诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究
上海交通大学学报(医学版)
Journal of Shanghai Jiaotong University (Medical Science) Vol. 32 No. 5 May 2012
[作者简介]魏 嘉(1986—) ,女,住院医师,硕士生;电子信箱:ghost2r@ 163. com。
[通信作者]赵爱民,电子信箱:zam0526@ yahoo. com. cn。
[文章编号] 1674-8115(2012)05-0642-04 ·论 著·
诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的
相关性研究
魏 嘉, 赵爱...
上海交通大学学报(医学版)
Journal of Shanghai Jiaotong University (Medical Science) Vol. 32 No. 5 May 2012
[作者简介]魏 嘉(1986—) ,女,住院医师,硕士生;电子信箱:ghost2r@ 163. com。
[通信作者]赵爱民,电子信箱:zam0526@ yahoo. com. cn。
[文章编号] 1674-8115(2012)05-0642-04 ·论 著·
诱导性共刺激分子
达与原因不明复发性流产的
相关性研究
魏 嘉, 赵爱民
(上海交通大学 医学院附属仁济医院妇产科,上海 200127)
[摘要] 目的 探讨诱导性共刺激分子(ICOS)的表达与原因不明复发性流产(URSA)的关系。方法 采集 10 例诊断为难免流产
的 URSA患者(URSA组)和 10 例正常早孕妇女(正常对照组)的部分蜕膜组织和外周血,采用流式细胞术检测蜕膜组织和外周
血 CD3 +和 CD4 + T细胞中 ICOS的表达;Real-Time PCR检测蜕膜组织中 ICOS mRNA 的表达情况。结果 URSA 组蜕膜组织中
ICOS + CD3 + T淋巴细胞亚群所占百分比为(0. 612 ± 0. 693)%,显著高于正常对照组的(0. 056 ± 0. 103)%,差异有统计学意义
(P < 0. 001)。URSA组外周血 ICOS + CD4 + T淋巴细胞亚群所占百分比为(1. 943 ± 0. 762)%,显著高于正常对照组的(0. 221 ±
0. 127)%,差异有统计学意义(P < 0. 001)。URSA组蜕膜组织中 ICOS mRNA 的相对表达量较正常对照组显著升高[(9. 875 ±
1. 464)vs (2. 701 ±1. 737) ],差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 蜕膜组织中 ICOS的表达异常与 URSA的发病具有密切关系。
[关键词]诱导性共刺激分子;原因不明复发性流产;蜕膜;外周血
[DOI] 10. 3969 / j. issn. 1674-8115. 2012. 05. 024 [中图分类号] R714. 21 [文献标志码] A
Research on relationship between expression of inducible co-stimulator and
unexplained recurrent spontaneous abortion
WEI Jia, ZHAO Ai-min
( Department of Obstetrics and Gynecology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai
200127, China)
[Abstract ] Objective To investigate the relationship between expression of inducible co-stimulator ( ICOS ) and
unexplained recurrent spontaneous abortion ( URSA) . Methods The decidual tissues and peripheral blood samples were
taken from 10 patients with URSA diagnosed as inevitable abortion ( URSA group ) and 10 women with normal early
pregnancy ( normal control group) , the expression of ICOS CD3 + T cells and ICOS CD4 + T cells in decidual tissues and
peripheral blood was detected by flow cytometry, and the expression of ICOS mRNA in decidual tissues was determined by
Real-Time PCR. Results The proportion of ICOS + CD3 + T lymphocyte subsets in decidual tissues of URSA group was
significantly higher than that of control group [( 0. 612 ± 0. 693) % vs ( 0. 056 ± 0. 103) % , P < 0. 001]. The proportion of
ICOS + CD4 + T lymphocyte subsets in peripheral blood of URSA group was significantly higher than that of control group
[( 1. 943 ± 0. 762) % vs ( 0. 221 ± 0. 127) % , P < 0. 001]. The relative expression of ICOS mRNA in decidual tissues of
URSA group was significantly higher than that of control group [( 9. 875 ± 1. 464 ) vs ( 2. 701 ± 1. 737 ) ,P < 0. 05].
Conclusion Abnormal expression of ICOS in decidual tissues is closely related to the development of URSA.
[Key words] inducible co-stimulator; unexplained recurrent spontaneous abortion; decidua; peripheral blood
临床上连续发生 3 次或 3 次以上的自然流产者
称为复发性流产(recurrent spontaneous abortion,
RSA) ,发病率占妊娠人群的 1% ~ 2%。除了经典的
染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌异常以及感染
等因素外,临床上 40% ~ 50%的患者流产原因不明,
称为原因不明复发性流产(unexplained recurrent
spontaneous abortion,URSA)。20 世纪 80 年代以来,
生殖免疫学的观点认为正常妊娠之所以能够维持,
·246·
No. 5 魏 嘉,等:诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究
取决于母胎间的免疫平衡即妊娠免疫耐受,而 URSA
的发生可能是妊娠免疫耐受被破坏的结果;但有关妊
娠免疫耐受的形成及导致反复流产的机制尚未阐明。
T细胞的完全活化不仅需要主要组织相容性抗
原复合物(major histocompatibility complex,MHC)分
子递呈的抗原特异性信号,还需要协同共刺激分子
提供的共刺激信号参与。其中,共刺激信号分子
B7 /CD28超家族在多种免疫调节中发挥重要作用。
诱导性共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)是
新近发现的 CD28 家族新成员,与 CD28、CTLA-4 具
有约 39%的同源性。初期研究发现,ICOS 优势性表
达于活化的 T 淋巴细胞[1],可以促进活化 T 细胞的
增殖和分化,调节 Th1 /Th2 的极化,促进 T细胞依赖
的抗体产生[2]。目前,有关 ICOS 的研究主要集中在
动物实验和体外实验,尚未见其与 URSA 的关联研
究。本研究通过观察 ICOS 在 URSA 患者子宫蜕膜
中的表达情况,探讨 ICOS 在维持妊娠免疫耐受及导
致流产中的作用。
1 对象与方法
1. 1 研究对象
1. 1. 1 URSA 组 2010 年 11 月—2011 年 11 月在
上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科就诊并诊
断为难免流产的 URSA患者 10 例。患者既往无活胎
史,均经严格病因筛查排除染色体(包括夫妻双方外
周血染色体及本次妊娠物染色体)异常、生殖道解剖
异常、内分泌异常以及感染因素;所有患者自身抗体
阴性,凝血功能正常。
1. 1. 2 正常对照组 选择该院同期
行人工流
产的正常健康早孕妇女 10 例作为对照。对照组妇女
既往均有活产史,无自然流产、死胎或死产史;排除染
色体异常、内分泌紊乱、生殖道感染以及自身免疫性疾
病;孕期无腹痛及阴道出血;B超提示胚胎发育正常。
1. 2 标本采集
经本人同意后,采集研究对象的部分蜕膜组织
及外周血。以磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡蜕膜;EDTA
抗凝管采外周血 1 mL。2 ~ 4 h内进行标本处理。
1. 3 蜕膜及外周血单个核细胞悬液制备及染色
单个核细胞悬液制备:无菌采集蜕膜,PBS 漂洗
2 次后,用眼科剪剪碎至约 1 mm3大小,过 300 目筛
网。离心后,上清以 Ficoll梯度离心法取白色絮状细
胞层,再经红细胞裂解液避光处理,离心洗涤后得到
蜕膜单个核细胞悬液备用。外周血以 Ficoll 梯度离
心法处理。细胞表面染色:加入 1 × 107个 /mL 的细
胞悬液 90 μL及细胞表面分子单抗(eBioscience) ,调
整终末体积至 100 μL,4 ℃避光孵育 45 min 后洗涤
离心,固定待测。
1. 4 流式细胞术检测 CD3 +和 CD4 + T细胞中 ICOS
的表达
采用流式细胞仪,通过 FSC 及 SSC 在二维点图
上划出淋巴细胞群范围,并对 FL1、FL2 通道设置荧
光补偿,采用 Cellquest软件获取细胞,检测完毕后以
FCS Express 4 软件分析数据。
1. 5 Real-Time PCR检测 ICOS基因的表达
取蜕膜组织约 50 mg,加入1 mL TRIzol (Invitrogen)
后匀浆,按说明书操作提取 RNA。提取的样品以分
光光度计检测吸光度 D(260 nm)/D(280 nm) ,RNA
置 - 70 ℃冰箱保存待用。按 Takara 公司反转录试
剂盒说明书进行反转录反应。ICOS 引物序列:5'-
AGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTC-3' (上 游) ;5'-
ATGCCTGGGTGCCAGAGTTC-3'(下游) ;按 Takara 公
司的 Real-Time PCR 反应试剂盒说明书操作。每个
样品设 3 个复孔。通过 2 - ΔΔCt方法分析蜕膜组织中
ICOS基因的相对表达量。
1. 6 统计学分析
采用 SPSS 17. 0 软件进行统计学分析,采用
Wilcoxon秩和检验,P <0. 05表示差异有统计学意义。
2 结 果
2. 1 蜕膜和外周血中 ICOS + CD3 +和 ICOS + CD4 + T
淋巴细胞亚群所占百分比
流式细胞仪检测结果显示:URSA 组蜕膜中
ICOS + CD3 + T 淋巴细胞亚群所占百分比为(0. 612 ±
0. 693)%,显著高于正常对照组的(0. 056 ± 0. 103)%,
差异有统计学意义(P < 0. 001) (图 1) ;URSA 组外周
血 ICOS + CD4 + T淋巴细胞亚群所占百分比为(1. 943 ±
0. 762)%,显著高于正常对照组的(0. 221 ± 0. 127)%,
差异也有统计学意义(P <0. 001)(图 2)。
2. 2 ICOS mRNA的相对表达量
Real-Time PCR 检测结果显示:URSA 组蜕膜组
织中 ICOS mRNA 的相对表达量较正常对照组显著
升高[(9. 875 ± 1. 464)vs (2. 701 ± 1. 737) ],差异有
统计学意义(P < 0. 05)。蜕膜组织中 ICOS 与 GAPDH
的融解曲线和扩增曲线见图 3。
·346·
上海交通大学学报(医学版) Vol. 32
3 讨 论
本研究通过流式细胞术比较了 URSA 患者及正
常妊娠早期妇女蜕膜组织和外周血 CD3 +和 CD4 + T
细胞中 ICOS 的表达水平,并通过 Real-Time PCR 对
URSA组和正常对照组妇女蜕膜局部 ICOS mRNA的
表达水平进行定量分析。研究结果表明,URSA患者
蜕膜组织 CD3 + T 细胞中 ICOS 表达水平和 ICOS
mRNA的相对表达量均较正常妊娠早期的妇女显著
升高;同时,外周血 CD4 + T细胞中 ICOS的表达水平
也较正常妊娠早期的妇女显著上升。以上结果说
明 ICOS的表达异常在 URSA 的发病过程起着重要
作用。
现代生殖免疫学认为,URSA主要与母胎免疫耐
·446·
No. 5 魏 嘉,等:诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究
受机制紊乱有关,其中效应 T 细胞在母胎免疫耐受
及效应反应中发挥核心作用。若效应 T 细胞异常活
化则会导致母体免疫系统的过度激活,并攻击半同
种异体的胎儿组织,造成流产。主要表现为 URSA
患者的外周血和蜕膜面 1 型 T 辅助淋巴细胞(Th1)
与2 型T辅助淋巴细胞(Th2)的比值(Th1 /Th2)向不
利于妊娠维持的 Th1 型方向偏移[3,4],同时 Th1 型细
胞因子与 Th2 型细胞因子比例失衡;但导致 Th1 异
常极化的具体机制尚未阐明。
T细胞的完全活化不仅需要 MHC分子递呈的抗
原特异性信号,还需要协同共刺激分子提供的共刺
激信号参与。共刺激信号分子在调控母胎界面 T 细
胞的分化、增殖及其免疫效应的发挥中起重要作用。
若共刺激分子表达异常,可导致 T 细胞的异常活化
和细胞因子表达失衡,从而导致母体免疫系统过强
攻击胎儿,造成病理性妊娠。目前,已有实验证实
CD28 /B7 家族共刺激分子参与母胎免疫调节。CD28
和(或)B7-2 表达上调或 CTLA-4 表达下调与 URSA
的发病密切相关[5,6]。然而,CD28 仅表达于静止的
T细胞上,在子宫局部过度活化的 T细胞上如何实现
其调控机制尚未完全阐明。
ICOS是新近发现的 CD28 超家族成员,受 CD28
信号及 MHC刺激信号协同作用后诱导性表达于活
化的 T细胞上,较 CD28 在调控活化的 T细胞功能上
起更重要的作用。其共刺激信号能诱导 CD4 + T 细
胞增殖,并促进 Th1 和 Th2 细胞因子(干扰素 γ、肿瘤
坏死因子 α、白介素 4、白介素 5 及白介素 10)的分
泌[7,8]。目前,认为 ICOS 主要根据组织局部及外周
免疫环境来确定 Th 细胞的分化方向[9,10]。本研究
发现:URSA患者子宫蜕膜 ICOS 蛋白及 mRNA 水平
均较正常对照组显著增高,同时 ICOS 在 URSA 患者
的外周血 T淋巴细胞上的表达也较正常对照组显著
升高,提示 ICOS与 URSA 具有密切的相关性。ICOS
作为 T细胞活化后诱导生成的细胞膜表面蛋白,其
表达增高证实了 URSA 患者子宫局部及外周免疫系
统 T细胞呈过度活化状态。由此可推测,可能是由
于 CD28 信号刺激诱导 ICOS在活化的 T细胞上表达
上调,同时 ICOS在 URSA患者偏移的 Th1 型免疫环
境中反馈性诱导 CD4 + Th1 细胞增殖分化及 Th1 型
细胞因子分泌,进一步造成 Th1 细胞的异常活化而
导致妊娠免疫耐受失衡。
目前,关于共刺激信号通路与 URSA 的相关性
已引起人们的重视,部分研究[11]通过干预共刺激信
号通路来改变同种异体抗原特异性的 T 细胞免疫效
应,已在动物实验中取得了一定的成效,但仅阻断
CD28 通路的效果并不十分理想。根据本研究结果,
可考虑将同时阻断 ICOS与 CD28 通路作为进一步研
究的新方向。
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[收稿日期]2012-02-23 [本文编辑]吴 洋
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