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几种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及细胞毒性

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几种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及细胞毒性 72 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2005年第 26卷第 2期 的抑制作用。而 PM 对 M rr还原能力的测定, PM(I)分泌 NO与 IL一1的量的检测 ,PM(I)培养时间较 长,随着培养时间的延长,溶媒或稳定剂抑制作用逐 步减弱,作用则会增强。从 4个实验结果可以得 出, GPIF浓度在0.1 mg/ml时为比较理想的作用剂量。 有报道,羊胚胎盘肽还具有传递体液免疫和细 胞免疫等生物活性 J。巨噬细胞在非特异性和特 ...
几种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及细胞毒性
72 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2005年第 26卷第 2期 的抑制作用。而 PM 对 M rr还原能力的测定, PM(I)分泌 NO与 IL一1的量的检测 ,PM(I)培养时间较 长,随着培养时间的延长,溶媒或稳定剂抑制作用逐 步减弱,作用则会增强。从 4个实验结果可以得 出, GPIF浓度在0.1 mg/ml时为比较理想的作用剂量。 有报道,羊胚胎盘肽还具有传递体液免疫和细 胞免疫等生物活性 J。巨噬细胞在非特异性和特 异性免疫应答的诱导和调节中起关键作用,GPIF可 能是作为一种免疫激活剂,一方面激活大量处于休 眠状态的巨噬细胞,另一方面显著提高已经处于活 化状态的巨噬细胞的功能,从而增加巨噬细胞的吞 噬和抗氧化功能,并诱导其分泌大量的细胞因子等 生物活性物质以联系特异性免疫,使非特异性免疫 和特异性免疫相互协作,从而提高机体的免疫能力。 参考文献 : [1] 丰慧根 .胎盘免疫调节肽对免疫抑制状态小鼠的免疫调节作用 fJ].新 乡医学院学报,1995,l2(2):134.136. [2] 杨桂芹,邹兴淮.胎盘及其提取物的化学成分、药理作用及临床 应用研究进展[J].沈阳农业大学学报,2003,34(2):150-154. [3] 顾立刚,周勇 ,严宣左,等 .薄盖灵芝对小鼠腹腔巨噬细胞的作 用[J].上海免疫学杂志,1990,10(4):205.207. [4] Mosmann T.Rapid Colofimetric assay for cellular growth and surrival application to proliferation and cytotoxicity assays[J J.J Immunol, 1990,145(3):940.948. [5] Sotomayor EM,Dinapoli MR,Caldemn CC,et a1.Decreased macmphag — e mediated cytotoxicity in mammary—tummor bearing mice is related to alteration of nitric oxide production and release【J J.Int J Cancer,1995, 60(5):660.667. [6] 张均田.现代药理实验[M].北京:北京医科大学中国协和 医科大学联合出版社 ,1998.729.740. [7] 刘士山,张子周,朱和平,等.羊胚胎盘肽功能测试[J].中国生 化药物杂志,2002,23(5):236.238. [8] 丰慧根,任太芳,韩金红,等.胎盘免疫调节联合化疗药物抗肿 瘤作用的研究[J].中国生化药物杂志,1999,20(3):129.131. [9] 丰慧根,李延 兰,任太芳,等 .胎盘免疫调节肽 的抗肿瘤作用 [J].中国生化药物杂志,1998,19(2):82.84. 几种美白活性物质对酪氨酸酶活性的体外抑制作用及细胞毒性 张春香,尹鸿萍,王 曼 (中国药科大学 生命科学与技术学院,江苏 南京 210009) 摘 要 :目的 比较熊果苷、VitC、VitC衍生物、氢醌和曲酸对小鼠恶性黑 色素瘤细胞(B.16细胞)中的酪氨酸酶 活性及酪氨酸酶对照品的抑制情况,并检测它们对细胞的毒性,以期为皮肤美白剂的开发提供有价值的参考。方 法 采用左旋多巴氧化法测定酪氨酸酶的活性,测定细胞上清液中乳酸脱氢酶的含量。结果 细胞中酪氨酸酶的活 性与药物浓度和药物作用时间成反比,有量效关系。结论 在5种美白剂中,熊果苷最为安全有效。 关键词 :皮肤 美白剂;B一16细胞;酪氨酸酶:细胞毒性 中图分类号 :TQ658.5 文献标识码 :A 文章编号:1005.1678(2005)02.0072 04 Inhibition effects of some active materials on the tyrosinase activity and comparison of their toxicity in vitro ZHANG Chun—xiang,YIN Hong—ping,WANG Min (School oflife Science and Technology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China) Abstract:Purpose Arbutin,VitC,VitC—ramification,hydroquinone and kojic acid were investigated in vitro for the action on tyrosinase activity in cultured B-1 6 murine melanoma cells and their toxicity on cells . They also reacted with standard tyrosinase.It would provide valuable reference to develop the skin whitening 收稿日期:2004.06.21;修回日期:2004.10.12 作者简介:张春香(1978.),女,河南新乡人,硕士研究生:王曼, 通讯作者,教授,博士生导师 ,院长 ,主要研究方向为生物制药,Tel: 025-8327 1395。 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2005年第 26卷第 2期 73 products.Methods Tyrosinase activity in B-1 6 cell was determined by L-DOPA oxidization.Judging toxicity of these dmgs on cell through determ ining the release of lactate dehydrogenase.Results Tyrosinase activityshowed inverse proportion with dmg concentration and cultured time in dose—dependent manner.Conclusion Among those drugs arbutin was safer and more effective. Key s :skin lighteners;B-1 6 cell;tyrosinase;toxicity on cells 皮肤美白剂是通过作用于皮肤黑色素的形成、 代谢途径的某个阶段,能够显著控制、抑制黑色素生 成且符合安全要求的物质。体内的酪氨酸在酪氨酸 酶的作用下转化为多巴、多巴醌、多巴色素、5,6一二 羟吲哚、吲哚.5,6.醌等⋯,最终转变为色素颗粒。 在酪氨酸反应生成黑色素的过程中,酪氨酸酶的催 化作用主要发生在酪氨酸转化成多巴和多巴转化为 多巴醌这两个反应中。因此,一大类美 白剂的作用 是通过抑制酪氨酸酶的活性,减少黑色素的生成,从 而达到美白的目的。 本文采用与人体黑色素细胞生理上较为接近的 B一16细胞与药物直接作用,以便为科学地评价这些 美白剂的作用,提供客观的实验基础。 1 材 料 酪氨酸酶 、左旋多巴(L—DOPA),Sigma公司;胰 酶,Amresco公司分装;RPMI 1640培养液,Gibco公 司;乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒,南京建成生物工程公 司;熊果苷、氢醌、曲酸和 VitC衍生物,Simp公司。 小鼠恶性黑色素瘤细胞 (B一16细胞),中国药科 大学新 中新药中心惠赠。 BBHF一16 CO,培养箱,上海力申公司;96孔培 养板,Coming公司;DG5031酶联免疫检测仪,华东 电子管厂。 2 方 法 2.1 细胞培养方法[2] 选择对数生长期的同一代细胞,用 0.25%胰酶 消化 ,离心,弃上清,沉淀加 RPMI 1640培养液,吹打 使之成为单细胞悬液,调整细胞数为4×10 个/ml, 96孔板每孔加细胞悬液 100 l,再补充培养液 100 l,铺板 24 h后,弃上清,加入含不同浓度美白剂的 RPMI 1640培养液,在37℃,5%CO,饱和湿性条件下 培养,每一浓度设6个复孔,对照孔加不含药的 RP. MI 1640培养液,培养 3 d。1.5 d后更换药液 1次。 2.2 细胞 内酪氨酸酶活性的测定【3, J 采用多巴氧化法对酪氨酸酶活性进行测定。将 作用时间已到的细胞弃上清,磷酸盐缓冲液(PBS) 荡洗 2次,每孔加 0.5%脱氧胆酸钠溶液 100“l,振 荡 10 min,0℃,30 min后升温 至 37℃,加入 0.1% L.DOPA溶液 10 l,孵育30 min后在475 nm波长处 测吸收度( )。酪氨酸酶活性抑制率 =(1一 加药组/ A x,J , ~tu)×100%。 2.3 各种美白剂对酪氨酸酶品的抑制实验【5 于试管中按表 1准确吸取 1,2,3,4组反应液, 混匀,28℃水浴,准确反应 5 min,于 475 nm波长测 定 ,依次为 。, 2, 3, 4,每组平行实验 3次,抑 制率%:[1一(A 3一A4)/(Al—A2)]×100%。 表 1 反应液组成 2.4 测定细胞上清液中IJ)H的水平【6 J 参照 LDH试剂盒说明书操作。取细胞上清液 200 l和基质缓冲液0.25 ml,测定管加辅酶 1 0.05 ml,测定空白管加水0.05 ml,充分混匀后 37℃水浴 15 min,每管再加入2,4.二硝基苯肼溶液0.25 ml,混 匀,37℃水浴 15 min,加入 0.4 mol/L NaOH溶液 2.5 ml,混匀,室温放置3 min,测定 A440 ,每组平行操作 3次。 3 结果与讨论 3.1 加药后细胞形态的变化 培养 3 d后 ,对照组细胞上清液呈淡黄色,镜下 观察细胞呈梭形,多为两级,偶见三级,细胞核明显。 氢醌处理的细胞,从高浓度到低浓度培养液明显的 由棕红色到淡棕色递减。镜下观察浓度较小的两 组,皱缩,不能维持正常性状,数量较对照组少。高 浓度的几组细胞呈片状,数量非常少。VitC衍生物 浓度最高的3组细胞上清液呈淡粉色。浓度越高, 细胞数量越少,细胞不能保持正常形态,皱缩得接近 球形,细胞连接少,细胞多孤立存在不能连接成网 状。其它几组美白剂较高浓度的加药组细胞数量都 较低浓度加药组少。 细胞在毒性大的加药环境中不能正常生长。从 维普资讯 http://www.cqvip.com 74 中国生化药物杂志 Chinese Joumal of Bi0chemicM Pharmaceutics 2005年第 26卷第 2期 各组较高浓度的加药组细胞数量都较低浓度加药组 少来看,这5种美白剂或多或少都存在细胞毒性,因 此要在一定的安全剂量范围内使用美白剂。 3.2 5种 美白剂对细胞 内酪氨 酸酶活性 的抑制比 较 从表2可以看出,这 5种物质对细胞内酪氨酸 酶的抑制,Ic铀的大小顺序是 VitC衍生物 >熊果苷 >氢醌 >VitC>曲酸。也就是说 VitC对酪氨酸酶的 抑制效果仅次于曲酸。Ic 最小的是 VitC,IC 。以曲 酸最小。VitC具有多种生理活性作用,人们多愿接 受,因为它的不稳定性,实际使用中多用其衍生物。 曲酸对酪氨酸酶的抑制效果是很好的,有报道说它 的作用机制是与酪氨酸酶上作为辅基的铜结合而抑 制酶的活性。曲酸还可以通过阻断黑色素的中间生 成物 ,达到抑制黑色素生成的美白效果,也是因为在 水溶液中不稳定,实际应用中的发展方向是使用它 的油溶性衍生物 。 表 2 5种美白剂的 Ic一 和 Ic50 3.3 对酪氨酸酶对照品的抑制结果 从胞外酶抑制实验结果(图 1)可知,VitC、熊果 苷和曲酸对酶 的抑制较强 ,几乎能达到 100%。这 可以说明抑制黑色素生成的过程中,这两种物质能 从抑制酪氨酸酶活性方面影响黑色素的生成量。在 一 些文献中把 VitC划为通过还原黑色素达到淡化 色素的美白剂,笔者认为这种划分不够全面,因为从 此项实验可以很清楚的看到,VitC抑制酪氨酸酶活 性的能力非常高,抑制酶活到达抑制黑色素生成也 应该是它作用机制的一个方面。另外我们在实验中 发现一个有趣的现象,氢醌在低浓度不但不抑制酪 氨酸酶的活性,反而激活酶的活性,它在高浓度抑制 酶的活性,作用机制待研究。 3.4 细胞上清液中LDH的测定结果 LDH是反映细胞膜完整性的重要指标。我们 通过检测细胞上清液中 LDH的水平,来检测美白剂 的细胞毒性,结果见表 3。各加药组细胞上清液的 LDH均高于对照组,所以这几种物质均有一定的细 胞毒性。氢醌的细胞毒性较大,仅在最低的3个加 药浓度组中检测到 LDH的水平。结合细胞形态观 察结果推测,较高浓度氢醌作用于细胞后,因其细胞 毒性太大,细胞存活数量太少,释放的 LDH少 ,所 以 检测不到。曲酸组 以 200 g/ml为界 ,出现了 LDH 水平先升后降的现象,笔者认为这是因为随着药物 浓度的增加,细胞膜受损程度增加,LDH水平上升。 药物浓度增加到引起细胞毒性以后,会影响细胞增 殖,细胞数量少则释放出的 LDH也减少。VitC.衍生 物的 LDH释放情况同曲酸有相似之处,LDH水平也 是先升后降,但是最大与最小剂量组的 LDH释放水 平相差不多,所 以相对于曲酸还是安全的。熊果苷 最大与最小剂量组的LDH水平相当,故细胞毒性较 其它3种物质小,是最安全的,加上它的化学性质也 较为稳定,实际应用中很多品牌的美白化妆品使用 的就是熊果苷。对照组 LDH的释放水平是(232.86 ±12.61)U/L。 表3 5种美白剂对 B16细胞中酪氨酸酶活性抑制情况 4 结 论 美白剂应该符合两个标准,一是对酪氨酸酶活 性有较高的抑制率,能显著的减少黑色素的生成;二 有较高的安全性,对人体皮肤无毒无刺激。熊果苷、 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国生化药物杂志 Chinese Journal of Biochemical Pharmaceutics 2005年第26卷第 2期 75 VitC衍生物和曲酸是目前国内外美白化妆品中较常 使用的美白成分,我们从细胞内和细胞外实验可知 它们对酪氨酸酶活性都有较强的抑制。氢醌是最早 使用的皮肤美白剂,效果很好,但是在使用过程中出 现的强烈刺激性和可疑致癌性 ,以及皮肤色素不均 匀分布,已被限制或禁止用于美白化妆品。通过检 测细胞培养上清液中LDH的水平来评估这几种物 枣 \ |I;{L 藁 量 枣 \ 铸 磊 量 熊果苷 质的毒性,结果表明这几种物质都能破坏细胞膜的 完整性,高浓度能抑制细胞的增殖,氢醌的这种作用 尤甚,从而推测这几种物质高浓度时细胞生长受抑 制应该与细胞膜受损有关。当然,这几种物质对细 胞毒性应该是多方面的,细胞膜损伤只是细胞毒性 的一个方面,要更合理的解释这几种物质的毒副作 用还有待以后的进一步研究。 O O02 O04 O o6 O D8 . O 002 O o4 O08 浓度/% VitC衍生物 VitC 0 0 005 0 010 0 015 0.020 — _ / ● f J 0 T0 b1 0 62 0 图 1 5种美白剂对酪氨酸酶对照品的抑制结果 表4 几种美白剂作用后细胞释放 LDH的比较(n:3, ±s) 参考文献 : [1] Maeda K,Fukuda M.Arbutin:Mechanism of its depigmenting action in melanocyte culture[J].J Pharmacol Exp Ther,1996,276(2):765. 769. [2] 司徒镇强 ,吴军正.细胞培养(修订版)[M].北京:世界图书 出 版社 ,2004.35.42,79.80. 13 J Hideya A,Akira I,Yutaka M,et a1.Correlatlon between the number of melanosomes,tyrosinase mRNA levels,and tyrosinase activity in cultured murine melanoenesis regulatary agents[J].J Cellul Pbysiol, 1995.163(3):608.613. Qiu L,Zhang M,Rick AS,et a1.Inhibition of melanin synthesis by cyst,amine in human melanoma cells[J].J Investigative Dermatology, 2000,114(1):21.27. 王自强 ,曾晓军 .酪氨酸酶活性 的抑制研究及皮肤美 白化妆 品的研制[J].福建轻纺,2002,(7):1.6. 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