS M icrobiol Lett, 2004; 232 (1) ∶31～37 5　 Tangirala RK, Rubin W. Quantitation of atherosclerosis in murine mod2 els: correlation between lesions in the aortic origin and in the entire aorta, and differences in the extent of lesions between sexes in LDL recep tor2defi2 cient and apolipop rotein E2deficientm ice . L ip id Res, 1995; 36 (11) ∶ 2320 ～2328 6　 Kap lan JM, Cook JA, Hake PW , et al. 152Deoxy2Delta (12, 14) 2p ros2 taglandin J2 (15D2PGJ2 ) , a peroxisome p roliferator activated recep tor gamma ligand, reduces tissue leukosequestration and mortality in endotoxic shock . Shock, 2005; 24 (1) ∶ 59～65 7　 O rbe J, Fernandez L, Rodriguez JA, et al. D ifferent exp ression of MMPs/TIMP21 in human atherosclerotic lesions. Relation to p laque features and vascular bed . A therosclerosis, 2003; 170 (2) ∶ 269～276 8　 Ge J, Chirillo F, Schwedtmann J, et al. Screening of rup tured p laques in patients with coronary artery disease by intravascular ultrasound . Heart, 1999; 81 (6) ∶ 621～627 Effects of tan sh inone ⅡA on stab ility of rabb it a therosclerotic plaques Yi L ip ing1 , Yan M ingsheng2 , Lu Laichun3 (1 Luzhou Hosp ital of Traditional Chinese Medicine, Luzhou 　646000; 2 Suining Peop le Hosp ital, Suining　 629000; 3 Department of Pharmacology of Xinqiao Hosp ital, The Third M ilitaryMedical University, Chongqing 　400038) 　　A im : The instability of atherosclerosis p laque was the critical factor induced the heart events, and valid remedies for this were deficient at p resent. Rabbit atherosclerotic models were set up to study effects of Tanshinone ⅡA on stability of atherosclerotic p laques and initial in2 vestigation for mechanism. M ethod: Rabbit atherosclerotic models were set up by hypercholesterm ia diet. Contents of matrix metallop rotein2 ase21 and collagen in p laque were detected by immunohistochem ical and woessner method, respectively. contents of metallop roteinase21 p ro2 tein were measured by Image Pro Plus 4. 5. Exp ression levels of interleukin 6, interleukin210 mRNA and peroxisome Proliferator2activated re2 cep tor gamma p rotein were determ ined with real2time PCR and western blot method, respectively. Result: In Tanshinone ⅡA group s, colla2 gen, Proliferator2activated recep tor gamma p rotein and interleukin 10 mRNA was elevated markedly, interleukin 6 mRNA and MMP21 p rotein found in Tanshinone ⅡA group s were decreased. Conclusion: Tanshinone ⅡA could enhance stability of rabbit atherosclerotic p laque. This maybe be concerned with its anti2inflammatory action. Key words　tanshinone ⅡA; atherosclerosis; peroxisome Proliferator2activated recep tor; interleukin 6; interleukin210; metallop roteinase21 LLN对大鼠急性心肌缺血损伤的作用及作用机制研究 3 荆 　焰 1 ,杨芳炬 2 ,邓文龙 3 ,张 　杰 2 (1兰州石化总医院普内科 ,兰州 ; 2四川大学基础与法医学院 ,成都 　610041; 3四川省中医药科学院 ,成都 　 610041) 　　摘 　要 　目的 : 探讨中药成分 LLN对大鼠急性心肌损伤的保护作用。方法 : 用异丙肾上腺素 ( ISO) 30mg/kg两次注射造成大 鼠心肌损伤模型 , LLN大 (400mg/kg )、中 (200mg/kg)、小剂量组 (100mg/kg)及丹参酚酮 (400 mg/kg)灌胃 ,观察对急性心肌损伤的 22 中药药理与临床 2009; 25 (5) 3 国家重点基础研究发展计划 (2007CB512604) gxh 高亮