白芍总苷对胶原性关节炎大鼠作用的实验研究

Chin J Clin Pharmacol 871 Vol. 27 No. 11 November 2011(Serial No. 145) 基础研究 Fundamental Study 白芍总苷对胶原性关节炎大鼠作用的实验研究 Experimental study on the effect of total gluscosides of paeony on the typeⅡcolla- gen － inducedarthritis in rats 收稿日期:2010 － 11 － 15 修回日期:2011 － 02 － 23 基金项目:河南省教育厅自然科学研究计划基 金资助项目(2010C310010) 作者简介:李宜川(1960 － ) ，女，副教授，主要 从事生物化学及分子生物学研究 通讯作者:李宜川 Tel:(0370)3263366 E － mail:sqyz6666@ 163. com 李宜川，刘国玲，芦 琨， 胡灵卫，郭 辉 (商丘医学高等专科学校 生物化学教研室，河南 商丘 476000) LI Yi － chuan，LIU Guo － ling， LU Kun，HU Ling － wei， GUO Hui (Department of Biochemistry，Shangqiu Medical College， Shangqiu 476100， Henan Province，China) 摘要:目的 研究白芍总苷(TGP)对大鼠胶原性关节炎(CIA)的作用及其可 能机制。方法 SD 大鼠随机分成 6 组:正常组、模型组、地塞米松(2 mg· kg － 1)组及 3 个剂量(25，50，100 mg·kg － 1)TGP 组;用鸡Ⅱ型胶原建立胶原 型大鼠模型;观察胶原型类风湿性关节炎(CIA)大鼠关节指数(AI)及关节 组织的病理学变化;用 ELISA 法检测大鼠血清白介素 － 1β(IL － 1β)和血管 内皮生长因子(VEGF)的水平。结果 白芍总苷可明显降低关节指数，抑制 关节组织病理学改变;白芍总苷大、中剂量组能明显降低胶原性关节炎大鼠 血清中 IL － 1β 和 VEGF 的含量，与模型对照组比较，差异具有统计学意义 (P ＜ 0. 01)。结论 白芍总苷对大鼠胶原性关节炎有明显抑制作用，其机 制可能是与降低血清白介素 － 1β 和血管内皮生长因子的水平、诱导炎性细 胞因子网络趋于平衡有关。 关键词:白芍总苷;类风湿性关节炎;炎症因子 中图分类号:R285. 1;R285. 5 文献标识码:A 文章编号:1001 － 6821(2011)11 － 0871 － 03 Abstract:Objective To research the total gluscosides of paeony (TGP)in the treatment of collagen － induced arthritis in rats and its pos- sible mechanism. Methods SD rats were randomly divided into 6 groups:normal group，model group and dexamethasone (2 mg·kg －1) group，three dose TGP (25，50，100 mg·kg －1)groups． Type Ⅱcolla- gen － induced arthritis (CIA)model in SD rats was established. To ob- serving the joint indexand the pathological changes of the CIA rats． The contents of interleukin － 1β(IL － 1β) ，vascular endothelial growth factor (VEGF)in CIA rats serum were measured with ELISA. Results TGP could inhibit the CIA rat joint index (P ＜ 0. 01) ，significantly reduced pathological changes． Total glucosides of paeonia can decrease the level of IL － 1β，VEGF in CIA rats srums． The difference was significant com- pared with model group (P ＜ 0. 01). Conclusion TGP has an obvious inhibition on CIA rats and it's mechanism maybe related to decreasing the contents of IL － 1β，VEGF and to inducing the balance of the inflamma- tory cytokine network，and thus play a therapeutic role on CIA. Key words:total gluscosides of paeony;rheumatoid arthritis;inflam- matory 白芍总苷是从白芍中提取的有效单体成分，主要为糖苷类物质， 可经多途径抑制自身免疫反应，有抗炎、止痛和保护肝脏的作用，对 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)具有确切的疗效。本实验在 872 中 国 临 床 药 理 学 杂 志 第 27 卷 第 11 期 2011 年 11 月(总第 145 期) 成功地建立大鼠胶原性关节炎模型的基础上，观察白 芍总苷对大鼠胶原性关节炎大鼠的治疗作用，并探索 其可能机制，为临床上用于治疗类风湿性关节炎提供 实验依据。 材料与方法 1 材料 药物与试剂 白芍总苷，购于安徽医科大学临床 药理研究所;地塞米松盐酸注射液，规格:5 mg /mL，批 号:DAC080404，河南确山龙渊药业有限公司生产。 弗完全佐剂、鸡Ⅱ型胶原，均上海本草生物医学工程 所提供;多聚赖氨酸，Sigma 公司生产;白介素 － 1β 和 血管内皮生长因子试剂盒，RD 公司生产;冰醋酸，广 州化学试剂二厂生产;氯化钠注射液，石家庄四药股 份有限公司生产。 仪器 450 酶标免疫测定仪，Bio － Rad 公司产 品;Rm －2135 石蜡切片机，德国 Lecia公司产品;80 － 2 离心机，上海手术器械厂产品;XSB － 1A 双目倒置 显微镜，上海仪器二厂产品。 动物 Sprague － Dawley (SD) 大鼠 60 只，雌雄 各半，体质量(180 ± 20)g 左右，本校动物中心提供 (合格证号:2010A01)。 2 实验方法 2. 1 分组 实验用大鼠 60 只，雌雄各半，按统计学方法随机 分为 6 组:正常组对照组，模型对照组，地塞米松组(2 mg·kg －1) ，白芍总苷小、中、大 3 个剂量组(25，50， 100 mg·kg －1) ，每组 10 只。 2. 2 胶原性关节炎大鼠模型的制作及给药方法 将鸡Ⅱ型胶原 15 mg 制成稳定的乳化剂 15 mL， 置 4 ℃冰箱保存备用。 SD大鼠，除正常对照组外;在鼠的左后肢足跖皮 内，以每只剂量注射胶原乳剂 0. 1 mL 致炎。第 7 天， 在大鼠尾、背多点皮内注射该胶原乳剂 0. 1 mL，作为 激发注射。正常对照组，注射等剂量生理盐水，作为 致炎物质。 于造模后第 7 ～ 30 天，各用药组灌胃给药，qd;正 常对照组和模型组，用等容积生理盐水灌胃。 2. 3 关节炎指数测量 从致炎后第 7 天起，各组每隔 4 d，用关节评分法 (0 ～ 4 级) ，得出关节炎指数。 评分:0 分，无红肿;1 分，趾关节红肿;2 分， 趾关节和足趾肿胀;3 分，踝关节以下的足爪肿胀;4 分，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。每肢 AI 最高 分数为 4 分;四肢 AI 之和，代每只大鼠的 AI，最高 值为 16 分。 2. 4 病理观察 实验第 34 天，麻醉后，处死大鼠。取下左足踝关 节及膝关节滑膜组织，甲醛固定，甲酸脱钙，乙醇脱 水，石蜡包埋切片，HE染色，光镜下，观察滑膜及关节 组织病理学变化。 2. 5 血清细胞因子测定 实验第 34 天，向胶原性关节炎大鼠腹腔内，注射 3%巴比妥那 0. 3 ～ 0. 4 mL，使之麻醉。剪开大鼠腹 腔，用 10 mL注射器心脏取血，室温静置 1 h，3000 r· min －1离心 15 min，吸取上层血清。 用 ELISA法(按试剂盒书进行操作) ，测定胶 原性关节炎大鼠血清中白介素 － 1β 和血管内皮生长 因子含量。 结 果 1 白芍总苷对胶原性关节炎大鼠多发性关节炎指数 的影响 致炎后第 l4天开始，大鼠关节肿胀，多发性关节炎 指数升高，模型组与正常对照组相比，关节指数有非常 显著性差异(P ＜ 0. 01) ;白芍总苷大、中剂量组及地塞 米松组较模型组，关节指数有非常显著性差异(P ＜ 0. 01) ;而白芍总苷小剂量组与模型组相比，关节指数有 显著性差异(P ＜0. 05) ，见表 1。 2 病理观察 正常组:滑膜由 1 ～ 2 层滑膜细胞及滑膜下层组 成，滑膜细胞扁平状整齐排列，无炎细胞浸润。模型 组:可见皮下组织细胞排列杂乱，血管增生严重，关节 软骨面毛糙凹凸不平、缺陷，大量炎性细胞浸润。地 塞米松组和白芍总苷大、中剂量组，关节局部病变，见 到不同程度的轻、中度慢性炎症，软骨面光滑;但未见 明显软骨破坏及骨浸润，滑膜细胞仅轻度增生，且排 列整齐。 3 白芍总苷对 CIA 大鼠血清中白介素 － 1β和血管 内皮生长因子含量的影响 模型对照组中，白介素 － 1β 和血管内皮生长因 子的浓度，均较正常对照组大幅度上升(P ＜ 0. 01) ;白 芍总苷大、中剂量组和地塞米松均能明显降低胶原性 关节炎大鼠血清中白介素 － 1β 和血管内皮生长因子 的含量，与模型对照组比较，差异具有显著性意义 (P ＜ 0. 01) ，见表 2。 Chin J Clin Pharmacol 873 Vol. 27 No. 11 November 2011(Serial No. 145) 表 1 白芍总苷(TGP)对胶原性关节炎(CIA)大鼠关节炎指数的影响 Table 1 The effect of total gluscoside of paeony(TGP)on the arthrits index of the type Ⅱcollagen － induced arthritis in rats Group Dose (mg·kg －1) Arthritis index at the time after administration TGP(day) 7 14 18 22 26 30 34 Norml 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 Model 0． 1 ± 0． 2 3． 6 ± 0． 8★ 6． 6 ± 0． 7★ 7． 8 ± 0． 5★ 6． 4 ± 0． 7★ 4． 6 ± 0． 6★ 4． 1 ± 0． 3★ Dexamet － hasone 2 0． 1 ± 0． 2 3． 7 ± 08 4． 9 ± 0． 8△ 5． 2 ± 0． 7△ 4． 6 ± 0． 8△ 3． 2 ± 0． 6△ 3． 1 ± 0． 5△ TGP － low 25 0． 1 ± 0． 3 3． 5 ± 1． 5 6． 3 ± 0． 6 7． 1 ± 0． 8 5． 7 ± 0． 9# 4． 2 ± 0． 5# 3． 4 ± 0． 6# TGP － middle 50 0． 1 ± 0． 3 3． 8 ± 0． 9 5． 7 ± 0． 8# 5． 5 ± 0． 8△ 4． 8 ± 0． 8△ 3． 5 ± 0． 5△ 2． 9 ± 0． 8△ TGP － high 100 0． 1 ± 0． 2 3． 8 ± 0． 7 4． 6 ± 6． 5△ 4． 9 ± 0． 7△ 4． 4 ± 0． 8△ 3． 4 ± 0． 7△ 2． 8 ± 0． 7△ n = 10，mean ± SD;Compared with the norml group，★P ＜ 0. 01;Compared with the model group，#P ＜ 0. 05，△P ＜ 0. 01 表 2 白芍总苷(TGP)对胶原性关节炎大鼠血清白介素 － 1β(IL － 1β)和血管内皮生长因子(VEGF)水平的影响 Table 2 The effect of TGP on the level of serum interleukin － 1β(IL － 1β)and vascular endothelial growth factor(VEGF)in the type Ⅱ collagen － induced arthritis in rats Group Dose (mg·kg －1) IL － 1β(ng·mL －1) VEGF(ng·mL －1) Control 0. 30 ± 0. 09 0. 15 ± 0. 03 Model 0. 70 ± 0. 07﹡ 0. 48 ± 0. 06﹡ Dexamethasone 2 0. 32 ± 0. 04﹡△ 0. 18 ± 0. 04﹡△ TGP － high 100 0. 33 ± 0. 05﹡△ 0. 21 ± 0. 02﹡△ TGP － middle 50 0. 44 ± 0. 03﹡△ 0. 27 ± 0. 03﹡△ TGP － low 25 0. 69 ± 0. 04 0. 45 ± 0. 06 n = 10，mean ± SD;Compared with the norml group，﹡P ＜ 0. 01;Compared with the model group，△P ＜ 0. 05 讨 论 类风湿关节炎(RA)以关节滑膜炎为主要特征， 表现在多种炎性因子的刺激下，关节滑膜细胞类肿瘤 样无限增生，对关节软骨、骨造成进行性破坏，最终导 致关节畸形和功能障碍。由于类风湿性关节炎发病 机制还不完全明确，对其预防就显得十分困难。以 往，常用非甾体抗炎药、糖皮质激素及免疫抑制剂等; 但其疗效和药物的毒副作用等方面均不理想。 本实验用鸡二型胶原诱导胶原性关节炎大鼠模 型，原发病变主要表现为致炎足爪肿胀，继发性病变 一般于致炎后 7 天左右出现，表现为非炎性足爪肿 胀、耳和尾部出现“关节小节”及体质量下降;第 22 ～ 27 天病变达高峰。本实验结果表明，白芍总苷可明显 抑制胶原性关节炎大鼠的足爪肿胀和多发性关节炎 程度，改善关节滑膜炎症、骨质破坏、软骨侵蚀、炎症 细胞浸润等，表明白芍总苷对大鼠具有明显的治疗作 用。这与文献报道相符「1」。 白介素 － 1β 是炎症的始动因素，可以调节多 种细胞因子、细胞黏附分子、免疫调节分子及前炎 症介质的表达，在类风湿性关节炎的骨侵蚀及软骨 破坏中发挥重要作用［2］。白介素 － 1β 还可以作用 于内皮细胞，促进嗜中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴 细胞聚集，加重关节局部炎症反应［3］。血管内皮生 长因子是参与调控血管发生和血管新生的关键分 子，几乎参与了类风湿新关节炎的发病全过程。本 实验结果证实，胶原性关节炎大鼠血液白介素 － 1β 和 VEGF 水平升高，白芍总苷治疗后，血液白介 素 － 1β 和血管内皮生长因子含量均明显下降，提 示白芍总苷可能通过直接或间接作用降低白介素 － 1β 和血管内皮生长因子的产生，从而对胶原性 关节炎大鼠发挥治疗作用。 参考文献: ［1］ 朱蕾，魏伟 . 白芍总苷对大鼠胶原性关节炎及其免疫功能的影 响［J］. 中国药学杂志，2007;20:1547 － 1551. ［2］ Vuolteenaho K，Moilanen T，Hamalainen M，et al. Regulation of nitric oxide pro － duction in osteoarthritic and rheumatoid cartilage. Role of endogenous IL － 1 inhi － bitors［J］. Scand Rheumatol ，2003;32: 19 － 24. ［3］ Ertenli I，Kiraz S，Calguneri M，et al. Synovial fluid cytokine levels in Behcet's disease［J］. Clin Exp Rheumatol，2001;19:37 － 41.