活脉饮对实验性兔动脉粥样硬化病变中胶原及基质金属蛋白酶1的影响

[文章编号 ] 　100723949 (2006) 1420220115204 ·实验研究· 活脉饮对实验性兔动脉粥样硬化病变中胶原 及基质金属蛋白酶 1 的影响 李晓东 , 　刘红霞 , 　毛 　颖 , 　杨智勇 (中国医科大学附属第二医院心内科 , 辽宁省沈阳市 110004) [关键词 ] 　内科学 ; 　活脉饮抗动脉粥样硬化 ; 　免疫组织化学 ; 　细胞外基质 ; 　胶原 ; 　基质金属蛋白酶 ; 　兔 [摘 　要 ] 　目的 　研究活脉饮对动脉粥样硬化的治疗作用。方法 　建立兔动脉粥样硬化模型 ,观察活脉饮治疗后 动脉粥样硬化斑块的范围、斑块内胶原含量和基质金属蛋白酶 1 表达的变化 ,并与单纯高脂组和辛伐他汀组比较。 结果 　活脉饮高剂量组 (每天 12 g/ kg)斑块范围较单纯高脂组明显减小 ( P < 0. 01) ,与辛伐他汀组比较差异无显著 性 ( P > 0. 05) ,活脉饮低剂量组 (每天 6 g/ kg)与单纯高脂组相比无明显差异 ( P > 0. 05) 。胶原含量活脉饮高、低剂 量组均较单纯高脂组减少 ( P < 0. 01 , P < 0. 05) , 高剂量组与辛伐他汀组比较差异无显著性 ( P > 0. 05) ,低剂量组 胶原含量较辛伐他汀组高 ( P < 0. 05) 。基质金属蛋白酶 1 的表达活脉饮高剂量组与辛伐他汀组比较差异无显著 性 ,较单纯高脂组明显增多 ( P < 0. 01) , 低剂量组与高脂组差异无显著性 ( P > 0. 05) 。结论 　活脉饮呈剂量依赖性 抗兔动脉粥样硬化 ,其机制之一可能是通过增强基质属蛋白酶的表达、减少斑块内胶原的聚集而发挥作用。 [中图分类号 ] 　R541. 4 [文献标识码 ] 　A Effects of Huomai Yin on Collagen and Matrixmetalloproteinase21 of Atherosclerosis in Rabbits LI Xiao2Dong , LIU Hong2Xia , MAO Ying , and YANG Zhi2Yong ( Department of Cardiology , the Second Affiliated Hospital of China Medical University , Shenyang 110004 , China) [ KEY WORDS] 　Huomai Yin ; 　Atherosclerosis ; 　Extracellular Matrix ; 　Collagen ; 　Matrixmetalloproteinase21 ; 　Rabbit [ ABSTRACT] 　　Aim 　To study the effect of Huomai Yin on atherosclerosis. 　　Methods 　The experimental model of atherosclerosis in rabbits was established by endothelial injury by balloon and hyper2lipid feed. 　The atheroslerosis plaque area , collagen and matrixmetalloproteinase21 differences between groups were evaluated at the end of the study. 　　Results 　At the end of 8 weeks after endothelial injury by balloon , the plaque area in Huomai Yin highdose group(every day 12 g/ kg) was smaller than that in hyper lipid group( P < 0. 01) ; compared with simvastatin group , the plaque area in highdose group was larger , but the difference wasn’t significant ( P > 0. 05) ; compared with hyper lipid group , the plaque area in lowdose group(every day 6 g/ kg) wasn’t significantly smaller( P > 0. 05) . 　Collagen was reduced in highdose group and lowdose group than in hyper lipid group( P < 0. 01 , P < 0. 05) . 　Collagen wasn’t significantly different between highdose group and simvastatin group ( P > 0. 05) , but collagen in lowdose group was more than simvastatin group( P < 0. 05) . 　 The express of matrixmetalloproteinase21 in highdose group and simvastatin group wasn’t significantly different ( P > 0. 05) , but was higher than that in hyper lipid group( P < 0. 01) . 　　Conclusions 　Huomai Yin has therapeutic effect on atherosclerosis in rabbit. 　Huomai Yin could modulate the express of matrixmetalloproteinase21 and decrease collagen accumulation in the atherosclerosis plaque. [收稿日期 ] 　2005206229 　　　　[修回日期 ] 　2005212210 [基金项目 ] 　辽宁省自然科学基金 (20042079) [作者简介 ] 　李晓东 ,副教授 ,硕士研究生导师 ,主要从事冠心病及 高血压病的临床诊治研究 , 联系电话为 024283956367 , E2mail 为 LXD @medmail . com. cn。刘红霞 ,硕士研究生 ,现在河北省石家庄长城医 院工作 ,主要从事心肌病及冠心病的研究。毛颖 ,硕士研究生。 　　近年研究发现胶原不仅是动脉粥样硬化 (atheroscolerosis , As) 斑块组织的支架结构 ,而且它 对内膜通透性改变、平滑肌细胞迁移和增殖、斑块不 稳定等均产生影响 ,这其中细胞外基质的主要降解 酶———基质金属蛋白酶 ( matrixmetalloproteinases , MMP)的调控发挥了重要作用[1 ] 。中药活脉饮为补 阳还五汤和血府逐瘀汤的拆方组合 ,前期研究证实 其具有抑制正常兔血管扩张术后局部附壁血栓形成 及减轻新生内膜细胞增殖的作用[2 ] 。本实验进一步 研究活脉饮对 As 病变中胶原及 MMP21 的影响。 1 　材料与方法 1. 1 　动物分组 健康雄性日本大耳白兔 40 只 ,体重 2. 3 ±0. 5 kg ,月龄 4～5 个月 (由东北制药厂实验动物部提 供) ,随机分成空白对照组、单纯高脂组、辛伐他汀治 疗组、活脉饮低剂量组和活脉饮高剂量组 ,每组 8 只。空白对照组喂普通颗粒饲料 ,每只 150 g/ 天 ;单 511CN 4321262/ R 中国动脉硬化杂志 2006 年第 14 卷第 2 期 纯高脂组喂含 8 %胆固醇的高脂饲料 25 g/ 天 + 普通 颗粒饲料 125 g/ 天 ;后 3 组在单纯高脂组喂养的基 础上分别给予辛伐他汀 (由杭州默沙东制药厂生产) 5 mg/ 天、按每天 6 g/ kg 计算的活脉饮 (相当于临床 人用剂量 10 倍 ,中国医科大学附属第二医院制剂室 研制)以及按每天 12 g/ kg 计算的活脉饮 ,每周称体 重调整活脉饮用量。 1. 2 　兔动脉粥样硬化模型的制备 参照吴运生等[3 ]和李东宝等[4 ]方法进行。分组 喂养 1 周后 ,除空白对照组外其余各组行腹主动脉 内皮剥脱术 :按 0. 1 mL/ kg 846 合剂肌肉注射麻醉 , 固定于兔台 ,剪去右侧腹股沟区毛发 ,无菌条件下切 开皮肤及皮下 ,游离股动脉约 2 cm 长 ,穿线 ,远端结 扎 ,近端阻断血流 ,在两线间动脉壁上剪一小口 ,插 入球囊导管 (直径 3. 5 mm) ,进入深度 15 mm ,压力表 充盈球囊压力 8 个大气压至拉回有阻力时 ,将球囊 导管回拉至髂动脉与股动脉分叉处 ,撤压 ,间歇 1 min ,然后再次重复操作 ,共 3 次。退出球囊导管 ,结 扎股动脉近心端 ,缝合切口。术后肌注青霉素 40 万 单位/ 天 ,共 3 天。术后继续分组喂养。内皮剥脱术 后第 8 周末 ,动物禁食 8 h ,用 846 合剂麻醉 ,取髂动 脉分叉部以上 2 cm 处腹主动脉 0. 5 cm 左右 ,用生 理盐水冲洗 2 遍 ,并用 10 %福尔马林冲洗 2 遍后 ,固 定备用。 1. 3 　形态学观察 将固定的腹主动脉标本常规脱水 ,石蜡包埋 ,切 片 3～4μm。进行 HE染色 ,采用中国医科大学实验 设备中心图文分析 Metamorph/ C5050/ BX41 系统计 算内弹力板包绕面积和管腔面积 ,并计算内膜增殖 比率 = (内弹力板包绕面积 - 管腔面积) / 内弹力板 包绕面积。每张切片测 3 次 ,求平均值。 1. 4 　胶原的测定 进行 masson 染色。光镜下观察胶原纤维呈蓝 色 ,平滑肌细胞呈红色。用计算机图文分析系统进 行胶原半定量分析 ,计算阳性目标总面积占统计场 总面积的百分比。 1. 5 　基质金属蛋白酶 1 的测定 基质金属蛋白酶 1 多克隆抗体购自武汉博士德 生物工程有限公司 ,按常规免疫组织化学操作步骤 染色 ,DAB 显色 ,切片中棕黄色颗粒为阳性。用计 算机图文分析系统 ,测定其平均染色光密度值。 1. 6 　统计学处理 数据用 x ±s 表示 ,采用 SPSS11. 5 软件 , SNK 法单因素方差分析 , P < 0. 05 为差异有显著性。 2 　结 果 2. 1 　一般情况 实验过程中有 5 只动物死亡 ,3 只死于腹泻 ,1 只死于术后肢端坏疽感染 ,1 只死于术中大出血。 实验结束时 ,正常对照组余兔 6 只 ,单纯高脂组 7 只 ,辛伐他汀组 6 只 ,活脉饮低剂量组 8 只 ,活脉饮 高剂量组 8 只。 2. 2 　病理形态学变化 肉眼观察 ,正常对照组内膜表面光滑 ,无隆起。 单纯高脂组动脉弹性明显下降 ,内膜有明显隆起 ,管 腔狭窄。辛伐他汀组、活脉饮高剂量组和活脉饮低 剂量组动脉内膜亦有不同程度的隆起 ,但较单纯高 脂组轻。光镜观察 ,正常对照组动物管腔未见异常 改变 ,内膜表面光滑 ,内皮细胞完整连续 ;高脂组内 膜明显增厚 ,有的甚至环管壁全周 ,管腔狭窄 ,增厚 的内膜中含大量泡沫细胞 ,内膜表面不光滑 ,内皮细 胞缺失或不连续 ;辛伐他汀组可见内膜局限性隆起 , 内膜下可见少量散在泡沫细胞 ;活脉饮低剂量组内 膜亦增厚 ,但未达管壁全周 ;活脉饮高剂量组内膜增 厚程度较低剂量组轻 ,但其斑块范围较辛伐他汀组 大 (图 1) 。 各实验组与正常对照组比较内膜增殖比率差异 均有显著性 ( P < 0. 01) ,活脉饮高剂量组和辛伐他 汀组与单纯高脂组相比差异具有显著性 ( P < 0. 01) ,活脉饮高剂量组与辛伐他汀组、活脉饮低剂 量组与单纯高脂组差异无显著性 (表 1) 。 图 1. 各组动物动脉粥样硬化斑块的比较 (HE 40 ×) 　　a 为正常对照组 ,b 为单纯高脂组 , c 为辛伐他汀组 , d 为活脉饮低剂量组 , e 为 611 ISSN 100723949 Chin J Arterioscler , Vol 14 , No 2 活脉饮高剂量组。 表 1. 活脉饮对腹主动脉粥样硬化面积、斑块内胶原及基质 金属蛋白酶 1 的影响 ( x ±s) 分 　组 n 内膜增殖 比率 ( %) 面积百分比 ( %) MMP21 光密度值 正常对照组 6 16. 16 ±2. 58 1. 92 ±1. 05 0. 262 ±0. 008 单纯高脂组 7 57. 45 ±9. 84a 44. 78 ±9. 35a 0. 287 ±0. 010a 辛伐他汀组 6 32. 77 ±16. 22b 23. 59 ±8. 13b 0. 313 ±0. 013b 活脉饮低剂量组 8 48. 68 ±13. 19 33. 92 ±5. 31c 0. 299 ±0. 016 活脉饮高剂量组 8 41. 34 ±9. 80 28. 56 ±6. 88 0. 306 ±0. 011 　a 为 P < 0. 01 , 与正常对照组比较 , b为 P < 0. 01 , c 为 P < 0. 05 , 与单纯高 脂组比较。 2. 3 　各组胶原含量的比较 masson 染色显示 ,正常对照组胶原含量甚微 ,内 膜几乎未见蓝色染色区域 ;高脂组增厚内膜几乎全 部染为蓝色 ,仅在内膜与中膜交界处可见染色为红 色的平滑肌细胞散在其间 ,并可见脂质空泡 ;活脉饮 高剂量组和辛伐他汀组 As 斑块内蓝色染色区域主 要位于斑块纤维帽及斑块肩部 ,染色范围较高脂组 小。活脉饮低剂量组 As 斑块内蓝色胶原纤维与红 色平滑肌细胞混杂出现 ,并可见脂质空泡 (图 2) 。 图 2. 各组胶原分布的比较 (masson 染色 400 ×) 　　a 为正常对照组 ,b 为单纯高脂组 , c 为辛伐他汀组 , d 为活脉饮低剂量组 , e 为活脉 饮高剂量组。 　　对胶原含量进行半定量分析发现 ,胶原含量各 实验组与正常对照组比较差异均具有统计学意义 ( P < 0. 01) ,活脉饮高剂量组和辛伐他汀组较高脂 组比较具差异有显著性 ( P < 0. 01) ,活脉饮低剂量 组与高脂组、辛伐他汀组比较差异有显著性 ( P < 0. 05) (表 1) 。 2. 4 　各组基质金属蛋白酶 1 表达的比较 免疫组织化学结果发现 ,MMP21 为胞浆阳性染 色 ,主要分布在内膜与中膜交界处靠近内膜的区域 ,在斑块的肩部也有分布 ,而在纤维帽处含量较少。各组 MMP21 的表达见图 3。经计算机图像分析计算显示 :MMP21 的表达在单纯高脂组较正常对照组高( P < 0. 01) ,活脉饮高剂量组和辛伐他汀组较单纯高脂组高 ( P < 0. 01) ,活脉饮低剂量组与单纯高脂组比较差异无显著性 ( P > 0. 05) (表 1) 。 图 3. 各组基质金属蛋白酶 1 表达的比较 　　a 为正常对照组 ,b 为单纯高脂组 , c 为辛伐他汀组 , d 为活脉饮低剂量组 , e 为活脉饮高剂 量组。 3 　讨 论 中药复方制剂以其多靶点、多方位的作用特点 , 在动脉粥样硬化的防治中具有一定优势 ,本试验所 用中药活脉饮为补阳还五汤和血府逐瘀汤的拆方组 合 ,其主要成分为当归、黄芪、川芎、赤勺、红花。前 期研究证实其具有抑制正常兔血管扩张术后局部附 壁血栓形成及减轻内膜细胞增生的作用。本实验在 通过股动脉内皮剥脱术和高胆固醇喂养的方法成功 建立兔动脉粥样硬化模型的基础上 ,给予活脉饮治 疗用药后 ,高剂量组 (喂服活脉饮每天 12 g/ kg) 动脉 711CN 4321262/ R 中国动脉硬化杂志 2006 年第 14 卷第 2 期 粥样硬化斑块的范围较单纯高脂组明显减小 ,而每 天喂服 6 g/ kg 活脉饮的低剂量组与单纯高脂组比 较无明显差异 ( P > 0. 05) 。辛伐他汀作为调脂药 , 可通过降脂及改善内皮功能、抗炎等降脂以外的作 用延缓动脉粥样硬化的进程[5 ] 。张园园等[6 ]证实辛 伐他汀可显著改善兔动脉粥样硬化内皮依赖性血管 舒张功能 ,具有抗动脉粥样硬化的作用。本实验将 辛伐他汀作为阳性对照药物比较发现 :活脉饮高剂 量组动脉粥样硬化斑块范围虽较辛伐他汀组大 ,但 无统计学差异 ;而低剂量组较辛伐他汀组斑块范围 较大。以上说明活脉饮具有抗兔动脉粥样硬化的作 用 ,而且具有一定的剂量依赖性。 研究发现 ,胶原作为细胞外基质的主要成分 ,不 仅是粥样硬化斑块的支架结构 ,而且它还在动脉粥 样硬化病变进程中发挥重要的作用[7 ] 。在正常情况 下 ,胶原占血管壁蛋白总量的 20 %～30 %。现已发 现存在于血管壁中的胶原有 13 种。Ⅰ、Ⅲ型胶原是 血管壁的主要基质胶原 ,与血管壁的张力和伸延性 关系密切 ; Ⅳ型胶原分布于血管壁平滑肌细胞周围 , 并且它还是构成内皮细胞基底膜的主要成分 ,因而 又称作基底膜胶原 ,不仅为细胞提供稳固的物质支 持而且还可形成渗透屏障。基质金属蛋白酶是酶活 性依赖锌离子的蛋白酶超家族 ,是细胞外基质降解 的主要酶类。目前已发现 25 种人类 MMP ,其中 MMP21 是胶原的主要降解酶之一[8 ] 。在动脉粥样硬 化病变进展过程中 ,MMP 生成量的变化影响胶原的 降解速度 ,从而对一些关键事件产生重要影响 :在动 脉粥样硬化病变初期 ,粘附于内皮细胞的单核细胞 和 T淋巴细胞产生过量的 MMP ,促使基底膜的主要 组分 Ⅳ型胶原降解 ,使内皮细胞的通透性增加 ,导致 血浆成分涌入 ,加速斑块进展 ;动脉粥样硬化进展 期 ,许多动物实验发现胶原可抑制平滑肌细胞的迁 移和增殖[9 ] ,而 MMP 的过表达使胶原降解过多 ,进 而增强动脉受损处平滑肌细胞的迁移和增殖 ,加速 动脉粥样硬化的进程 ;在成熟的动脉粥样硬化病变 中 ,MMP 表达相对减弱 ,胶原含量明显增加 ,使斑块 突向管腔 ,造成动脉狭窄。鉴于以上胶原与 MMP21 在动脉粥样硬化进程中的重要作用 ,本试验从该角 度对活脉饮的抗动脉粥样硬化的作用机制进行了探 讨 ,结果发现实验兔内皮剥脱术后第 8 周末 ,MMP21 的含量在各实验组均较对照组高 ,在 4 个实验组中 , 活脉饮高剂量组和辛伐他汀组 MMP21 含量较高 ,而 单纯高脂组含量较低 ,与此相反 ,胶原含量在活脉饮 高剂量组和辛伐他汀组较少 ,而在单纯高脂组则较 多。推测活脉饮的抗动脉粥样硬化机制之一可能与 促进粥样硬化斑块内胶原的降解有关。据以往一些 文献报道 ,在单纯动脉粥样硬化动物模型的预防性 用药中 ,模型组 MMP 明显增高 ,而药物组可抑制增 高。而本文是模型组和药物组都升高 ,用药组增高 更为明显 ,究其原因考虑有以下几种可能 : ①与本试 验造模过程中血管内皮剥脱损伤的影响有关 ,用药 后 MMP 进一步升高实际上有利于内皮的修复 ; ②可 能与各实验所选取的观察时间点不同有关 ,有研究 表明在血管再狭窄动物模型中 MMP 的表达随时间 具有一定的动态演变规律[10 ] ,是否在动脉粥样硬化 病变的进程中也存在这样的演变过程 ,还需要更大 样本进行动态观察 ,才可得出令人信服的结论。 本实验研究发现胶原与 MMP21 的分布也存在 一定规律 :胶原在动脉粥样硬化斑块中主要分布于 内膜下 ,形成纤维帽 ,而在内膜与中膜交界处的斑块 深层含量较少 , 免疫组织化学显示在此区域内 MMP21 染色阳性 ,而其在纤维帽处着色较浅 ; Halpert 等[11 ]研究证明斑块中的巨噬细胞可分泌多种 MMP , 其中包括 MMP21。而在粥样斑块深层是巨噬细胞聚 集的部位 , 故推测MMP21 在此分布较多与此有一定 关系 ;但是否还存在其他因素 ,如某些促进 MMP 生 成的调节因子等 ,其确切机制有待进一步研究。 [参考文献 ] [1 ] 　Shogo K, Toshiyuki K. 　Atherosclerosis and extracellular matrix[J ]. 　J Athero Thromb , 2003 , 10 (5) : 2672274 [2 ] 　李晓东 , 宋 欣 , 谢慧芳. 　活脉饮对正常兔血管扩张后血栓形成及内膜 增生的影响[J ] . 　中国病理生理杂志 , 1999 , 15 (4) : 3522358 [3 ] 　吴运生 , 张红菱. 　实验性动脉再狭窄动物模型的构建与研究 [J ] . 　南 通医学院学报 , 2003 , 23 (3) : 2622265 [4 ] 　李东宝 , 陈 晖 , 沈潞华. 　兔髂动脉粥样硬化模型的动态实验研究 [J ] . 　上海实验动物科学 , 2000 , 20 (4) : 2132216 [5 ] 　Masayuke Y. 　Potential role of statins in inflammation and athrosclerosis[J ] . 　J Athe Thro , 2003 , 10 (3) : 1402144 [6 ] 　张园园 , 张 运 , 张 梅 , 高可花 , 李秀昌 , 李贵华 , 等. 　舒降之、普罗布 考、开搏通和祛淤消斑胶囊对食饵性兔动脉粥样硬化血管内皮舒缩功能 的影响[J ] . 　中国动脉硬化杂志 , 2003 , 11 (2) : 1182122 [7 ] 　Guangpei Hou , Diane M , Margaret AG, Michelle PB. 　Type Ⅷcollagen stimu2 lates smooth muscle cell migration and matrix metalloproteinase synthesis after ar2 terial injury[J ]. 　Am J Pathol , 2000 , 156 (2) : 467 [8 ] 　Nikkari ST , Geary RL , Hatsukami T , Ferguson M , Forough R , Alpers CE , et al. 　Expression of collagen , interstitial collagenase , and tissue inhibitor of metal2 loproteinases21 in restenosis after carotid endarterectomy [J ]. 　Am J Pathol , 1996 , 148 : 7772783 [9 ] 　Elaine W. 　The extracellular matrix can regulate vascular cell migration , prolifer2 ation , and survival : relationships to vascular disease [J ]. 　Inter J Exp Path , 2000 , 81 : 1732182 [10 ] 　周秀霞 , 温进坤 , 韩 梅. 　血管再狭窄发生过程中 MMP22 基因表达与 胶原转换的动态变化 [J ] . 　中国生物化学与分子生物学报 , 1999 , 15 (6) : 99721 001 [11 ] 　Halpert I , Sires UI , Roby JD. 　Matrilysin is expressd by lipid laden macrophages at sites of potential rupture in atherosclerotic lesions and localizes to areas of versican deposition , aproteoglycan substrate for the enzyme [J ]. 　 Proc Natl Acad Sci USA , 1996 , 39 (18) : 9 7482753 (此文编辑 　朱雯霞) 811 ISSN 100723949 Chin J Arterioscler , Vol 14 , No 2