肺炎克雷伯菌对喹诺酮类及氨基糖苷类耐药基因检测及耐药机制分析

�论 � 著� 肺炎克雷伯菌对喹诺酮类及氨基糖苷类 耐药基因及耐药机制分析 黄彬1 , 陈茶2 , 汤晓丽3 , 蓝锴2 ( 1. 中山大学附属第一医院检验医学部, 广东 广州 510080; 2. 广东省中医院检验医学部, 广东 广州 510120; 3. 中山市博爱医院检验科, 广东 中山 528403) 摘要: 目的 � 了解临床分离的耐环丙沙星及庆大霉素肺炎克雷伯菌喹诺酮类耐药基因 qnrA、qnrB、qnrS、qepA 与 氨基糖苷类耐药基因 aac( 6 )�! b 的携带情况,并进行相关耐药机制分析。方法 � 采用 VITEK�2 型全自动微生 物检测系统鉴定细菌; 采用 K�B法检测细菌对 16 种常用抗菌药物的敏感性; 采用聚合酶链反应检测耐药基因 qnrS、qnrA、qnrB、qepA 和 aac( 6 )�! b。结果 � 25 株耐环丙沙星和庆大霉素的肺炎克雷伯菌中, 12 株( 48. 0% ) 检出 aac( 6 )�! b基因, 7 株( 28. 0% )检出 qnrS 基因, 4株( 16. 0% )检出 qnrB 基因,未检出 qnrA 和 qepA 基因,其 中 1 株同时检出 qnrS 和 qnrB基因, qnr 基因总的阳性率为 40. 0% ;有 6 株肺炎克雷伯菌同时存在喹诺酮类和氨 基糖苷类耐药基因( 50. 0%)。结论 � 对环丙沙星和庆大霉素耐药的肺炎克雷伯菌携带 aac( 6 )�! b 和 qnrS、qnrB 耐药基因, qnr基因的携带率高达 40. 0% ,肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类药物耐药主要由 aac( 6 )�! b 引起, 单株菌 可同时存在多种耐药基因, 从而介导对多种抗菌药物的耐药性。 关键词: 肺炎克雷伯菌; 喹诺酮类; 氨基糖苷类; 耐药基因 中图分类号: R378. 99+ 6� � 文献标识码: A � � 文章编号: 1005�4529( 2011) 01�0005�03 Detection of antimicrobial�resistant genes of klebsiella pneumoniae resistant to quinolones and aminoglycoside and drug resistant mechanism HUANG Bin* , CHEN Cha, T ANG Xiao�li, LAN Kai (* T he Fir st A f f i liated H osp ital of Sun Yat�sen Universi ty , Guang z hou, G uangdong 510080, China) Abstract: OBJECTIVE T o detect qnrA , qnrB, qnrS and qepA and aminog ly coside modifying enzymes ( AM ES ) gene in clinica l iso lates of K lebsiella p neumoniae r esistant to cinr oflox acin and gentamicin, and study the r esistant mechanism. METHODS T hese isolates w ere identified by the automatic VITEK2 sy stem and their ant imicrobial susceptibility w as tested by K�B method. The drug r esist ant genes w ere analyzed by po lymerase chain r eaction. RESULTS Among K . p neumoniae resistant to cinroflox acin and gentamicin, the po sitiv e rates o f qnrS, qnrB, qnrA, qepA and aac( 6 )�! b gene were 28. 0% , 16. 0% , 0% , 0% , and 48. 0% , respectively . CONCLUSION K . p neumoniae iso lates car ry aac( 6 )�! b, qnrS and qnrB gene, qnrA and qepA gene ar e not found. The car ry ing rate of qnr is 40. 0% , aac( 6 )�! b and qnr may be the main resistant mechanism of K . pneumoniae to aminog ly co side and quino lones. but multi�drug r esistant g enes ex ist in a singal str ain, which can induce the multi�drug r esistance. Key words: K lebsiella pneumoniae; Quinolones; Aminog ly coside; Ant imicrobial�r esistant g ene 收稿日期: 2010�10�15 ; � 修回日期: 2010�11�15 � � 肺炎克雷伯菌( KPN)是临床感染性疾病和医 院感染中常见的、重要的病原菌。全国细菌耐药监 测网和全国医院感染监控网报道,肺炎克雷伯菌的 分离率居第 2或第 3位[ 1]。随着抗菌药物的广泛使 用,肺炎克雷伯菌多药耐药的问已引起临床的广 泛重视,特别是对氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物 耐药的菌株越来越多[ 2�4] 。为了解肺炎克雷伯菌对 氨基糖苷类和喹诺酮类抗菌药物的耐药性和耐药机 制,本研究对临床分离的耐环丙沙星和庆大霉素的 25株肺炎克雷伯菌喹诺酮类耐药基因 qnrS、qnrA、 qnrB、qepA 和氨基糖苷类耐药基因 aac( 6 )�! b进 行检测和比较,并对 16种常用抗菌药物的耐药情况 进行分析,结果报道如下。 1 � 资料与方法 1. 1 � 菌株来源 � 收集广东省中医院 2007年 1- 9 月从住院患者分离的耐环丙沙星和庆大霉素的肺炎 �5�中华医院感染学杂志 2011 年第 21 卷第 1 期 � Chin J Nosocomiol Vo l. 21 No . 1 2011 克雷伯菌 25株,其标本类型分别为痰液 12份,气管 内分泌物 3份,血液 4份,尿液 4份,伤口分泌物 2 份。菌株置于- 80 ∀ 保存。 1. 2 � 仪器与试剂 � 细菌鉴定采用法国生物梅里埃 公司的 VITEK�2全自动微生物鉴定系统, 细菌培 养基购自广东江门凯林公司, PCR试剂由无锡市克 隆遗传技术研究所提供。GeneAmp 9700 PCR 扩 增仪购自美国应用生物系统公司, F luochemTM 8900 凝胶成像系统购自美国 Alpha Innotech 公司。核 酸电泳仪购自北京东方仪器厂, 5415D 台式高速离 心机购自 Eppendo ff 公司。琼脂糖购自 Sigma 公 司, DNA 标志物( DL 2000)购自 T aKaRa 公司, 药 敏纸片购自英国 Oxoid公司。 1. 3 � 抗菌药物敏感性试验 � 采用 K�B 法测定头孢 哌酮/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿米卡星、环丙 沙星、头孢曲松、头孢吡肟、庆大霉素、亚胺培南、左 氧氟沙星、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、头孢他啶、妥布霉 素、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林和呋喃妥 因共 16种常用抗菌药物的敏感性,并根据美国临床 实验室化研究所( CLSI) 2008年版要求进行抗 菌药物敏感性判断 [ 5]。质控菌株肺炎克雷伯菌 ATCC 700603购自卫生部临床检验中心。 1. 4 � 耐药基因的检测 1. 4. 1 � 模板制备与 DNA 纯化分离 � 将- 80 ∀ 保 存的菌株复苏传代后, 挑取纯培养菌落置于内含 100 �l生理盐水的 0. 5 ml离心管内, 15 000 r/ m in 离心 5 min,吸弃上清液。加裂解液 A 50 �l、裂解液 B 2 �l混匀(含 200 ng/ ml蛋白酶 K) ,置入 55 ∀ 保 温 2 h,后置于 95 ∀ 保温 5 min。10 000 r / min离心 30 s,上清液即为扩增的模板液。- 20 ∀ 冰箱保存 备用。 1. 4. 2 � 基因检测 � 采用聚合酶链反应法, 靶基因 PCR扩增反应体系:每反应体系 P1、P2引物各 0. 5 �mol/ L, KCl 10 mmol/ L , ( NH 4 ) 2SO4 8 mmol/ L , MgCl2 2 mmol/ L, T ris�H Cl ( pH9. 0) 10 mmol/ L , NP40 0. 5%, BSA 0. 02% ( w / v ) , T aq 聚合酶 1 U。 总反应体积 20 �l(其中模板液 5 �l)。PCR扩增产 物大于 500 bp的基因热循环参数均为: 93 ∀ 预变 性2 min, 然后 93 ∀ 60 s、55 ∀ 60 s、72 ∀ 60 s, 35个 循环后 72 ∀ 延伸 5 min。PCR 扩增产物< 500 bp 的基因热循环参数均为: 93 ∀ 预变性 2 min, 然后 93 ∀ 30 s、55 ∀ 30 s、72 ∀ 60 s, 35 个循环后 72 ∀ 延伸 5 min。产物经 1%琼脂糖凝胶电泳, 用凝胶成 像系统观察分析并结果, 出现与阳性对照分子 大小相当的目的条带判为阳性。引物序列见 1。 表 1 � 耐药基因 PCR 引物序列 基 � 因 引物序列 ( 5 # 3 ) 产物长度 ( bp) qnrS P1:ATGGAAACCTACGATCAGACATAT 657 P2:T TAGTCAGGACAAACAACAATACCC qnrA P1: CAAGAGGATT T CTCACGCCAG 240 P2: GAACT CT ATGCCAAAGCAGTT GG qnrB P1: ATGCTCTGGCACTCGT TGGCGA 681 P2: C TACCAAT CAGCGCGAT GCCAAG qepA P1: GCCGAACGCCGCTGCCGACAG 501 P1: TGCTGCT GACGCTGGCGCT C aac( 6 )� ! b P1: ATGACT GAGCAT GACCTT GC 519 P2: TT AGGCAT CACT GCGT GTT C 2 � 结 � 果 2. 1 � 抗菌药物敏感性试验结果 � 临床分离的 25株 肺炎克雷伯菌对 16种抗菌药物的药敏结果见表 2。 表 2 � 25 株肺炎克雷伯菌对常用抗菌药物的药敏率( % ) 抗菌 � 药物 � 耐药 株数 耐药率 中敏 株数 中敏率 敏感 株数 敏感率 头孢哌酮/舒巴坦 1 4. 0 8 32. 0 16 64. 0 哌拉西林/他唑巴坦 7 28. 0 2 8. 0 16 64. 0 阿米卡星 7 28. 0 1 4. 0 17 68. 0 环丙沙星 25 100. 0 0 0. 0 0 0. 0 头孢曲松 18 72. 0 0 0. 0 7 28. 0 头孢吡肟 17 68. 0 0 0. 0 8 32. 0 庆大霉素 25 100. 0 0 0. 0 0 0. 0 亚胺培南 0 0. 0 0 0. 0 25 100. 0 左氧氟沙星 24 96. 0 0 0. 0 1 4. 0 磺胺甲噁唑/甲氧苄啶 17 68. 0 0 0. 0 8 32. 0 头孢他啶 17 68. 0 2 8. 0 6 24. 0 妥布霉素 12 48. 0 13 52. 0 0 0. 0 氨苄西林 25 100. 0 0 0. 0 0 0. 0 氨苄西林/舒巴坦 21 84. 0 3 12. 0 1 4. 0 头孢唑林 21 84. 0 0 0. 0 4 16. 0 呋喃妥因 15 60. 0 9 36. 0 1 4. 0 2. 2 � 耐药基因的检测结果 � 对环丙沙星和庆大霉 素耐药的 25株肺炎克雷伯菌检测出 aac ( 6 )�!b、 qnrS 和qnrB 耐药基因, 其中 12株检出 aac( 6 )�!b 基因, 7株检出 qnrS 基因, 4株检出qnrB 基因, 检出 率分别为 48. 0%、28. 0%和 6. 0% ,未检出 qnrA 和 qepA基因。有 1株肺炎克雷伯菌同时检出 qnr S和 qnrB基因,有 6株肺炎克雷伯菌同时检测出喹诺酮 类和氨基糖苷类耐药基因。部分肺炎克雷伯菌 aac ( 6 )�!b 基因扩增结果, 见图 1。 3 � 讨 � 论 � � 喹诺酮类和氨基糖苷类药物一直是临床治疗肠 杆菌感染的一线药物, 在国内用药量居第 2位, 仅次 于��内酰胺类抗菌药物。近年来,肠杆菌科细菌对 �6� 中华医院感染学杂志 2011年第 21 卷第 1 期 � Chin J Nosocom iol Vo l. 21 No. 1 2011 注: M . DNA标志物; 1�10.肺炎克雷伯菌; - .阴性对照; + .阳性对照。 图 1� 肺炎克雷伯菌 aac( 6 )�! b 基因电泳结果 喹诺酮类和氨基糖苷类抗菌药物的耐药率逐年上 升[ 1, 6]。 长期以来认为细菌对喹诺酮类抗菌药物的耐药 机制主要为靶位改变和主动外排,靶位改变主要通 过旋转酶基因突变, 造成该类药物作用位点改变, 导 致临床治疗失败。靶位改变及主动外排均为染色体 介导, 不存在水平传播的可转移基因。qnr 基因 ( qnrA、qnrB、qnrS)的发现为细菌对喹诺酮类耐药 的分子机制研究开辟了一条新途径。已经证实 qnr 基因位于可接合质粒上, 可以在不同菌株和不同菌 种间传播而可能导致大范围的流行 [ 7, 8]。因此, 在 喹诺酮类抗菌药物耐药现状比较严重的中国, 应加 强 qnr基因的检测, 进一步研究 qnr 基因的作用机 制以及传播机制,从而为有效预防和治疗提供科学 的依据和指导。 研究表明, qnr基因表达细菌 DNA 回旋酶保护 蛋白,从而拮抗喹诺酮类药物的攻击。qnr 基因的 存在对靶位的改变、外排泵激活及外膜膜孔通道蛋 白的缺失等染色体突变所致的耐药起补充作 用[ 7, 8]。本试验发现,在 25株肺炎克雷伯菌中有 10 株携带 qnr基因, 占 40. 0%; 其中 7株携带 qnrS 基 因占 28. 0%; 4株携带 qnrB 基因,占 16. 0%; 1株同 时携带 qnrS 和 qnrB 基因, 未检出 qnrA 基因。试 验结果表明, qnr 基因在肺炎克雷伯菌中流行程度 较高。 qepA 基因是喹诺酮类外排泵基因, 存在于质粒 上。外排泵是细菌用以排出其不需要物质的一种膜 蛋白, 普遍存在于敏感菌和耐药菌。当细菌发生变 异后,泵蛋白的阻隔基因不再表达或发生突变,于是 细菌细胞膜大量表达泵蛋白, 将抗菌药物从细菌细 胞内泵出。qepA 基因的存在使外排系统上调,减少 喹诺酮类药物在细菌体内的蓄积,从而导致喹诺酮 类药物耐药 [ 9]。本试验发现,在 25株肺炎克雷伯菌 中未检出 qepA 基因, 提示肺炎克雷伯菌耐喹诺酮 类抗菌药物不是由 qepA 基因介导的。 研究表明, 细菌对氨基糖苷类抗菌药物产生耐 药性的主要作用机制有两种:一是细菌产生一种或 多种钝化酶来修饰进入胞内的活性抗菌药物,使之 失去活性; 二是氨基糖苷类抗菌药物的作用靶位 16s rRNA 基因突变。其中最重要的机制是前者。 根据反应类型,氨基糖苷类修饰酶有 N�乙酰转移酶 ( AA C) , O�转移酶( ANC)和 O�磷酸转移酶( APH )。 这些酶的决定簇即使在没有明显遗传关系的细菌群 间也能传播。一种药物能被一种或多种酶修饰, 而 几种氨基糖苷类药物也能被一种酶所修饰。因此, 不同的氨基糖苷类药物间存在着不完全的交叉耐药 性。此外, 细胞膜的通透性降低、细菌的主动外排、 核糖体结合位点的改变也可影响氨基糖苷类药物的 敏感性[ 10] 。acc( 6 )�!b基因编码一种 acc( 6 )�!b 修饰酶,主要以乙酰辅酶 A 作为乙酰基的供体, 作 用于氨基糖苷类抗菌药物 6�氨基己糖环的 6位,使 其乙酰化,不能发挥作用。本试验发现, 25株肺炎 克雷伯菌中有 12 株检出耐药基因 aac( 6 )�! b, 阳 性率为 48%,结果提示肺炎克雷伯菌对氨基糖苷类 药物耐药主要由 aac( 6 )�!b引起。 参考文献 [ 1 ] � 肖永红, 王进, 赵彩云, 等. 2006- 2007年M ohnarin细菌耐 药监测[ J] . 中华医院感染学杂志, 2008, 18( 8) : 1051�1056. 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