活脉饮对实验性兔动脉粥样硬化病变中胶原及内皮功能的影响

活脉饮对实验性兔动脉粥样硬化病变中胶原及内皮功能的影响 杨智勇 　曹 　乾 　李晓东 　刘红霞 　毛 　颖 　 (中国医科大学附属盛京医院心内科 ,辽宁 　沈阳 　110004) 　　〔摘　要〕　目的　探讨活脉饮对动脉粥样硬化的治疗作用。　通过股动脉内皮剥脱术和高胆固醇喂养的方法建立兔动脉粥样硬化模型 , 观察活脉饮治疗用药后动脉粥样硬化斑块的范围、斑块内胶原含量、血清内皮素 ( ET)、一氧化氮 (NO )的水平 ,并与单纯高脂组、辛伐他汀组比较。 结果　活脉饮高剂量组〔12 g/ ( kg·d) 〕斑块范围较单纯高脂组明显减小 ( P < 0101) ;胶原含量活脉饮高、低剂量组均较单纯高脂组减少 ( P < 0101, P < 0105) ,低剂量组胶原含量较辛伐他汀组高 ( P < 0105) ;与高脂饮食组相比高活脉饮治疗组 NO水平明显增高 ( P < 0101) ;各组的 ET水平均显著 低于高脂饮食组 ( P < 0101)。结论　活脉饮可能对动脉粥样硬化的发生、发展起到抑制作用。 〔关键词〕　动脉粥样硬化 ;胶原 ;内皮功能 ;兔 〔中图分类号〕　R96　　〔文献标识码〕　A　　〔文章编号〕　100529202( 2007) 0420305203 基金项目 :辽宁省自然科学基金 (20042079) 通讯作者 :李晓东 (19632) ,男 ,副教授 ,硕士生导师 ,主要从事冠心病及 高血压病的临床诊治研究。 作者简介 :杨智勇 (19742) ,男 ,讲师 ,硕士 ,主要从事冠心病及介入心脏 病学研究。 　　动脉粥样硬化 (AS)是严重威胁人类健康的疾病 ,预防和 逆转动脉粥样硬化一直是医学界研究的热点问题。胶原是动 脉粥样硬化斑块中的重要组成成分 ,近年研究发现胶原不仅是 AS斑块组织的支架结构 ,而且它对 AS病变进展过程中的一些 关键事件如内膜通透性的改变、平滑肌细胞的迁移和增殖、斑 块的不稳定性等均产生影响〔1, 2〕。近来血管内皮功能在 AS发 生发展中的作用也日益受到关注 ,许多学者认为内皮功能受损 或减退是 AS的始动因素 ,因而维持和恢复正常血管内皮功能 对于防治 AS具有重要意义。活脉饮有益气活血、通络化瘀的 功效 ,目前在临床上多用于脑血管病后遗症的治疗。本实验在 建立动脉粥样硬化动物模型的过程中使用活脉饮进行干预治 疗 ,旨在研究活脉饮对抗动脉粥样硬化的作用。 1　材料与方法 111　动物 　健康雄性日本大耳白兔 40 只 ,体重 ( 213 ± 015) kg, 4～5月龄 (由东北制药厂实验动物部提供 )。随机分 成空白对照组、单纯高脂组、辛伐他汀治疗组、活脉饮低剂量 组、活脉饮高剂量组 ,每组各 8只。 112　方法 11211　试剂与药品 　普通颗粒饲料 , 8%胆固醇的高脂饲料 , 辛伐他汀 (由杭州默沙东制药有限公司生产 ) ,活脉饮主要由黄 芪、丹参、红花、川芎、赤芍等组成。 11212　AS模型制备 　参照文献〔3, 4〕兔动脉粥样硬化模型。 具体方法 :家兔按分组情况喂养 1 w后 ,除空白对照组外其余 各组家兔称重 ,按 011 m l/kg 846合剂肌肉注射麻醉 ,固定于兔 台 ,剪去右侧腹股沟区毛发 ,无菌条件下分离股动脉约 2 cm,穿 线 ,远端结扎 ,近端阻断血流 ,在两线间动脉壁上剪一小口 ,插 入球囊导管 (直径 315 mm) ,进入深度 15 mm,压力表充盈球囊 压力 8个大气压至拉回有阻力时 ,将球囊导管回拉至髂动脉与 股动脉分叉处 ,撤压 ,间歇 1 m in,然后再次重复操作 ,共三次。 退出球囊导管 ,结扎股动脉近心端 ,缝合切口。术后每日肌注 青霉素 40万 U,共 3 d。术后继续按分组情况喂养。术后第 8 周末 ,动物禁食 8 h,用 846合剂麻醉 ,取髂动脉分叉部以上 2 cm处腹主动脉 015 cm左右 ,用生理盐水冲洗两遍并用 10% 福尔马林冲洗两遍后 ,固定备用。 11213　给药方法 　空白对照组喂普通颗粒饲料 , 每只 150 g/d;单纯高脂组喂含 8%胆固醇的高脂饲料 25 g/d +普通 颗粒饲料 125 g/d;后三组在单纯高脂组喂养的基础上分别给 予辛伐他汀 (5 mg/d)及活脉饮〔6 g/ ( kg·d)、12 g/ ( kg·d) 〕, 每周称体重调整活脉饮用量。 11214　观察指标 　形态学观察 :将固定的腹主动脉标本常规 脱水 ,石蜡包埋 ,切片 3～4μm, HE染色 ,采用中国医科大学实 验设备中心图文分析 Metamorph /C5050 /BX41系统计算内弹力 板包绕面积、管腔面积 ,并计算内膜增殖比率〔(内弹力板包绕 面积 -管腔面积 ) /内弹力板包绕面积 〕。每张切片测三次 ,求 平均值。胶原测定采用 Masson染色 ,光镜下观察胶原纤维呈 蓝色 ,平滑肌细胞呈红色。用计算机图文分析系统进行胶原半 定量分析 :阳性目标总面积占统计场总面积的百分比。血清 NO采用硝酸还原酶法测定 ,单位μmol/L;血浆 ET采用放射免 疫法测定 ,单位 pg/m l。 113　统计学处理 　实验数据用 x ±s表示 ,采用 SPSS1115统 计软件 , SNK法单因素方差分析。 2　结 　果 211　一般情况 　实验过程中 ,有 5只动物死亡 , 3只死于腹 泻 , 1只死于术后肢端坏疽感染 , 1只死于术中大出血。实验结 束时 ,正常对照组余兔 6只 ,单纯高脂组 7只 ,辛伐他汀组 6 只 ,活脉饮低剂量组 8只 ,活脉饮高剂量组 8只。 212　病理形态学变化 　肉眼观察 ,正常对照组内膜表面光滑 , 无隆起。单纯高脂组动脉弹性明显下降 ,内膜有明显隆起 ,管 腔狭窄。辛伐他汀组、活脉饮高剂量组、活脉饮低剂量组动脉 内膜亦有不同程度的隆起 ,但较单纯高脂组轻。光镜观察正常 对照组动物管腔未见异常改变 ,内膜表面光滑 ,内皮细胞完整 连续 ;高脂饮食组内膜明显增厚 ,有的甚至环管壁全周 ,管腔狭 ·503·杨智勇等　活脉饮对实验性兔动脉粥样硬化病变中胶原及内皮功能的影响　第 4期 窄 ,增厚的内膜中含大量泡沫细胞 ,内膜表面不光滑 ,内皮细胞 缺失或不连续 ;辛伐他汀组可见内膜局限性隆起 ,内膜下可见 少量散在泡沫细胞 ;活脉饮低剂量组内膜亦增厚 ,但未达管壁 全周 ;活脉饮高剂量组内膜增厚程度较低剂量组轻 (图 1) ,但 其斑块范围较辛伐他汀组大。内膜增殖比率各实验组与正常 对照组比较具有显著性差异 ( P < 0101) ,活脉饮高剂量组与辛 伐他汀组、活脉饮低剂量组与单纯高脂饮食组差异无显著性 (表 1)。 图 1　各组动脉粥样硬化斑块 ( HE染色 , ×40) 图 2　各组胶原分布 (M a sson染色 , ×400) 表 1　活脉饮对腹主动脉粥样硬化面积的影响 ( x ±s) 分组 n 内膜增殖比率 ( % ) 正常对照组 6 16116 ±2158 单纯高脂组 7 57145 ±91841) 辛伐他汀组 6 32177 ±161221) 活脉饮低剂量组 8 48168 ±131191) 活脉饮高剂量组 8 41134 ±91801) 2) 　与正常对照组比较 : 1) P < 0101;与单纯高脂组比较 : 2) P < 0105 213　胶原变化 　正常对照组胶原含量甚微 ,内膜几乎未见蓝 色染色区域 ;高脂饮食组增厚内膜几乎全部染为蓝色 ,仅在内 膜与中膜交界处可见染色为红色的平滑肌细胞散在其间 ,并可 见脂质空泡 ;活脉饮高剂量组和辛伐他汀组 AS斑块内蓝色染 色区域主要位于斑块纤维帽及斑块肩部 ,染色范围较高脂饮食 组小。活脉饮低剂量组 AS斑块内蓝色胶原纤维与红色平滑肌 细胞混杂出现 ,并可见脂质空泡 (图 2)。计算机图文分析染为 蓝色总面积占统计场总面积的百分比对胶原含量进行半定量 , 并做统计学分析显示 :各实验组与正常对照组比较差异均具有 统计学意义 ( P < 0101) ,活脉饮高剂量组和辛伐他汀组较高脂 饮食组比较具有显著性差异 ( P < 0101) ,活脉饮低剂量组与高 脂饮食组、辛伐他汀组比较差异有显著性 ( P < 0105) (表 2)。 表 2　各组 NO和 ET水平 ( x ±s)项目 组别 n 实验第 1周末 实验第 10周末NO 正常饮食组 6 68183 ±17151 64183 ±9175辛伐他汀治疗组 6 69133 ±14112 57117 ±15122高活脉饮治疗组 8 67188 ±12152 93175 ±551241)低活脉饮治疗组 8 66125 ±13113 73188 ±19187高脂饮食组 7 61186 ±12151 45157 ±10199ET 正常饮食组 6 96167 ±8136 96167 ±91481)辛伐他汀治疗组 6 96100 ±6132 74100 ±141481)高活脉饮治疗组 8 95163 ±15117 85144 ±151321)低活脉饮治疗组 8 96150 ±11113 91112 ±271911)高脂饮食组 7 97100 ±12194 148129 ±40157　与高脂饮食组比较 : 1) P < 0101214　各组 NO和 ET水平变化 　见表 2。分组喂养前 (实验第1周末 )各组家兔 NO和 ET水平无明显差异。实验第 10周末与高脂饮食组相比 ,正常饮食组、辛伐他汀治疗组、高活脉饮治疗组和低活脉饮治疗组的 NO水平均较高 ,但只有高活脉饮治疗组具有统计学意义 ( P < 0101) ;上述各组的 ET水平均显著低于高脂饮食组 ( P < 0101)。活脉饮治疗组与辛伐他汀治疗组相比 , NO和 ET水平均有所增高 ,但无统计学意义。高活脉饮治疗组和低活脉饮治疗组相比 ,前者 NO水平较高且 ET水平较 ·603· 中国老年学杂志 2007年 2月第 27卷 低 ,但均无统计学意义。 3　讨 　论 　　活脉饮为补阳还五汤和血府逐瘀汤的拆方组合 ,其主要成 分为当归、黄芪、川芎、赤勺、红花。研究证实其具有抑制正常 兔血管扩张术后局部附壁血栓形成及减轻内膜细胞增生的作 用。本实验在通过股动脉内皮拨脱术和高胆固醇喂养的方法 成功建立兔动脉粥样硬化模型的基础上 ,给予活脉饮治疗用药 后 ,高剂量组动脉粥样硬化斑块的范围较单纯高脂饮食组明显 减小 ,而每天喂服 6g/kg活脉饮的低剂量组与单纯高脂饮食组 比较无明显差异。辛伐他汀作为调脂药 ,其可通过降脂及改善 内皮功能、抗炎等降脂以外的作用延缓动脉粥样硬化的进 程〔3〕。本实验将辛伐他汀作为阳性对照药物 ,发现活脉饮高剂 量组动脉粥样硬化斑块范围虽较辛伐他汀组大 ,但无统计学差 异 ;而低剂量组较辛伐他汀组斑块范围较大 ,说明活脉饮具有 抗兔动脉粥样硬化的作用 ,而且具有一定的剂量依赖性。随着 对动脉粥样硬化发病机制研究的不断深入 ,众多研究发现 ,胶 原作为细胞外基质的主要成分 ,不仅是粥样硬化斑块的支架结 构 ,而且它还在动脉粥样硬化病变进程中发挥重要的作用〔1〕。 在许多动物实验中发现胶原可抑制平滑肌细胞的迁移和增 殖〔2〕,本实验从该角度对活脉饮的抗动脉粥样硬化的作用机制 进行了探讨 ,结果发现胶原含量在活脉饮高剂量组和辛伐他汀 组较少 ,而在单纯高脂组则较多 ,故推测活脉饮的抗动脉粥样 硬化机制之一可能与促进粥样硬化斑块内胶原的降解有关。 NO和 ET是依赖于血管内皮细胞的一对重要的活性物质 ,血液 中二者的水平变化能反映出内皮的功能状态。NO是作用强大 的内源性血管舒张因子 ,由内皮细胞合成。NO不仅在基础状 态下分泌 ,许多活性物质如乙酰胆碱 (Ach)、P物质、缓激肽、凝 血酶、组胺、聚集的血小板和血流所致的切应力变化等均可刺 激血管内皮细胞释放 NO〔4, 5〕, NO弥散至内膜下的血管平滑肌 , 激活血管平滑肌内鸟苷酸环化酶 ,导致环鸟苷酸的浓度增加 , 细胞内钙离子浓度降低 ,从而引起内皮依赖性的血管舒张〔6〕。 此外 , NO对 ET的合成和释放也有抑制作用 ,还能清除氧自由 基 ,所以 NO具有显著的抗 AS作用。ET是目前发现的最强的 内源性缩血管物质 ,且能促进血管平滑肌细胞增殖、刺激黏附 分子分泌、趋化单核细胞、增强内皮细胞通透性 ,激活交感神经 和肾素 -血管紧张素系统 ,因此具有致 AS作用〔7〕。本实验中 观察到 ,给予活脉饮治疗的家兔 NO水平比高脂饮食组有增高 的趋势 ,其中高活脉饮治疗组家兔 NO水平的升高已具有统计 学意义 ;而 ET水平则显著降低 ,提示活脉饮能提高 NO水平 ,降 低 ET水平 ,具有保护血管内皮功能的作用 ,并可能通过此机制 抑制动脉粥样硬化的发生发展。至于活脉饮究竟是影响 NO和 ET的合成还是释放 ,对其活性是否有影响 ,尚需进一步研究加 以探讨。大量研究已证实 ,他汀类药物最突出的非降脂作用是 改善血管内皮功能〔8～10〕,该作用的机制尚未完全阐明 ,但已有 多个实验证实他汀类药物能增加血管舒张因子 NO的生物活 性、减少血管收缩因子 ET的合成〔11～14〕。本实验中观察到辛伐 他汀治疗组家兔的 NO水平高于高脂饮食组 ,但可能因为样本 量小或药物剂量较小 ,未达到统计学差异 ;而 ET水平则低于高 脂饮食组 ( P < 0101) ,与既往研究的结论一致。本实验证实 :活 脉饮能升高实验性动脉粥样硬化家兔血液中 NO的水平 ,降低 ET的水平 ,且呈剂量依赖性 ,对血管内皮细胞功能有保护作用 , 并能减少斑块内胶原的聚集 ,活脉饮可能通过上述机制对动脉 粥样硬化的发生、发展起到抑制作用。 4　参考文献 1　Guangpei Hou, D iane M,Margaret AG, et al1Type Ⅷ collagen stimulates smooth muscle cell m igration and matrix metallop roteinase synthesis after arterial injury〔J〕1Am J Pathol, 2000; 156 (2) : 4671 2　Elaine W1The extracellular matrix can regulate vascular cell m igration, p 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