1120例肺炎克雷伯菌和AmpC酶检测及耐药分析

·临床与药物· 120 例肺炎克雷伯菌 ESBLs 和 AmpC 酶 检测及耐药分析 叶建敏 (台州医院路桥院区 ,浙江 台州 318050) 　　【摘 　要】　目的 　探讨本院儿科病区下呼吸道标本中分离的肺炎克雷伯菌超广谱β- 内酰胺酶 ( ESBLs) 和头孢菌素酶 (AmpC酶)的情况及耐药分析。方法 　采用改良的酶提取物三维试验法检测 ESBLs 和 AmpC酶 ,采用纸片扩散 ( K- B) 法检测 肺炎克雷伯菌对 13 种抗生素的耐药率。结果 　从 120 株下呼吸道标本中分离的肺炎克雷伯菌中单产 ESBLs ,单产 AmpC酶和 同时产 AmpC酶 + ESBLs 的阳性率分别为 2018 %(25/ 120) ,1010 % (12/ 120) 和 412 % (5/ 120) 。单产 AmpC 酶、单产 ESBLs 及同 时产 AmpC酶 + ESBLs 对 13 种抗生素的耐药率大部分均高于不产酶菌株。结论 　本院儿科病区下呼吸道标本中分离的肺炎 克雷伯菌对β- 内酰胺类抗生素耐药的主要原因是产生 AmpC酶和 ESBLs ,对产酶菌株临床用药首选碳青霉烯类抗生素 , 其次是β- 内酰酶类抗生素和酶抑制剂、头霉类抗生素及其他敏感抗生素。 【关键词】　下呼吸道 　肺炎克雷伯菌 　超广谱β- 内酰胺酶 　头孢菌素酶 　耐药 　　超广谱β - 内酰胺酶 ( ESBLs) 和头孢菌素酶 (AmpC酶)是 20 世纪 80 年代以来产生的两大类β- 内酰胺酶。由于这两类酶对广谱青霉素、第三代头 孢菌素和单环β内酰胺类抗生素均有较强的水解 灭活作用 ,因此对产 AmpC 酶和 ESBLs 细菌的检测 和防治日益引起临床微生物学家和医务工作者的 高度重视。肺炎克雷伯菌是引起患儿下呼吸道感 染的主要病原菌之一。为了解本院患儿下呼吸道 感染肺炎克雷伯菌产 AmpC 酶和 ESBLs 的情况 ,检 测了本院儿科病区临床送检的下呼吸道标本分离 120 株肺炎克雷伯菌产 AmpC 酶和 ESBLs 的情况及 其耐药特征 ,现将结果报告如下。 1 　材料与方法 111 　菌株来源 　试验菌株为 2003 年 1 月～2007 年 12 月本院儿科病区送检的下呼吸道标本 (痰液) 中分离的肺炎克雷伯菌 120 株。大肠埃希菌 ATCC 25922 为不产酶株、肺炎克雷伯菌 ATCC700603 为 ESBLs 质控菌株、阴沟肠杆菌 029M 为 AmpC 酶质控 菌株。所有菌株都用法国生物梅里埃公司的Vitek - 32 型全自动微生物分析仪、GNI + 鉴定卡进行鉴定。 112 　仪器及试剂 　Vitek - 32 型全自动微生物分析 仪及 GNI + 细菌鉴定卡均为法国生物梅里埃公司产 品 ;药敏纸片均购自杭州天和微生物试制有限公 司 ;亚胺培南购自法国生物梅里埃公司 ;M - H 琼脂 为杭州天和微生物试剂公司产品。 113 　细菌鉴定和药敏试验 　用法国生物梅里埃公 司的 Vitek - 32 型微生物分析仪、GNI + 鉴定卡进行 菌株鉴定。药敏试验按 NCCLS 2004 年推荐的 K- B 琼脂扩散法操作并判断结果。 114 　AmpC酶及 ESBLs 检测 11411 　酶粗提物制备 　按文献 [ 1 ]进行并略作改 动 ,取普通平皿上过夜培养的受试菌菌落制成 115 ×108CFU/ m l 菌液 ,取 25μl 菌液加入 6ml LB 肉 汤 ,35 ℃恒温摇床 200r/ min ,孵育 5 小时。将 6ml 培 养液 4000/ min ,4 ℃离心 20 分钟 ,弃上清液。将沉淀 加入 0175ml 0101mol/ L 磷酸盐缓冲液 (pH 710) ,混 匀 , - 80 ℃反复冻融 5 次 ,14000r/ min ,4 ℃离心 2 小 时 ,弃沉淀。取上清液 ,经 MH 琼脂平板上常规细 菌培养阴性后于 - 20 ℃保存。 11412 　AmpC酶分析 　按文献 [1 ]进行标准的纸片 扩散法操作 ,将 115 ×108 CFU/ ml 菌液接种于MH琼 脂平板上 ,取 30μg 头孢西丁纸片置于平皿中心 ,使 用自制刀片在离纸片边缘 5mm 处放射性地由里向 外切割一道狭逢 (15mm ×1mm) ,用微量加样器取 40 μl 酶粗提物由里向外加入狭缝内 ,尽量避免酶液溢 出狭缝。将培养基 35 ℃孵育过夜。若观察到狭逢 与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区域 ,视为三维试 验阳性 ,即 AmpC酶阳性。 11413 　ESBLs 分析 　按文献 [1 ]用 30μg 头孢曲松 纸片取代头孢西丁 ,用 36μl 的酶粗提液加上 4μ12 × 104μmol/ L 取代 40μl 酶粗提液 ,其余操作同 31212 , 若观察到狭逢与抑菌圈交接处出现扩大的长菌区 域 ,视为三维试验阳性 ,即 ESBLs 阳性。 2 　结 　果 211 　肺炎克雷伯菌中单产AmpC酶、单产 ESBLs 和 ·96·浙江实用医学 2009 年 2 月第 14 卷第 1 期 Zhejiang Practical Medicine February ,2009 ,Vol . 14 ,No. 1 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net AmpC酶 + ESBLs 的阳性率 　从 120 株下呼吸道标 本中分离的肺炎克雷伯菌中单产 ESBLs25 株 ,阳性 率为 2018 % ,单产 AmpC酶 12 株 ,阳性率为 1010 % , 同时产 AmpC酶和 ESBLs 5 株 ,阳性率为 412 %。 212 　120 株肺炎克雷伯菌对 13 种抗生素的耐药率　单产 AmpC酶、单产 ESBLs 及 AmpC酶 + ESBLs 对13 种抗生素的耐药率大部分均高于不产酶菌株。结果见表 1。 表 1 　120 株肺炎克雷伯菌对 13 种抗生素的耐药率 ( %) 抗生素 肺炎克雷伯菌(120 株) AmpC酶和 ESBLs 均阴性 (78 株) AmpC酶阳性 (12 株) ESBLs 阳性 (25 株) AmpC酶和 ESBLs 均阳性 (5 株) 　氨苄西林 79(6518) 37 (4714) 12 (100) 25 (100) 5 (100) 氨苄西林/ 舒巴坦 72(6010) 35 (4419) 12 (100) 20(8010) 5 (100) 　哌拉西林 71(5912) 29 (3712) 12 (100) 25 (100) 5 (100) 哌拉西林/ 他唑巴坦 31(2518) 7 (910) 0 21(8410) 3(6010) 　头孢唑林 70(5813) 28 (3519) 12 (100) 25 (100) 5 (100) 　头孢噻肟 38(3117) 21 (2619) 5 (4117) 7 (2810) 5 (100) 　头孢吡肟 33(2715) 12 (1514) 2 (1617) 14(5610) 5 (100) 　头孢泊肟 60(5010) 18 (2311) 12 (100) 25 (100) 5 (100) 　头孢西丁 34(2813) 14 (1719) 12 (100) 3 (1210) 5 (100) 　亚胺培南 0 0 0 0 0 　氨曲南 62(5117) 20 (2516) 12 (100) 25 (100) 5 (100) 　庆大霉素 35(2912) 19 (2414) 4 (3313) 7 (2810) 5 (100) 　丁胺卡那霉素 38(3117) 22 (2812) 6 (5010) 6 (3010) 4(8010) 3 　讨 　论 ESBLs 和 AmpC 酶是近年来国际上研究较为活 跃最主要的两种β- 内酰胺酶[2 ,3 ] 。ESBLs 大多数 由 TEM - 1 ,TEM - 2 及 SHV - 1 发生突变的衍生物 , 能水解青霉素类、头孢菌素类及单酰胺类 ,能被克 拉维酸等酶抑制剂所抑制 ,对头霉素类及碳青霉烯 类敏感。AmpC酶由 AmpC 基因编码产生 ,AmpC 基 因通常位于肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、沙雷菌属及 假单胞菌属细菌的质粒上并随细菌复制而编码产 生 AmpC 酶 ,导致大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对三 代头孢菌素及酶抑制剂的耐受[4 ] 。作者采用改良 三维试验检测 ESBLs 和 AmpC 酶 ,从 120 株临床标本 分离的肺炎克雷伯菌中检出 42 株 AmpC 酶或ESBLs , 检出率高达 3510 % ,其中单产 ESBLs ,单产AmpC酶 和 AmpC 酶 + ESBLs 的阳性率分别为 2018 % , 1010 %和 412 % ,与国内文献报道基本一致[5 ] 。可 见随着近年来大量新广谱抗生素 ,特别是第三代头 孢菌素的使用率增高 ,肺炎克雷伯菌的产 ESBLs 和 AmpC酶的比率呈现越来越高的趋势 ,应引起重视。 从表 1 可以看出 ,产酶菌株对抗生素的耐药率 大部分均高于不产酶菌株 ,并且与喹诺酮类、氨基 糖苷类等多种抗生素存在交叉耐药。这是由于 ES2 BLs 和 AmpC酶的耐药基因常由可结合性大质粒编 码 ,后者可携带对喹诺酮类、氨基糖苷类等多种抗 生素的耐药基因形成具有多种耐药表型的泛耐药 菌[6 ] 。本组患者中产 ESBLs 株耐药率极高 ,除对亚 胺培南和头孢西丁外几乎对其他所有抗菌药物均 耐药 ,而产 AmpC 酶菌株对哌拉西林/ 他唑巴坦 ,头 孢吡肟和亚胺培南等较敏感 ;而同时产 AmpC 酶 + ESBLs 对亚胺培南等较敏感外几乎对其他所有抗菌 药物均耐药。哌拉西林/ 他唑巴坦具有很强的抗菌 作用 ,本组耐药率为 2518 % ,对单产AmpC酶菌株均 敏感 ,可能是由于他唑巴坦对 AmpC酶有灭活作用 , 在与哌拉西林联用时 ,增强了哌拉西林的作用[7 ] 。 头孢菌素中以头孢吡肟抗菌作用最强 ,原因可能是 因为第 4 代头孢菌素对β- 内酰胺酶亲和力较低 , 应用时间较短 ,且能快速地通过细菌的外膜屏障与 PBP结合而发挥较强的抗菌作用 :同时第 4 代头孢 菌素是 AmpC酶的弱诱导剂 ,但对 AmpC 酶稳定 ,所 以对产 AmpC诱导酶的菌株仍表现为敏感[8 ] ,本组 耐药率为 2715 % ;头霉类抗生素对肺炎克雷伯菌的 抗菌活性优于第一、二代头孢菌素和多数三代头孢 菌素 ,本组头孢西丁耐药率为 2813 % ,对单产 ESBLs 酶菌株的耐药率仅为 1210 % ,这可能与其含有对 ESBLs酶相对稳定的 7 -α甲基侧链有关[9 ] 。亚胺 培南仍是所有被测药物中对肺炎克雷伯菌抗菌作 用最强的抗生素 ,本组 120 例患者对亚胺培南均敏 感。可见对产酶肺炎克雷伯菌的临床经验性用药 一般首选碳青霉烯类 ,其次是β- 内酰酶类抗生素 和酶抑制剂、头霉类抗生素及其他敏感抗生素。 总之 ,本院儿科病区下呼吸道标本分离出的肺 炎克雷伯菌对抗生素耐药的主要原因是产生 AmpC 酶和 ESBLs ,对产酶菌株临床经验用药首选碳青霉 烯类抗生素。 ·07· 浙江实用医学 2009 年 2 月第 14 卷第 1 期 Zhejiang Practical Medicine February ,2009 ,Vol . 14 ,No. 1 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 参考文献 [1 ] 　吴伟元 ,陈民钧 ,王辉. 阴沟肠杆菌去阻遏持续高产 AmpC 酶和 超广谱β- 内酰胺酶 ( ESBLs) 的检测. 中国临床药理学杂志 , 2001 ,17 (2) :104 [2 ] 　Bou G,Oliver A ,Ojeda M ,et al . Molecular characterization of FOX - 4 , a new AmpC - type plasmid - mediated beta - lactamase from an Escherichia coli strain isolated in Spain. Anti - microb Agents Chemother , 2000 , 44 (9) :2549 [3 ] 　Essack S Y, Hall L M , Pillay D G, et al . Complexity and diversity of Klebsiella pneumoniae strains with extended - spectrum beta - lacta2 mases isolated in 1994 and 1996 at a teaching hospital in Durban , South Africa. Antimicrob Agents Chemother , 2001 ,45 (1) :88 [4 ] 　Bret L , Claris C C , Sitot D , et al . Chromosomally encoded AmpC - typeβ- Lactamase in aclinical isolate of Proteusmirabilis. Antimicro2 bial Agents Chemother , 2005 , 42 (5) : 1110[5 ] 　沈定霞 ,罗燕萍 ,曹敬荣 ,等. 肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌AmpCβ内酰胺酶的表型检测. 临床检验杂志 ,2007 ,25 (1) :4[ 6 ] 　Nuesch - lnderbinen M T , Kayser F H , Hachler H. 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