第八章_目的基因的制备

nullnull目的基因的制备null目的基因: 为使优良性状聚集于同一生物体，在生物群体中分离其编码蛋白（酶）的基因，创造出有价值的新物种。null目的基因的制备: 构建基因组文库 构建cDNA基因文库 利用聚合酶链式反应技术 基因的化学合成基因文库基因文库基因文库＝基因组文库＋cDNA文库 基因组文库：来源于基因组DNA，反映基因组的全部信息，用于基因组物理图谱的构建，基因组序列分析，基因在染色体上的定位，基因组中基因的结构和组织形式等。 cDNA文库：来源于细胞表达出的RNA，反映基因组表达的基因序列信息，用于研究特定细胞中基因的表达状态和表达基因的功能等。 null基因组文库构建基因组文库构建 用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。null基因组文库必须符合的基本条件： 文库能够覆盖整个基因组 插入的片段比较大 文库比较稳定，且容易保存和操作null 基因组文库的大小： N=ln(1-P)/ln(1-f ) N：文库必需的克隆数 P：文库中目的DNA片段的出现概率 f：插入片段大小/全基因组大小的比值null 期望值为0.99，插入片断为20kb的 E.coli (4.6×106 bp) 和 human (3×109 bp) 基因组的克隆数的计算 N E.coli= =1.1 ×103 ln( 1-0.99) ln[1-(2×104/4.6×106)]Nhuman= = 6.9 ×105 ln(1-0.99) ln[1-(2 ×104/3 ×109)] 这个例子说明用质粒载体（插入片断5-10kb ）就可以建立很好的原核生物基因文库，只需要几千个克隆；而真核生物则需要更大承载能力的载体。nullnull有一些序列不能被克隆 Example: 1.序列缺乏酶切位点; 2.目的基因包容在一个其大小范围超出载体承载能力的DNA片断上 null基因组文库构建的基本步骤： 大片段DNA克隆载体的准备 大分子质量的植物基因组DNA制备 大片段DNA分子的部分酶切 载体与外源片段的连接 载体的遗传转化null载体 根据基因组的大小选择合适的载体构建DNA文库。 载 体 Plasmid phageλ cosmid BAC YAC 插入片断 (kb) 5 23 45 350 1000 null  利用质粒载体 构建基因组文库该法简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物。null利用λ噬菌体构建基因组文库null利用考斯质粒构建基因组文库null利用YAC构建基因组文库cDNA文库cDNA文库 cDNA文库( completement DNA Library)：某生物基因组转录的全部或部分mRNA经反转录产生的各种cDNA片段，分别与载体重组而存在于一种受体的群体， 即cDNA基因(部分)文库。null基因组文库 包含该生物基因组DNA全部的序列 是具有生物种属特异性的。 cDNA文库: 已经过剪接、去除了内含子的cDNA。 具有组织细胞特异性cDNA文库的构建cDNA文库的构建载体DNA片段的制备 分离细胞总RNA 以mRNA 为模板，合成cDNA 第一链 双链cDNA 的合成null mRNA纯化的方法:以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效。 原理：利用mRNA 3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱。null洗脱rRNA和tRNA收集洗脱下来的mRNA用纤维素柱纯化mRNA的流程示意图利用聚合酶链式反应技术利用聚合酶链式反应技术以已知序列为基础的克隆方法以已知序列为基础的克隆方法获取基因序列的途径：从文献中查取 EMBL:设在欧洲分子生物学实验室的基因库 网址为:http://www.ebiac.uk/ebi-home. html Genbank:设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库 网址:http://www.ncbi.nlm.nih. gov/web/search/index.html nullnullnull测 序部分氨基酸序列简并引物 部分cDNA作为探针基因组 文库cDNA文库目的片段RACE -PCR目的片段部分RNARACE-PCR（末端快速扩增技术 ）RACE-PCR（末端快速扩增技术 ）使用此种方法的目的？（在什么情况下用） 基于什么技术（方法） 基本过程（基本原理）以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法使用此种方法的目的？（在什么情况下用） 基于什么技术（方法） 基本过程（基本原理）定位克隆（图位克隆)定位克隆（图位克隆)以分子标记连锁图谱为基础的基因克隆方法。 原理：根据基因在图谱上的相对位置来进行基因克 隆的一种方法。 步骤：null 从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段，等于在染色体上移了一步，故称之为染色体步移 。 染色体步移null基因组 文库基因组 文库目的基因染色体步移功 能 鉴 定以人工突变体为基础的基因克隆方法以人工突变体为基础的基因克隆方法使用此种方法的目的？（在什么情况下用） 基于什么技术（方法） 基本过程（基本原理）以人工突变体为基础的基因克隆方法以人工突变体为基础的基因克隆方法 转座子:是指基因组中一段特定DNA片段，能在转位酶的作用下从基因组的一个位点转移到另一个位点。 原理：转座的结果是使被转入的基因失活，从而有效地诱导产生表型突变株。获得突变体途径转座子T-DNAnullnullTi质粒null基因标鉴法：该法是利用转座子或T-DNA插入植物 的基因组中引起某一基因失活产生一些突变体，然 后用相应转座子或T-DNA对突变体文库进行筛选， 获得突变体，以此克隆目的基因。null转座子标签法克隆基因步骤含有转座子和基因的载体构建遗传转化突变体筛选反向PCR 或TAIL-PCR 获得侧翼序列利用侧翼序列为探针分离基因建立突变体文库基因组文库以表达差异为基础的基因克隆方法以表达差异为基础的基因克隆方法文库扣除杂交法 mRNA差异显示反转录PCR 抑制消减杂交法 代表性的差异显示法 文库扣除杂交法文库扣除杂交法使用此种方法的目的？（在什么情况下用） 基于什么技术（方法） 基本过程（基本原理）null表达目的基因的组织或细胞不表达目的基因的组织或细胞制备mRNA制备mRNA获得cDNA制备cDNA文库放射自显影放射自显影特有的阳克隆不同探针杂交的相应克隆原初平板原初平板含目的基因的阳克隆制备cDNA探针制备cDNA探针同从原初平板影印的硝酸纤维素滤膜杂交同从原初平板影印的硝酸纤维素滤膜杂交mRNA差异显示反转录PCRmRNA差异显示反转录PCR使用此种方法的目的？（在什么情况下用） 基于什么技术（方法） 基本过程（基本原理）null抑制消减杂交法抑制消减杂交法使用此种方法的目的？（在什么情况下用） 基于什么技术（方法） 基本过程（基本原理）抑制性消减杂交示意图抑制性消减杂交示意图null技术： 杂交二级动力学原理：即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链DNA相对含量达到基本一致。 抑制PCR：是利用链内退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制了非目的基因片段的扩增。