谷丙转氨酶

南京大三阳医院 南京大三阳医院 谷丙转氨酶（GPTGPTGPTGPT）活性的测定预习 1.研究背景：转氨酶是体内重要的一类酶。转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的 α–酮基之间的相互转化，从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸，这种作用称为转氨基 作用。它在生物体内蛋白质的合成，分解等中间代谢过程中，在糖，脂及蛋白质三大物质代 谢的相互联系，相互制约及相互转变上都起着很重要的作用。 故转氨酶是氮代谢中不可缺 少的一种酶，本次实验测定谷丙转氨酶活性不但可以进一步完善了转氨酶活性研究领域，并 且对其他种类转氨酶活性测定具有一定指导作用，测得数据还可以作为临床医学参数造福人 类。 2.2.2.2.研究目标：由于催化活性是酶的一个独特属性。酶蛋白质质量再多，纯度再高，如果 没有活性往往是毫无意义的。实验用赖氏法分别测定兔子肝脏和血清中GPT 活性，藉以作 为谷丙转氨酶研究的一个基础。 3.3.3.3.研究策略：根据本次酶活力单位和酶比活定义，通过一定技术手段测定在该条件下由 酶催化产生的丙酮酸的量，进而间接反应酶的比活。由于丙酮酸与 2,4—二硝基苯肼反应所 生成的丙酮酸二硝基苯腙，在碱性环境中于 520nm下的特异光吸收在一定的浓度范围内符 合朗伯比尔定律，故可以用比色法测定丙酮酸的含量，便可以计算出肝脏和血清中谷丙转氨 酶的比活。 4444．研究及可行性分析：现在可以对反应环境可以做到相当准确的控制，pH 值可以通过缓冲溶液控制，反应的温度可以通过恒温水域箱控制，电子天平可以测定万分之 一克以及精确的容量瓶这样可以保证标准管丙酮酸的浓度的准确性。虽然这些实验基础具备 了但是由于α-酮戊二酸和 2,4—二硝基苯对显色的干扰，以致丙酮酸产量与酶量的关系并不 始终成线性关系，其理论误差可以控制相应物质浓度尽量减小。同时，在操作过程中酶在相 应条件下反应的时间，以及将试管同时放入和取出水浴的时间不能够精确保证，造成进一步 的误差。故本次实验虽具有一定的可操作性，但由于其中引入的误差过程比较多，应该注意 保证每一步的正确性，同时通过卡门氏单位进行校正，进而减小实验误差对可操作性带来的 影响。 5555．具体实验： 5.15.15.15.1实验材料：家兔的肝脏和血清 5.25.25.25.2实验仪器：722-光栅分光光度计、离心机、电热恒温水浴锅、匀浆机、移液器、100ml 容量瓶若干、15ml 具塞刻度试管若干 5.35.35.35.3具体操作步骤 1．肝匀浆液制备：新鲜肝脏用生理盐水冲洗后沥干，取1g 以 9ml 预冷的pH7.4 的 0.1M 磷 酸缓冲液在冰浴上充分匀浆（10%肝匀浆），4000 转低温冷冻离心15 分钟取上清液冰浴中备 用，酶活测定时视情况一般还需稀释至少50 倍使用。 2. 血清的制备：心脏采血，分装至预先用生理盐水浸润过的离心管中，3000 转低温冷冻离 心15 分钟取血清冰浴中备用。 3.谷丙转氨酶活力的测定 南京大三阳医院 南京大三阳医院 （1）取试管 2 支，分别注明“测定管”、“对照管”，按照一（均要做三个平行） 进行操作； （2）记录测定管与对照管的吸光度，将测定管吸光度减去对照管吸光度然后根据表二绘 制的标准曲线计算出对应丙酮酸含量； （3）谷丙算转氨酶活力计算：由丙酮酸-OD520520520520标准曲线求得丙酮酸含量，带入丙酮酸 含 量与卡门氏单位线性回归方程，求得对应的卡门氏单位。 （4）根据上述酶活力单位，计算出每克肝组织或每ml 血清中总活力单位。 表一： 谷丙转氨酶的测定 测定管 对照管 0.1 —— 0.5 0.5 混合后，37℃水域30min 0.5 0.5 —— 0.1 5 5 稀释后肝脏溶液或血清/ml 基质液/ml， 37℃预热5min 室温放置10min,在520nm比色， 以蒸馏水调零，测各管吸光度 0.4M NaOH/ml 混合后，37℃水域20min 稀释后肝脏溶液或血清/ml 2,4-二硝基苯肼液/ml 4.赖氏法测定谷丙转氨酶活力标准曲线绘制，按表二操作； 表二： 标准曲线绘制表格 管号 1 2 3 4 5 6 0.1M 磷酸缓冲液/ml 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 2uM丙酮酸标准溶液/ml 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 基质缓冲溶液/ml 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 2,4-二硝基苯肼/ml 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 混匀后，37℃水域20min 0.4M NaOH/ml 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 室温放置 10min，在520nm 比色，以蒸馏水调零，测各管吸光度 表三： 数据记录表格 管号 1 2 3 4 5 6 肝测1 肝测2 肝测3 血测1 血测2 血测3 肝对1 肝对2 肝对3 血对1 血对2 血对3 备注：“肝测”表示“肝脏测定管”，“肝对”表示“肝脏测定对照管”，血清的简称亦然。 5.用 EXCEL 以各管吸光度减去 1号管吸光度，所得差值为纵坐标，相应的丙酮酸浓度为横坐 标，作标准曲线图； 5.45.45.45.4每一步的作用 （1）稀释肝脏匀浆液的作用是：因为酶量过高时，丙酮酸产量与酶量之间更加不符合线性 关系，稀释后可以避免由于肝脏酶活力过高，对测定的影响； （2）测定管加入稀释后的肝脏溶液是为了提供谷丙转氨酶，作为对照管故不加稀释后的肝 脏溶液； （3）对基质液预热是为了使得一定时间内酶促反应温度恒定，加入基质液是为了让具有酶 的试管启动转氨反应； （4）准确保温 30min 是为了控制酶促反应时间，方便衡量酶的比活； 南京大三阳医院 南京大三阳医院 （5）加入 2,4-二硝基苯肼是为了使得转氨酶失活，同时作为与丙酮酸反应的底物； （6）对照管加入等量稀释后的肝脏是为了减少测定误差，尽量出去除丙酮酸二硝基苯腙对 OD值的影响； （7）溶液混合后，37℃水域 20min 是使得丙酮酸充分地与 2,4-二硝基苯肼反应； （8）加入 5ml 0.4MNaOH是为了提供碱性环境，使丙酮酸二硝基苯腙呈现特异性光吸收。 5.55.55.55.5最关键的步骤 5.65.65.65.6时间分配（预计完成时间）： 6666质疑及相关思考 (1)转氨酶在细胞内的作用及生理意义？细胞内有众多的转氨酶，但相关研究及医学临床应 用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活力，而极少测定其它转 氨酶活力，你推测可能的原因会是什么？为什么？ 转氨酶在代谢中起着非常重要的作用，因为多数氨基酸都可以通过转氨酶作用脱去氨基 进行降解，并且所有氨基酸的合成过程中，其氨基酸都是直接或者间接地来自谷氨酸参与的 转氨基过程；医学临床中只是检测 GPT和 GOT，肝脏中 GPT活力最高，GPT 活力测定可诊断 肝功能的正常与否，急性肝炎患者血清中GPT 活力可明显地高于正常人GPT，测定GOT 活力 则有助于对心脏病变的诊断，心肌梗塞时血清中GOT 活性显示上升。而其他转氨酶在身体各 个器官和部位相当，测量其他转氨酶对医疗方面指导意义不大。 (2)转氨酶催化的是双底物可逆反应，根据酶活力测定的总体思路，在设计转氨酶的活力测 定实验方案时如何保证测得的是反应的初速度？为什么？ 首先，在不影响测定的前提下保证底物浓度足够大；其次，考虑反应时间和产物浓度， 二者权其重的前提下尽量减少反应时间。由于此时产物浓度相对于底物浓度是非常小的，这 样就可以忽略逆反应带来的影响。 (3)转氨酶测定是医学临床上用以检测相关疾病的重要指标，测定方法的历史建立了金氏法、 穆氏法及赖氏法（包括改良赖氏法），请查询资料，分别明确三种方法的酶活单位定义、各 南京大三阳医院 南京大三阳医院 自测定的酶促反应时间，三种方法的主要异同点。目前临床检测国家规定使用的为赖氏法， 为什么做如此选择？实验指导上三份转氨酶测定的资料所使用的各是何种方法？ 金氏法单位定义是：每1ml 血清在37℃条件下与底物作用 60 min，生成1μmol 丙酮酸 称为一个单位。穆氏法单位定义是：每毫升血清在 pH=7.4，37℃条件下与底物作用30 min， 每生成2.5 微克丙酮酸为 1单位。赖氏法没有制定自身的单位定义，而是以实验数据套用速 率法的卡门氏单位。1个卡门氏单位的定义是：在温度 25℃，pH7.4，波长 340nm，光径 1cm 的条件下，1ml血清使 NADH 的吸光度下降 0.001 的转氨酶活性。卡门氏单位不是用物质的 量浓度，而是用物质的吸光度表示酶的活性单位的。若将卡门氏单位的定义条件代入国际单 位计算公式，即得卡门氏单位与国际单位的换算关系：1 卡门氏单位=0.4821 IU/L(25℃)， 便可将卡门氏单位兑换成国际单位。金氏法60min ，穆氏法和赖氏法 30min。三种方法主要 异同点：其原理、试剂、操作步骤及作用温度等完全相同，不同之处在于作用时间。 在赖氏法中尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响 测定结果，但因其量不多，加之对505nm 的吸光度远不如丙酮酸生成的丙酮酸二硝基苯腙化 合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈 弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确，其结果与速率法数据相近。故卫生部临 检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。 第一个用的是金氏法，第二个用的是穆氏法，第三个用的是赖氏法。 (4)转氨酶活力测定的卡门氏单位的由来？为何设计的标准曲线要以卡门氏单位为横坐标， 而不是以标准丙酮酸含量为横坐标？ 虽然金氏法、穆氏法、赖氏法操作相对于速率法测定转氨酶活力要简便，但α-酮戊二 酸的干扰使得前三种方法的精确性不如速率法，而速率法原理是：还原辅酶I 在 340nm 处有 最大光吸收，因此伴随还原辅酶 I不断被丙酮酸氧化，340nm 光吸收值随之下降，下降速率 和谷丙转氨酶活力成比例，籍此测定谷丙转氨酶活力，故产生了卡门氏单位：1ml血清在 25 ℃，340nm，体积为3ml，光径为 1cm每分钟光密度下降 0.001的酶量。 查资料无果，我认为 标准曲线以卡门氏单位为横坐标是为了方便计算，避免其他单位 和卡门氏单位转换。 (5)实验指导上转氨酶活力测定的前两份资料中没有设计标准曲线，这种设计与第三份设计 了标准曲线的方案有何异同？ 这三种方法本质相同，仅因为赖氏法使用卡门单位对数值进行校准更加精确。由于最初 测定认识有限，前两种方法相对于第三种方法没有设计标准曲线，在测定配置溶液 OD 值与 丙酮酸含量之间线性关系也不如赖氏法好。如果对精度要求不是很高可以用前两种方法，操 作更加简便。 南京大三阳医院 南京大三阳医院 实验相关试剂配置 1.标准柠檬酸溶液 2.（0.1mol/l）磷酸 缓冲溶液 3.谷丙转氨酶底物 62.5mg 丙酮酸钠 13.97g K2HPO4 0.9g L-丙氨酸 100ml 0.05mol/lH2SO4 2.69g KH2PO4 29.2mg α-酮戊二酸 1000ml 蒸馏水 溶于pH7.4 0.1mol/l的磷 酸缓冲溶液5 0.4mol/l NaOH 溶液 将4mol/lNaOH 稀释10倍 用 1mol/lNaOH 调节 pH 值 到 7.4 4.（0.02% ）2,4-二硝基苯肼溶液 用上述磷酸缓冲溶液稀释 至 100ml 20mg溶质溶于少量1mol/l HCL中， 加热溶解； 用 1mol/lHCL稀释至 100ml