猫动眼神经缺损修复的实验研究

海南医学 叽 " 151 Journ~l o a ntln Medical University f H i DOI：CNKI：46—1049／R．20l10309．1l51．025 网络 出版地址 ：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／46 1049／R．20110309．1151．025．html 猫动眼神经缺损修复的实验研究 陈伟明，曹作为，金 虎，史克珊，李 钢 (中南大学湘雅医学院附属海 口医院 神经外科 ，海南 海 口 570208) [摘要]目的：探讨 Pi GA神经导管内移植 雪旺氏细胞(SCs)对猫颅 内段动眼神 经再生的影响。方法： 将 22只家猫随机分为 3组 ，导管组 10只，SCs组 10只，对照组 2只。右侧动眼神经制作 4 mm缺损后 ， 分别用 PI GA导管、PI GA导管+SCs悬液修复 ，对照组不修复。14周时处死动物，取远 端再生神 经， 用光镜、电镜观察及轴突图像分析评估修复效果 。结果：术后 14周 时，导管组有 7只猫，SCs组有 8只 猫右侧神经功能基本恢复，神经连续性恢复 ；对照组无恢复 。导管组及 SCs组再生神 经有髓纤维的数 目分别为(8 76O±597)、(10 255±1 271)，导管组及 SCs组再生神经平均轴突直径为(4．16-4-0．30)um 、 (4．59±0．34)um；两组间纤维数 目、轴突直径差异有统计 学意义(P<0．05)。结论 ：PI GA导管内移植 同种异体雪旺氏细胞悬液能促进猫颅 内段动眼神经再生。 [关键词]动眼神经；神经缺损 ；神经再生，雪旺氏细胞 [中图分类号]R322．85 [文献标识码]A [文章编号]1007 1237(2011)O2一O151一O4 An experimental study of repairing the oculomotor nerve defects in cats CHEN W ei—ming，CA()Zuo—wei，JING Hu ，SHI Ke shan，I I Gang (Department of』＼，g“r0 “rgPr ，Haikou Hospital Affiliated to Xiangya School o,t’Medic’ine，Cen— tra Z South universitY，Ha kou 57O208，P．R．China) [Foundation Project~：Natural Science Foundation oJ Hainan Province( ^2OO6 3O643)，Haikou Key Research ect 20O6 [Author]：cHEN we —m ing(1972 )，Mn P，Yixing Jiangsu，the Deputy Chief Physi c’ian，P^ ．D．， 丁eZ：1311 1902699，EITIail：doc f叫 @ 163．COD7． Received：2010—12 29 Revised：2011—02一O5 -／HM C，2O11；17(2)：1 5卜 1 54 View from specialist：It is creative，and of certain scientific and edueational value． ~ABSTRACT]Objective：To evaluate the effects of nerve regeneration when the oculomotor nerve de— fects were repaired with PI GA conduit and Schwann cells(SCs)in cat models．Methods：A total of 22 cats were randomly divvied into conduit group( 一 10)，SCs group ( ===10)，and control group (n一 2) ． The cistern segment of the right oculomotor nerve was transected to make a 4 mm nerve defect in each cat ． Then，nerve defects in the conduit group were repaired with PI GA nerve conduits，in SCs grouP with PI 一 GA conduit and SCs soIution，while no repairing were conducted for the control group ． Cats were sacri— riced 14 weeks after the surgery，never regenerating status were observed and evaluated by microsc0De and electron microscope．Results：14 weeks after surgery，there were 7 cats in the conduit group and 8 cats in the SCs group showed recovery of oculomotor nerve function and anatomical continuitv，while no imDr0ve — ment were found in the control groups．Number of mean nerve fiber of the distal stump were(8 760± 597) [收稿日期]2010 12 29 [修回日期]2011 02 05 网络出版时间：2011-03 09 11：51：14 [基金项目]海南省自然科学基金资助项 目：2006—30643；海口市重点科技计划项目：[2oo6]~4R 0028 [作者简介]陈伟明(1 972一)，男，江苏宜兴市人，副主任医师，N-~lg~，电话：13111 902699，电子信箱： 152 海南 医学 院学报 Vo1．17 N。．2 Feb．2011 in conduit group，and (10 255± 1 271) in SCs group，respectively；mean axonal diameter of the dista1 stump were(4．16±0．30) m in conduit group，and (4．59± 0．34) m in SCs group，both showing signif— icant difference between the two groups(P both< 0． 05)．Conclusions：Local implantation of SCs solution in PI GA conduit can promote the oculomotor nerve regeneration in cats ． [KEY WORDS]Oculomotor nerve；Nerve defect；Nerve regeneration 动眼神经损伤是颅底外科常见的手术并发症之 一 ，但相关的临床及 实验修复报道较少。前期研究 中本文作者用神经导管成功修复猫颅 内段动眼神经 缺损，但单独使用 PI GA神经导管再生效果仍不如 自体神经移植l_1]。为提高修复效果 ，本文探讨导管 法内移植 同种异 体 雪 旺 氏细 胞 (Schwann Cells， SCs)对动眼神经缺损的修复效果 的影响，为导管法 的临床应用及深入研究提供依据 。 1 材料与方法 1．1 导管材料及制备 聚乳酸一羟基乙酸共聚物导管(poly D，L-lactic— CO—glycolic acid，PLGA)75：25，内径 1．2 mm，外 径 1．4 mm，长度 5．5 mm，由中山大学高分子所提 供 。碘氟浸泡消毒。明胶海绵修成长 4 mm、直径 略大于导管内径的圆柱形 ，放人导管中央，两端预 留 对称空问，备用 。 1．2 SCs悬液的制备 乳猫一只，取坐骨神经粉碎 ，胶原酶消化后收集 细胞 ，20 胎牛血 清 的 DMEM 培养 ，Arc—a及 G一 418去 除成纤维细胞 ，形成 SCs悬浮细胞 ，镜 下计 数 ，低温冰箱保存备用。 1．3 实验动物及分组 健康家猫 22只，雌雄不限，体重 2．6～3．5 kg。 随机分为 3组 ，导管组 10只，SCs组 10只，对照组 2 只。选右侧动眼神经为实验对象 。 1．4 动物模型制作 参考黄军等 的方法并加以改进：动物用氯胺酮 (25 mg／kg)及安定(2．5 mg／kg)肌肉注射复合麻醉。 常规备皮、消毒 ，铺 巾，右耳前 0．5 cm 处做直切 口，长 5 cm，上至顶部，下至颞颌关节，暴露颅骨。颅骨钻孔 一 个扩大成 1．5 cm×2．0 cm 的骨窗，下方平中颅窝 底 ，后方平天幕，剪开硬脑膜 ，镜下将猫的颞叶缓慢上 抬 ，显露并锐性解剖脑池段全程及部分海绵窦段动眼 神经共约 8 mm左右，锐性切除 4 mm。 1．5 神经缺损修复 (1)导管组：取 PLGA导管 1根，导管内注入 2 I 生理盐水，待液体吸收后，保持术野干燥下将神经两断 端分别置人导管的两端，再用纤维蛋白胶可靠封闭导 管与神经之间的空隙；(2)SCs组 ：将导管内注入的液体 改为 1 I 生理盐水及 1 I SCs悬液，余同导管组；(3) 对照组 ：不修复。 神经修复后，庆大霉素生理盐水冲洗颅腔，分层 缝合硬脑膜 ，颞肌 ，皮下及皮肤。术后分笼饲养 ，每 周观察瞳孔对光反射，眼球活动情况。 1．6 标本取材及检测 术后 14周 ，处死所有动物 ，4 多聚 甲醛灌注 后 ，解剖后整块取 出大脑及所有脑神经 。导管组及 SCs组各随机取一只神经再生成 功的猫 ，取远端及 对侧动眼神经行透射 电镜检查，并保 留半薄切片作 光镜检查。剩余标本远端再生神经及对侧神经，甲 苯胺蓝染色后光镜检查 ；HAIPS—1000图像分析系 统测量远端及对侧神经纤维的数 目和直径。 1．7 统计学处理 采用 SPSS 13．0软件处理，数据采用均数±标 准差( ± )表示 ，行 t检验 ，检验水准 a一0．05。 2 结果 2．1 行为学观察结果 所有动物术后即时出现右侧瞳孔完全散大，直、间 接对光反射消失，眼球外展位固定，上睑不 同程度下 垂。术后 6周时，部分猫修复侧能观察到微弱对光反 射及轻微眼内收运动。所有猫均健康成活至 14周，此 时导管组有 7只、SCs组有 8只猫瞳孔缩小、眼球运动 基本恢复，对照组无恢复。其中导管组、SCs组各有 5 只猫瞳孔对光反射较好。眼球运动：导管组有 4只恢 复较好，SCs组有 5只恢复较好。 2．2 大体标本观察 术后 14周 ，神经功能有恢复的猫实验侧动眼神经 的连续性均恢复，神经缺损的断端已无法辨认 ，再生神 经的形态及色泽均与正常神经类似。PLGA导管已变 得菲薄 ，部分导管已吸收。行为学恢复不佳者可见远 端神经略变小，行为学观察无恢复者及对照组术侧近 端神经瘤形成，远端已无法辨认(图 1—3)。 2．3 光镜观察 远端再生神经横切面上均可见较多的再生神经 纤维 ，髓鞘较正常薄，外观近似 圆型或欠规则，分布 欠均匀。与正常神经纤维 比较再生纤维较细小，数 目较少，成束现象不明显，其中 SCs组再生神经直 径稍大(图 4—6)。 2．4 超微结构观察 远端再生的神经可见有髓再生纤维，板层不完 陈伟 明等．猫 动眼神经 缺损修 复的实验研究 153 全清楚且染色稍浅 ，神经纤维则较 细、形状不规则 ， 稀密程度不一致 。SCs组远端再生神经髓鞘较导管 图 1 导管组大体标 本 图 4 正常动眼神经 甲苯 胺蓝染色 (×800) 组稍厚，染色较深 ，板层结构较接 近正常 ，神经成熟 度较高。(图 7 9)。 图 2 SCs组大体标本 图 5 导管组动眼神经横切面 甲苯胺蓝染色 (×800) 图 3 对 照组大体标本 图 6 SCs组动眼神经横切面 甲苯胺蓝染色(X 800) 图 7 正常动眼神经电镜 (×8000) 图 8 导管组电镜 (X 8000) 图 9 SCs组 电镜 (X 8000) 2．5 轴突图像分析 猫正常动 眼神经有髓纤 维 的数 目为 (9 675± 574)，平均轴突直径为(6．77±0．48)um。导管组及 SCs组再生神 经有髓纤 维 的数 目分 别为 (8 760± 597)、(10 255±1 271)两组间差异有(t一4．17，P< 0．05)。导管组及 SCs组再生神经平均轴突直径为 (4．16±0．30)um 、(4．59±0．34)um，两组 间 差 异 有统计学意义( 一2．59，P<0．05)。 3 讨论 巨大颅底肿瘤的切除仍是神经外科面临的挑战 之一 ，当肿瘤包裹颅神经时，神经外科医生面临着在 全切肿瘤、切除颅神经和部分切除肿瘤、保留颅神经 之间进行选择 ，如能简单且有效修复神经缺损 ，颅底 巨大肿瘤的切除将变得~Hx,J-简单 。颅神经缺损是颅 底外科常见的手术并发症 ，但相关的临床及实验报 道极少，可能是由于神经位置深在 ，且周围重要结构 阻挡 ，造成操 作空问狭小 ，修复难度大所致 。基于 “接触再牛理论”的修复方法是 自体神经移植，是 目 前修复神经缺损 的金 。回顾文献 J，用于颅 内移植的神经有腓肠 、耳大、眶上 、前臂 内侧皮神经 等 ，修复的 目标神经为外展、滑车、动眼、面神经等 ， 结果表明，成分单一的外展、滑车神经 ，恢复较好 ，而 成分复杂的动眼、面神经效果较差 ，可能与迷行再生 有关 。自体神经移植有供区神经功能丧失 、手术操 作复杂、移植物的长度和直径受限制等缺点，其临床 应用受到较大限制。 随着“神经趋化”理论的发现及诱导冉生研究的 发展 ，基于该理论 的修复方法 神经导管技术 已取得 突破，修复 3 CIll以内神经缺损效果接近 ，甚 至优于 自体神经移植 ，导管法有无创 、易获得 、长度和直 径不受限制的优点，IJ‘可通过十预再生室 的内环境 促进冉生。目前认 为，人工合成可吸收导管具有较 154 海南医学 院学报 Vo1．17 N0．2 Feb．2011 好临床 应 用 前 景，部 分 此 类 导 管 如 ：PGA 已获 FDA／CE批准用于临床 ，已有用于临床成功修复脊 神经缺损的报道 ’ 。 与脊神经缺损修复相比，导管法在颅内应用修 复神经缺损尚处于探索阶段 ，可能是颅内操作空间 狭小、再生室浸泡在脑脊液中等不利因素限制了导 管法在颅内应用 。自 1 992年 Sandvos等用硅胶管 修复大 鼠动眼神经获得成功后 ，应用神经导管技术 在颅内修复神经缺损的相关研究极少 ，但颅神经再 生与脊神经再生的基本过程是相似的，通过对导管 进行改进，以上不利 因素可 以被克服。前期研究中 本文作者用 PI GA导管 ，明胶海绵、纤维蛋 白胶成 功修复颅内段动眼神经缺损 ，该方法解决 了构建密 闭再生室、局部干预促进神经再 生这两个 问题 ， 但单独使用 PI GA 导管修复效果仍不如 自体神经 移植 。 导管法的最大优点是可通过优化再生室的微环 境来提高修复效果 。再生室是指神经导管及其修复 的两个神经残端形成 的间隙，其功能是提供和维持 轴突生长所需的微环境，有利于选择性再生减少迷 行再生促进功能恢复。SCs是周围神经再生的要素 之一，脊神经研究中发现局部移植 SCs能促进轴突 再生[1 ，但在颅 内尚未见 报道。为提 高再生效果 ， 我们在 PI GA导管 内应用同种异体 SCs并观察其 对猫动眼神经再生的影响 ，从方法学探讨 SCs在颅 内应用的可行性。 术后 14周时两组猫动眼神经功能均有一定程 度恢复 ，神经连续性恢复 ，光镜 、电镜显示修复侧远 端有再生轴突，而对照组无恢复，证实这 2种方法均 能有效修复猫颅内段动眼神经缺损 。光镜 、电镜 、轴 突图像分析结果表 明，SCs组较导管组 神经成熟度 较高，再生效果较好。我们首次证实在 PI GA导管 法内移植同种异体雪旺氏细胞悬液能促进猫颅 内段 动眼神经再生 ，同时也证实本研究采用的 PI GA导 管可有效解决局部干预促进神经再生的问题 。 SCs促进轴突再生 的机制 目前仍未 十分明 了， 一 般认为 SCs可通过 3种途径促进神经再生 “： (1)促进基底膜产生细胞外基质 ，如：纤维连接蛋白、 层黏蛋 白、胶原蛋 白等，能促进轴突再生和髓鞘化 ； (2)增加细胞表面黏附分子的合成 ，引导再生轴突支 配靶器官再生 ；(3)SCs能产生神经营养因子及其受 体促进轴突再生。 雪旺氏细胞、基质成分及神经营养因子是周围 神经再生的 3大要素，理想的神经导管应将这 3个 因素有机地结合 。进一步研究适合颅 内使 用的 导管、联合应用神经营养因子及雪旺氏细胞等方法， 提高修复效果 ，导管法有望代替 自体神经移植用于 临床修复颅神经缺损 。 参考文献 l 陈伟明。曹作为，金虎，等．猫动眼神经缺损修复的实验 研究[J]．中国现代医学杂志，2010，20(3)：377—380． 2 黄军，袁贤瑞，姜维喜，等．神经桥接与导管套接修复猫 动眼神经形态学观察[J]．中华神经外科疾病研究杂志， 2005，5(2)：156—159． 3 Bacciu A，Falcioni M ，Pasanisi E，et a1．Intracranial fa— cial nerve grafting after removal of vestibular schwanno— maEJ]．Am J Otolaryngol，2009，30(2)：83—88． 4 Van Overbeeke JJ，Cruysberg JR，Menovsky T． In— tracranial repair of a divided trochlear nerve．Case re— port[J]．J Neurosurg，1998，88(2)：336—369． 5 Shono T，Mizoguchi M ，Yoshimoto K，et a1．Clinical course of abducens nerve palsy associated with skull base tumours[J]．Acta Neurochir(Wien)，2009，151 (7)：733—738． 6 Krajewski R．Oculomotor nerve repair using interposed nerve graft[case report][J]．Neurosurgery，1992，30 (4)：591—594． 7 I i S，Pan Q，Liu N。et a1．Neurotization of oculomotor， trochlear andabdueent nerves 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