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诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究

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诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究 上海交通大学学报(医学版) Journal of Shanghai Jiaotong University (Medical Science) Vol. 32 No. 5 May 2012 [作者简介]魏 嘉(1986—) ,女,住院医师,硕士生;电子信箱:ghost2r@ 163. com。 [通信作者]赵爱民,电子信箱:zam0526@ yahoo. com. cn。 [文章编号] 1674-8115(2012)05-0642-04 ·论 著· 诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的 相关性研究 魏 嘉, 赵爱...
诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究
上海交通大学学报(医学版) Journal of Shanghai Jiaotong University (Medical Science) Vol. 32 No. 5 May 2012 [作者简介]魏 嘉(1986—) ,女,住院医师,硕士生;电子信箱:ghost2r@ 163. com。 [通信作者]赵爱民,电子信箱:zam0526@ yahoo. com. cn。 [文章编号] 1674-8115(2012)05-0642-04 ·论 著· 诱导性共刺激分子达与原因不明复发性流产的 相关性研究 魏 嘉, 赵爱民 (上海交通大学 医学院附属仁济医院妇产科,上海 200127) [摘要] 目的 探讨诱导性共刺激分子(ICOS)的表达与原因不明复发性流产(URSA)的关系。方法 采集 10 例诊断为难免流产 的 URSA患者(URSA组)和 10 例正常早孕妇女(正常对照组)的部分蜕膜组织和外周血,采用流式细胞术检测蜕膜组织和外周 血 CD3 +和 CD4 + T细胞中 ICOS的表达;Real-Time PCR检测蜕膜组织中 ICOS mRNA 的表达情况。结果 URSA 组蜕膜组织中 ICOS + CD3 + T淋巴细胞亚群所占百分比为(0. 612 ± 0. 693)%,显著高于正常对照组的(0. 056 ± 0. 103)%,差异有统计学意义 (P < 0. 001)。URSA组外周血 ICOS + CD4 + T淋巴细胞亚群所占百分比为(1. 943 ± 0. 762)%,显著高于正常对照组的(0. 221 ± 0. 127)%,差异有统计学意义(P < 0. 001)。URSA组蜕膜组织中 ICOS mRNA 的相对表达量较正常对照组显著升高[(9. 875 ± 1. 464)vs (2. 701 ±1. 737) ],差异有统计学意义(P <0. 05)。结论 蜕膜组织中 ICOS的表达异常与 URSA的发病具有密切关系。 [关键词]诱导性共刺激分子;原因不明复发性流产;蜕膜;外周血 [DOI] 10. 3969 / j. issn. 1674-8115. 2012. 05. 024 [中图分类号] R714. 21 [文献标志码] A Research on relationship between expression of inducible co-stimulator and unexplained recurrent spontaneous abortion WEI Jia, ZHAO Ai-min ( Department of Obstetrics and Gynecology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine, Shanghai 200127, China) [Abstract ] Objective To investigate the relationship between expression of inducible co-stimulator ( ICOS ) and unexplained recurrent spontaneous abortion ( URSA) . Methods The decidual tissues and peripheral blood samples were taken from 10 patients with URSA diagnosed as inevitable abortion ( URSA group ) and 10 women with normal early pregnancy ( normal control group) , the expression of ICOS CD3 + T cells and ICOS CD4 + T cells in decidual tissues and peripheral blood was detected by flow cytometry, and the expression of ICOS mRNA in decidual tissues was determined by Real-Time PCR. Results The proportion of ICOS + CD3 + T lymphocyte subsets in decidual tissues of URSA group was significantly higher than that of control group [( 0. 612 ± 0. 693) % vs ( 0. 056 ± 0. 103) % , P < 0. 001]. The proportion of ICOS + CD4 + T lymphocyte subsets in peripheral blood of URSA group was significantly higher than that of control group [( 1. 943 ± 0. 762) % vs ( 0. 221 ± 0. 127) % , P < 0. 001]. The relative expression of ICOS mRNA in decidual tissues of URSA group was significantly higher than that of control group [( 9. 875 ± 1. 464 ) vs ( 2. 701 ± 1. 737 ) ,P < 0. 05]. Conclusion Abnormal expression of ICOS in decidual tissues is closely related to the development of URSA. [Key words] inducible co-stimulator; unexplained recurrent spontaneous abortion; decidua; peripheral blood 临床上连续发生 3 次或 3 次以上的自然流产者 称为复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA) ,发病率占妊娠人群的 1% ~ 2%。除了经典的 染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌异常以及感染 等因素外,临床上 40% ~ 50%的患者流产原因不明, 称为原因不明复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)。20 世纪 80 年代以来, 生殖免疫学的观点认为正常妊娠之所以能够维持, ·246· No. 5 魏 嘉,等:诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究 取决于母胎间的免疫平衡即妊娠免疫耐受,而 URSA 的发生可能是妊娠免疫耐受被破坏的结果;但有关妊 娠免疫耐受的形成及导致反复流产的机制尚未阐明。 T细胞的完全活化不仅需要主要组织相容性抗 原复合物(major histocompatibility complex,MHC)分 子递呈的抗原特异性信号,还需要协同共刺激分子 提供的共刺激信号参与。其中,共刺激信号分子 B7 /CD28超家族在多种免疫调节中发挥重要作用。 诱导性共刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)是 新近发现的 CD28 家族新成员,与 CD28、CTLA-4 具 有约 39%的同源性。初期研究发现,ICOS 优势性表 达于活化的 T 淋巴细胞[1],可以促进活化 T 细胞的 增殖和分化,调节 Th1 /Th2 的极化,促进 T细胞依赖 的抗体产生[2]。目前,有关 ICOS 的研究主要集中在 动物实验和体外实验,尚未见其与 URSA 的关联研 究。本研究通过观察 ICOS 在 URSA 患者子宫蜕膜 中的表达情况,探讨 ICOS 在维持妊娠免疫耐受及导 致流产中的作用。 1 对象与方法 1. 1 研究对象 1. 1. 1 URSA 组 2010 年 11 月—2011 年 11 月在 上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科就诊并诊 断为难免流产的 URSA患者 10 例。患者既往无活胎 史,均经严格病因筛查排除染色体(包括夫妻双方外 周血染色体及本次妊娠物染色体)异常、生殖道解剖 异常、内分泌异常以及感染因素;所有患者自身抗体 阴性,凝血功能正常。 1. 1. 2 正常对照组 选择该院同期行人工流 产的正常健康早孕妇女 10 例作为对照。对照组妇女 既往均有活产史,无自然流产、死胎或死产史;排除染 色体异常、内分泌紊乱、生殖道感染以及自身免疫性疾 病;孕期无腹痛及阴道出血;B超提示胚胎发育正常。 1. 2 标本采集 经本人同意后,采集研究对象的部分蜕膜组织 及外周血。以磷酸盐缓冲液(PBS)浸泡蜕膜;EDTA 抗凝管采外周血 1 mL。2 ~ 4 h内进行标本处理。 1. 3 蜕膜及外周血单个核细胞悬液制备及染色 单个核细胞悬液制备:无菌采集蜕膜,PBS 漂洗 2 次后,用眼科剪剪碎至约 1 mm3大小,过 300 目筛 网。离心后,上清以 Ficoll梯度离心法取白色絮状细 胞层,再经红细胞裂解液避光处理,离心洗涤后得到 蜕膜单个核细胞悬液备用。外周血以 Ficoll 梯度离 心法处理。细胞表面染色:加入 1 × 107个 /mL 的细 胞悬液 90 μL及细胞表面分子单抗(eBioscience) ,调 整终末体积至 100 μL,4 ℃避光孵育 45 min 后洗涤 离心,固定待测。 1. 4 流式细胞术检测 CD3 +和 CD4 + T细胞中 ICOS 的表达 采用流式细胞仪,通过 FSC 及 SSC 在二维点图 上划出淋巴细胞群范围,并对 FL1、FL2 通道设置荧 光补偿,采用 Cellquest软件获取细胞,检测完毕后以 FCS Express 4 软件分析数据。 1. 5 Real-Time PCR检测 ICOS基因的表达 取蜕膜组织约 50 mg,加入1 mL TRIzol (Invitrogen) 后匀浆,按说明书操作提取 RNA。提取的样品以分 光光度计检测吸光度 D(260 nm)/D(280 nm) ,RNA 置 - 70 ℃冰箱保存待用。按 Takara 公司反转录试 剂盒说明书进行反转录反应。ICOS 引物序列:5'- AGGATGTGCAGCCTTTGTTGTAGTC-3' (上 游) ;5'- ATGCCTGGGTGCCAGAGTTC-3'(下游) ;按 Takara 公 司的 Real-Time PCR 反应试剂盒说明书操作。每个 样品设 3 个复孔。通过 2 - ΔΔCt方法分析蜕膜组织中 ICOS基因的相对表达量。 1. 6 统计学分析 采用 SPSS 17. 0 软件进行统计学分析,采用 Wilcoxon秩和检验,P <0. 05表示差异有统计学意义。 2 结 果 2. 1 蜕膜和外周血中 ICOS + CD3 +和 ICOS + CD4 + T 淋巴细胞亚群所占百分比 流式细胞仪检测结果显示:URSA 组蜕膜中 ICOS + CD3 + T 淋巴细胞亚群所占百分比为(0. 612 ± 0. 693)%,显著高于正常对照组的(0. 056 ± 0. 103)%, 差异有统计学意义(P < 0. 001) (图 1) ;URSA 组外周 血 ICOS + CD4 + T淋巴细胞亚群所占百分比为(1. 943 ± 0. 762)%,显著高于正常对照组的(0. 221 ± 0. 127)%, 差异也有统计学意义(P <0. 001)(图 2)。 2. 2 ICOS mRNA的相对表达量 Real-Time PCR 检测结果显示:URSA 组蜕膜组 织中 ICOS mRNA 的相对表达量较正常对照组显著 升高[(9. 875 ± 1. 464)vs (2. 701 ± 1. 737) ],差异有 统计学意义(P < 0. 05)。蜕膜组织中 ICOS 与 GAPDH 的融解曲线和扩增曲线见图 3。 ·346· 上海交通大学学报(医学版) Vol. 32 3 讨 论 本研究通过流式细胞术比较了 URSA 患者及正 常妊娠早期妇女蜕膜组织和外周血 CD3 +和 CD4 + T 细胞中 ICOS 的表达水平,并通过 Real-Time PCR 对 URSA组和正常对照组妇女蜕膜局部 ICOS mRNA的 表达水平进行定量分析。研究结果表明,URSA患者 蜕膜组织 CD3 + T 细胞中 ICOS 表达水平和 ICOS mRNA的相对表达量均较正常妊娠早期的妇女显著 升高;同时,外周血 CD4 + T细胞中 ICOS的表达水平 也较正常妊娠早期的妇女显著上升。以上结果说 明 ICOS的表达异常在 URSA 的发病过程起着重要 作用。 现代生殖免疫学认为,URSA主要与母胎免疫耐 ·446· No. 5 魏 嘉,等:诱导性共刺激分子表达与原因不明复发性流产的相关性研究 受机制紊乱有关,其中效应 T 细胞在母胎免疫耐受 及效应反应中发挥核心作用。若效应 T 细胞异常活 化则会导致母体免疫系统的过度激活,并攻击半同 种异体的胎儿组织,造成流产。主要表现为 URSA 患者的外周血和蜕膜面 1 型 T 辅助淋巴细胞(Th1) 与2 型T辅助淋巴细胞(Th2)的比值(Th1 /Th2)向不 利于妊娠维持的 Th1 型方向偏移[3,4],同时 Th1 型细 胞因子与 Th2 型细胞因子比例失衡;但导致 Th1 异 常极化的具体机制尚未阐明。 T细胞的完全活化不仅需要 MHC分子递呈的抗 原特异性信号,还需要协同共刺激分子提供的共刺 激信号参与。共刺激信号分子在调控母胎界面 T 细 胞的分化、增殖及其免疫效应的发挥中起重要作用。 若共刺激分子表达异常,可导致 T 细胞的异常活化 和细胞因子表达失衡,从而导致母体免疫系统过强 攻击胎儿,造成病理性妊娠。目前,已有实验证实 CD28 /B7 家族共刺激分子参与母胎免疫调节。CD28 和(或)B7-2 表达上调或 CTLA-4 表达下调与 URSA 的发病密切相关[5,6]。然而,CD28 仅表达于静止的 T细胞上,在子宫局部过度活化的 T细胞上如何实现 其调控机制尚未完全阐明。 ICOS是新近发现的 CD28 超家族成员,受 CD28 信号及 MHC刺激信号协同作用后诱导性表达于活 化的 T细胞上,较 CD28 在调控活化的 T细胞功能上 起更重要的作用。其共刺激信号能诱导 CD4 + T 细 胞增殖,并促进 Th1 和 Th2 细胞因子(干扰素 γ、肿瘤 坏死因子 α、白介素 4、白介素 5 及白介素 10)的分 泌[7,8]。目前,认为 ICOS 主要根据组织局部及外周 免疫环境来确定 Th 细胞的分化方向[9,10]。本研究 发现:URSA患者子宫蜕膜 ICOS 蛋白及 mRNA 水平 均较正常对照组显著增高,同时 ICOS 在 URSA 患者 的外周血 T淋巴细胞上的表达也较正常对照组显著 升高,提示 ICOS与 URSA 具有密切的相关性。ICOS 作为 T细胞活化后诱导生成的细胞膜表面蛋白,其 表达增高证实了 URSA 患者子宫局部及外周免疫系 统 T细胞呈过度活化状态。由此可推测,可能是由 于 CD28 信号刺激诱导 ICOS在活化的 T细胞上表达 上调,同时 ICOS在 URSA患者偏移的 Th1 型免疫环 境中反馈性诱导 CD4 + Th1 细胞增殖分化及 Th1 型 细胞因子分泌,进一步造成 Th1 细胞的异常活化而 导致妊娠免疫耐受失衡。 目前,关于共刺激信号通路与 URSA 的相关性 已引起人们的重视,部分研究[11]通过干预共刺激信 号通路来改变同种异体抗原特异性的 T 细胞免疫效 应,已在动物实验中取得了一定的成效,但仅阻断 CD28 通路的效果并不十分理想。根据本研究结果, 可考虑将同时阻断 ICOS与 CD28 通路作为进一步研 究的新方向。 [参考文献] [1]Aicher A,Hayden-Ledbetter M,Brady WA,et al. Characterization of human inducible co-stimulator ligand expression and function[J]. J Immunol,2000,164(9) :4689 - 4696. [2]Arimura Y,Kato H,Dianzani U,et al. A co-stimulatory molecule on activated T cells,H4 /ICOS,delivers specific signals in T(h) cells and regulates their responses[J]. Int Immunol,2002,14(6) : 555 - 566. [3]林其德,邱丽华. 免疫型复发性流产的发病机制及诊断和治疗 [J].上海交通大学学报:医学版,2009,29(11) :1275 - 1278. [4] Jin LP,Fan DX,Zhang T,et al. The costimulatory signal upregula- tion is associated with Th1 bias at the maternal-fetal interface in human miscarriage[J]. Am J Reprod Immunol,2011,66(4):270 - 278. [5]Wang X,Ma Z,Hong Y,et al. Expression of CD28 and cytotoxic T lymphocyte antigen 4 at the maternal-fetal interface in women with unexplained pregnancy loss[J]. Int J Gynaecol Obstet,2006,93 (2) :123 - 129. [6]Ruter J,Hoffmann T,Heiser U,et al. The expression of T-cell surface antigens CTLA-4,CD26,and CD28 is modulated by inhibi- tion of dipeptidyl peptidase IV (DPP IV,CD26)activity in murine stress-induced abortions[J]. Cell Immunol,2002,220(2) :150 - 156. [7]Khayyamian S,Hutloff A, Buchner K, et al. ICOS ligand, expressed on human endothelial cells,costimulates Th1 and Th2 cytokines secretion by memory T cell[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99(9) :6198 - 6203. [8]Nurieva RI,Mai XM,Forbush K,et al. B7h is required for T cell activation,differentiation,and effect or function[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(24) :14163 - 14168. [9]McAdam AJ,Greenwald RJ,Levin MA,et al. ICOS is critical for CD40-mediated antibody class switching[J]. Nature,2001,409 (6816) :102 - 105. [10]Tafuri A,Shahinian A,Bladt F,et al. ICOS is essential for effec- tive T helper cell responses[J]. Nature,2001,409(6816) :105 - 109. [11]Jin LP,Zhou YH,Wang MY,et al. Blockade of CD80 and CD86 at the time of implantation inhibits maternal rejection of the allogeneic fetus in abortion-prone matings[J]. J Reprod Immunol,2005,65 (2) :133 - 146. [收稿日期]2012-02-23 [本文编辑]吴 洋 ·546·
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