白细胞介素_6基因型与桂北地区2型糖尿病肾病相关性研究

第22 卷第5 期 华　夏　医　学 V o l122 N o15 2009 年10 月 A cta M edicinae Sin ica O ct12009 白细胞介素26 基因型与桂北地区2 型糖尿病肾病相关性研究① 陈军宁a②, 尹友生a, 李小励a, 韦家智a, 邓一岚a, 苏　珂b (桂林医学院附属医院, a. 泌尿内科; b. 内分泌科, 广西 桂林　541001) 摘要: 目的: 探讨白细胞介素26 ( IL 26)基因启动子2572 CöG 多态性各等位基因及基因型在 2 型糖尿病肾病患者中的分 布频率, 并其基因型与2 型糖尿病肾病的相关性。方法: 采用聚合酶链反应2限制性片段长度多态性 (PCR 2R FL P) 技术检测183 例2 型糖尿病肾病患者 (其中91 例伴糖尿病肾病)及105 例正常对照组 IL 26 基因多态性, 包括 IL 26 基因 启动子2572CöG 位点, 同时采用酶联免疫吸附试验 (EL ISA )检测血清 IL 26 水平。结果: 糖尿病肾病组 IL 26 血清水平显 著高于糖尿病不伴肾病组和对照组 (P < 0. 01) , IL 26 基因多态性在两组人群中的分布差异存在显著性差异 (P < 0105) , 等位基因频率的相对风险分析发现, G 等位基因携带者患糖尿病肾病的风险是C 等位基因的 11618 倍 (OR = 11618, 95%C I: 11082～ 21418) , 携带G 等位基因的糖尿病肾病患者 IL 26 血清水平显著高于不携带者 (361171±93142 pgöm l V S 343103±86154 pgöm l, P < 0105)。结论: IL 26 基因启动子2572 CöG 多态性与糖尿病肾病的发病具有相关 性, 其中G 等位基因可能是糖尿病肾病发病的遗传易感基因, 携带G 等位基因的个体可能通过促进 IL 26 的高度达 进而增加 2 型糖尿病肾病的发病风险。 关键词: 白细胞介素26; 糖尿病肾病; 基因型 中图分类号: R 587. 1　　　文献标识码: A 　　　文章编号: 100822409 (2009) 0520801204 The genotype of IL -6 gene in patien ts with type 2 diabetic nephropathyöCHEN Jun -n ing, Y IN Y ou-sheng, L I X iao- l i, et a l. ∥D epartm en t of Em ergency, The Aff il ia ted Hosp ita l of Guil in M edica l College, Guil in 541001, Ch ina Abstract: O b ject ive: To study the relat ionsh ip the allele frequencies and geno type distribu t ion of in terleuk in ( IL 26) gene p romo ter - 572CöG po lymo rph ism in Ch inese patien ts w ith type 2 diabetes m ellitu s and diabet ic neph ropathy (DN ) , A nd analyze associat ion the serum levels and geno type of IL 26 w ith type 2 diabet ic neph ropathy. M ethods: T he IL 26 gene p romo ter - 572CöG po lymo rph ism w ere detected by po lym erase chain react ion2restrict ion fragm en t length po lymo rph ism ( PCR 2R FL P ) analysis among 183 patien ts w ith type 2 diabetes m ellitu s and 105 healthy con tro ls. T he serum level of IL 26 w as determ ined by enzym e2linked imm uno so rben t assay (EL ISA ). R esu lts: T he diabet ic neph ropathy group show ed sign ifican tly h igher serum levels of IL 26 than that of con tro l group (P < 0. 01). T here w as sign ifican t difference in frequencies of allele and geno type in - 572CöG po lymo rph ism betw een type 2 diabet ic neph ropathy group and con tro l group s, respect ively. T he relat ive risk suffered from type 2 diabet ic neph ropathy of Gallele w as 1. 618 tim es of the C allele (OR = 1. 618, 95%C I: 1. 082～ 2. 418) , the serum IL 26 level w as sign ifican tly h igher among carriers of G allele as compared w ith non2carriers (C allele) (361. 71±93. 42 pgöm l V S 343. 03±86. 54 pgöm l, P < 0. 05). Conclu sion: IL 26 gene p romo ter - 572CöG po lymo rph ism w as associated w ith type 2 diabet ic neph ropathy, and G allele m ay be a genetic risk facto r of type 2 diabet ic neph ropathy. In w h ich the IL 2 6 G allele carriers m ay be increase risk by enhancing the IL 26 exp ression in the pathogenesis of type 2 diabet ic neph ropathy. Key words: in terleuk in26; diabet ic neph ropathy; geno type 　　糖尿病肾病 (D iabet ic N eph ropathy,DN ) 是糖尿 病最常见的慢性微血管并发症之一, 是严重危害中、 老年人生命健康的疾病。然其病因和发病机制尚未完 全阐明, 但细胞因子在其中的作用越来越受到重视。 白细胞介素26 ( In terleuk in26, IL 26) 是一种具有多种 功能的炎症细胞因子, 它与血脂代谢紊乱、凝血机制 异常、动脉粥样硬化形成等糖尿病肾病危险因素密切 相关。IL 26 基因存在着基因变异及基因多态性, 这种 ·108· ① ② 作者简介: 陈军宁 (1963- ) , 男, 1987 年毕业于广西医科大学, 现为桂林医学院附属医院副主任医师, 急诊科主任, 硕士研究生导师。 基金项目: 广西壮族自治区卫生厅自筹经费科研项目 (Z2005163)。 基因多态性与多种疾病存在相关性[ 123 ] , 与糖尿病肾 病是否相关, 文献报道较少[ 4, 5 ]。为此, 笔者应用聚合 酶链反应2限制性片段长度多态性 (PCR 2R FL P ) 方 法, 研究 IL 26 基因启动子2572 CöG 多态性及血清水 平与糖尿病肾病的关系, 阐明基因型与表型之间的联 系, 为认识糖尿病肾病的发病机制提供一定的实验依 据。 1　对象与方法 1. 1　研究对象 1. 1. 1　2 型糖尿病 (T 2DM ) 组　共 183 例, 男 82 例, 女101 例; 平均年龄 (52. 7±10. 1)岁。均符合1997 年 W HO 糖尿病诊断及分型标准。分为糖尿病肾病 (DN )组91 例, 男40 例, 女51 例, 年龄 (57. 59±9. 72) 岁, 平均病程 (86. 85±79. 66) 月; 入选条件: ①至少 2 次尿白蛋白排泄率 (UA ER ) > 30 m gö24 h; ②尿蛋白 定量> 0. 5gö24 h; ③血肌酐> 167Λm o löL。有上述条 件之一, 并排除其他疾病引起的蛋白尿和肾功能不 全。糖尿病不伴肾病 (DM )组92 例, 男42 例, 女50 例, 年龄 (56. 72±9. 98)岁, 平均病程 (82. 15±50. 85)月; 入选条件为3 次UA ER < 30 m gö24h。 1. 1. 2　健康对照 (HC) 组　共 105 例, 男 50 例, 女 55 例; 年龄 (54. 27±10. 13)岁, 为健康体检者, 排除了糖 尿病、高血压、冠心病和肥胖及相应疾病的家族史。以 上全部研究对象均来自广西桂北地区汉族人群, 且无 血缘关系。 1. 2　研究方法 1. 2. 1　引物与合成　参照有关文献设计一对引 物[ 6 ] , 由北京赛百盛有限公司合成。用于特异性扩增 IL 26 基因包含2572 位点的一段DNA 引物序列, 上游 引物为: 5’2GGA GA CGCC T T GAA GTAA CT GC2 3 ’; 下 游 引 物 为: 5 ’2GA GT T TCCTCT GA CTC CA TCGCA G23’。 1. 2. 2　人类基因组DNA 提取　参照已建立的改良 碘化钠法。取全血200Λl 加无菌双蒸水100Λl 混匀, 加 6m o löL 碘化钠 200Λl 颠倒混匀2 m in (勿震荡) , 加等 体积氯仿ö异戊醇 ( 24: 1) 混匀, 漩涡震荡 3 m in, 15000rpm 离心15 m in, 取上清液加240Λl 纯异丙醇混 匀, 室温 (或4℃)静置15 m in, 15000rpm 离心15 m in, 弃上清, 沉淀用 37% 异丙醇或 70% 乙醇洗涤 3 次, 自 然晾干, 加 50Λl T E 缓冲液溶解, 经紫外分光光度计 定量后于- 70℃冻存备用。 1. 2. 3　聚合酶链反应基因扩增　 IL 26 的 PCR 扩增 反应体系为 25Λl, 其中含 10×PCR Buffer 215Λl, 215mm o löL dN T P s2. 0Λl, 引物P1、P2 各20pm o l, DNA 5. 0Λl, T aqDNA 聚合酶 1. 25U , 不足体积用灭 菌双蒸水补足至 25Λl。置热循环仪 (GeneAm p PCR System 2700 型) 中 94℃预变性 5m in; 再按下列程序 循环35 次, 即94℃变性45s, 57℃退火1m in, 72℃延伸 1m in; 末次循环后, 72℃延伸5m in。 1. 2. 4　扩增产物的限制性酶切　取 PCR 扩增产物 10Λl, 8U M b iÉ 于37℃酶切3 h (英国B io lab s 公司)酶 切 IL 26 基因2572 位点, 反应终止后, 消化片段在 3% 琼脂糖凝胶上电泳, EB 染色, 染色后经紫外灯判断结 果并拍照。 1. 2. 5　血脂、脂蛋白及载脂蛋白水平测定　酶法测 定血清总胆固醇和甘油三酯; 遮蔽法直接测定高密度 脂蛋白胆固醇 (HDL 2C ) 和低密度脂蛋白胆固醇 (LDL 2C) ; apoA、apoB 用双波长免疫透射比浊法测 定。以上测定均在日立 7060 型 (日本产) 全自动生化 分析仪上进行, 每次测定均选用高、中、低 3 种质控样 品进行质控, 以上项目检测质控均符合英国R IQA S 国际质控标准。 1. 2. 6　血清 IL 26 水平的检测　采用酶联免疫吸附 实验测定 IL 26 血清水平 (V IDA S 型酶标仪) , 试剂盒 由美国GeneM ay 公司提供, 每次测定均严格按说明 书操作。 1. 3　统计分析 用SPSS 11. 5 软件包进行分析。基因型和等位基 因频率采用基因直接计数法计算, 各组间基因型及等 位基因频率比较采用 ς 2 检验, 并以比值比 (OR ) 及其 95% 可信区间 (C I) 表示相对风险度。计量资料用 (xθ ±s)表示, 各组间数据的比较依据资料的性质, 用 t 检 验、方差分析。以P < 0. 05 为统计学意义。 2　结果 2. 1　 IL 26 基因型分析 IL 26 基因2572 CöG 多态性, PCR 扩增产物片段 大小为163 bp , 根据限制性内切酶M b iÉ 酶切片段的 情况, 本实验共发现的基因型有 3 种, CC 型 (163bp 1 条带) , CG 型 (163 bp , 101bp , 62bp 3 条带) , GG 型 (101bp , 62bp 2 条带)。 2. 2　糖尿病肾病组、糖尿病不伴肾病组与对照组临 床资料比较 3 组在性别和年龄上进行了匹配。糖尿病肾病组 TC、T G、和 IL 26 水平均显著高于对照组 (P < 0. 01) ; ·208· 第5 期　　　　　　　　　　　 　　　　　华　夏　医　学　　　　　　　　　　　　　　　 　第22 卷 SBP (收缩压 )、DBP (舒张压 )、HDL 2C、LDL 2C、 apoA、apoB 在各组间比较差异无显著性 (P > 0. 05) , 见表1。 2. 3　糖尿病肾病组、糖尿病不伴肾病组及正常对照 组 IL 26 基因型和等位基因频率分布 糖尿病肾病组 IL 26 (2572 CöG) 基因CC 型、CG 型及GG 型频率分布与正常对照组及糖尿病不伴肾 病组比较差异均有显著意义 (分别为 ς 21= 6. 235, P < 0105; ς 22= 6. 528, P < 0. 05)。糖尿病肾病组G 等位基 因频率为60. 4% , 亦与正常对照组及糖尿病不伴肾病 组分布差异有显著意义 (ς 21 = 5. 530, P < 0. 05; ς 22 = 51862, P < 0. 05) , 与对照组比较, 携带G 等位基因的个体患糖尿病肾病的相对风险度增加 1. 618 倍 (OR= 1. 618, 95%C I: 1. 082～ 2. 418)。而不伴肾病组与正常对照组相比, 其基因型频率和等位基因频率差异均无显著性 (P > 0105) , 见表2。2. 4　糖尿病肾病组和对照组 IL 26 各基因型间血脂、IL 26 血清水平比较2 型糖尿病肾病组和对照组中CG+ GG 基因型血清 IL 26、U C 水平显著高于CC 基因型 (P < 0. 05) ,见表3。 表 1　糖尿病肾病组、糖尿病不伴肾病组与对照组临床资料比较 (xθ±s) 组别 n (男ö女) 年龄 (岁) SBP(mmHg) DBP(mmHg) TC(mmo löL ) TG(mmo löL ) HDL 2C(mmo löL ) LDL 2C(mmo löL ) apoA(göL ) apoB(göL ) IL 26(pgöm l) 糖尿病肾病组 91 (40ö51) 57. 59±9. 72 132. 6±12. 6 85. 8±9. 1 5. 11±1. 253 1. 88±1. 093 1. 21±0. 32 2. 43±0. 92 1. 14±0. 23 1. 12±0. 34 352. 54±90. 473 糖尿病不伴肾病组 92 (42ö50) 56. 72±9. 98 132. 8±12. 7 83. 9±8. 3 4. 42±1. 01 1. 39±1. 02 1. 24±0. 36 2. 44±0. 91 1. 16±0. 25 1. 16±0. 32 310. 48±61. 46 对照组 105 (50ö55) 54. 27±10. 13 128. 2±9. 6 81. 4±8. 3 4. 22±0. 95 1. 14±0. 90 1. 25±0. 30 2. 36±0. 81 1. 17±0. 23 1. 07±0. 32 208. 53±49. 75 　　　与对照组比较, 3 P < 0. 01 表 2　糖尿病肾病组、糖尿病不伴肾病组和对照组 IL 26 (2572)基因多态性分布 (n , % ) 组　别 CC CG GG C G 对照组 (n= 105) 28 (26. 7) 52 (49. 5) 25 (23. 8) 108 (51. 4) 102 (48. 6) 糖尿病不伴肾病组 (n= 92) 25 (27. 2) 46 (50. 0) 25 (23. 8) 96 (52. 2) 88 (47. 8) 糖尿病肾病组 (n= 91) 12 (13. 2) 48 (52. 7) 31 (34. 1) 72 (39. 6) 110 (60. 4)ς 21 值 6. 235 0. 044 5. 530 0. 019ς 22 值 6. 528 0. 038 5. 862 0. 015 　　　ς21 为糖尿病肾病组与对照组比较; ς 22 为糖尿病肾病组与糖尿病不伴肾病组比较 表 3　糖尿病肾病组与对照组 IL 26 各基因型间 IL 26、血脂水平比较 (xθ±s) 组别 IL 26 (pgöm l) TC(mmo löL ) T G(mmo löL ) HDL 2C(mmo löL ) LDL 2C(mmo löL ) apoA(göL ) apoB(göL ) 糖尿病肾病组 CC (n= 12) 343. 03±86. 54 4. 71±1. 23 1. 87±1. 02 1. 23±0. 34 2. 41±0. 99 1. 15±0. 27 1. 14±0. 32 CG+ GG (n= 79) 361. 71±93. 423 5. 33±1. 243 1. 90±1. 07 1. 22±0. 35 2. 43±1. 05 1. 16±0. 29 1. 13±0. 35 对照组 CC (n= 28) 207. 96±48. 13 4. 21±0. 92 1. 13±0. 88 1. 25±0. 32 2. 35±0. 78 1. 16±0. 22 1. 06±0. 27 CG+ GG (n= 77) 209. 29±49. 97 4. 24±0. 97 1. 17±0. 92 1. 23±0. 33 2. 38±0. 82 1. 17±0. 23 1. 07±0. 33 　　　CC 与 CG+ GG 基因型间比较, 3 P < 0. 05 3　讨论 糖尿病肾病是糖尿病常见而又严重的并发症, 预 后较差, 发病机制十分复杂。大量研究证明, 遗传因 素、糖与脂质代谢紊乱、血流动力学、细胞因子等“共 同土壤”的长期作用是引起糖尿病肾病发生的主要原 因。 正常肾组织表达的某些因子对维持肾脏的结构 和功能起着十分重要的作用。病理情况下, 在某些刺 激因素作用下, 部分细胞因子使肾小球病理变化加 剧, 引起肾小球组织结构和功能的异常[ 7 ]。病理方面 ·308· 第5 期　　　　　陈军宁等: 白细胞介素26 基因型与桂北地区2 型糖尿病肾病相关性研究　　　　　第22 卷 表现为诱发和加重肾小球增生、肥大, 基质蛋白沉积, 系膜区扩展, 基膜增厚, 呈现糖尿病典型的肾小球硬 化征。 IL 26 是一种多功能的细胞因子, 由T 细胞、巨 噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞自发或诱发产生。IL 26 可以通过释放继发性细胞因子或活化宿主细胞免疫 直接或间接实现其效应, 在免疫系统、造血系统、神经 系统、肝脏代谢中均起重要作用。其在糖尿病肾病发 病过程中所起的作用已引起人们广泛重视。 IL 26 可 促进T、Β细胞过度激活和扩增, 加速细胞凋亡, 促进 胰岛 Β细胞的破坏[ 8, 9 ] , 促进肾脏系膜增殖。由此可 见, IL 26 可通过多途径调节免疫细胞功能, 造成胰岛 及肾脏病理损伤。 IL 26 基因位于第 7 号染色体短臂 上, 含有5 个外显子和4 个内含子, 在基因启动子区存 在- 572CöG 多态性, 这种基因多态性可影响 IL 26 基 因转录和表达, 并影响 IL 26 相关疾病的发生、发展和 转归。由于IL 26 在糖尿病肾病发病中有重要作用, IL 2 6 基因与糖尿病肾病关系也得到人们的关注, 但 IL 26 基因启动子区- 572CöG 多态性与糖尿病肾病之间 是否存在相关性, 是否通过影响血脂代谢、IL 26 的表 达而影响糖尿病肾病的病程等等, 目前尚不清楚。为 明确 IL 26 基因多态性与糖尿病肾病的关系, 笔者通 过对91 例糖尿病肾病患者及92 例糖尿病不伴肾病患 者和105 名正常人 IL 26 基因多态性分析, 发现糖尿病 肾病患者 IL 26 基因- 572CöG 多态性分布与糖尿病 不伴肾病组和正常人比较差异具有显著性 (P < 0105) , 其中携带G 等位基因个体患糖尿病肾病的风 险约是C 等位基因的 1. 618 倍 (OR = 1. 618, 95%C I: 1. 082～ 2. 418) , 提示G 等位基因可能是糖尿病肾病 的危险因素之一。为了进一步探讨 IL 26 基因多态性 与其血清水平的关系, 笔者检测了糖尿病肾病患者及 糖尿病不伴肾病患者和健康对照者 IL 26 血清水平, 结果发现糖尿病肾病患者及糖尿病不伴肾病患者 IL 2 6 血清水平显著高于健康对照者。同时笔者发现 IL 26 基因- 572CöG 多态性可影响其血清水平, 携带G 基 因型的糖尿病肾病患者血清 IL 26 水平显著高于不携 带者 (P < 0. 05) , 故认为: 在病理条件下, 携带G 基因 型的个体可促进 IL 26 的高度表达而增加糖尿病肾病 的发病风险。 综上所述, 糖尿病肾病是一种多因素参与的常见 病, 除环境因素影响之外, 遗传因素在其中也起着更 为重要的作用, 通过研究发现, IL 26 基因启动子区2 572CöG 多态性与 2 型糖尿病肾病具有相关性, 其中 G 等位基因可能是 2 型糖尿病肾病的遗传易感基因, 携带G 等位基因的个体可促进血清TC、IL 26 的高度 表达进而增加2 型糖尿病肾病的发病风险。但 IL 26 基 因多态性在 2 型糖尿病肾病发病中的确切机制尚不 清楚, 有待进一步研究。 参考文献: [1 ] GEOR GES J L , LOU KA C I V , PO IR IER O , et al. In terleuk in26 gene po lymo rph ism and suscep tib ility to m yocardial infarct ion: the ECT IM study[J ]. J M o lM ed, 2001, 79: 3002305. [2 ] O TA N , NA KA J IM A T , NA KA ZAWA I, et al. A nucleo tide varian t in the p romo ter region of the in terleuk in26 gene associated w ith decreased bone m ineral density[J ]. J H um Genet, 2001, 46: 2672272. [3 ] NAVA RRO J F,M ORA C. Ro le of inflamm ation in diabet ic comp licat ion [ J ]. N eph ro l D ial T ransp lan t, 2005, 20: 260122604. [ 4 ] 黎国伟. 细胞因子与糖尿病肾病[J ]. 国外医学: 内科学分 册, 2004, 31 (8) : 3342338. [ 5 ] 关欣, 郑红光. 细胞因子在糖尿病肾病发病中的作用[J ]. 中国实用内科杂志, 2005, 25 (3) : 268. [6 ] BRULL D J ,M ON T GOM ER Y H E, SAND ER S J , et a l. In terleuk in26 gene2174g > c and2572g > c p romo ter po lymo rph ism s are strong p redicto rs of p lasm a in terleuk in2 6 levels after co ronary artery bypass surgery[J ]. A rterio scler Th rom b V asc B io l, 2001, 21: 145821463. [ 7 ] 秦文敬. 糖尿病肾病患者与相关细胞因子水平的变化[J ]. 放射免疫杂志, 2005, 18 (3) : 1902191. [8 ] KAWAM O TO S, N IT TA Y, TA SH IRO F, et al. Supp ression of T h l cell act ivat ion and p reven tion of au to imm une diabetes in NOD m ice by local exp ression of rira l I[J ]. Imm uno l, 2002, 13 (5) : 6852694. [9 ] JULA B Z, H ECTOR F D. V itam in D and au to imm une diabetes[J ]. J Cell B iochem , 2003, 88 (2) : 2162222. (收稿日期: 2009- 08- 02) [责任编辑　王慧瑾　邓德灵 ] ·408· 第5 期　　　　　　　　　　　 　　　　　华　夏　医　学　　　　　　　　　　　　　　　 　第22 卷