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层析技术

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层析技术null第三章 层析技术第三章 层析技术层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性等)的不同,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中,当流动相流过固定相时,各组分以不同的速度移动,而达到分离的技术。 **南昌大学 生命科学学院第三章 层析技术第三章 层析技术本章内容: 第一节 概述 第二节 吸附层析 第三节 分配层析 第四节 凝胶过滤层析 第五节 离子交换层析 第六节 亲和层析 ...
层析技术
null第三章 层析技术第三章 层析技术层析技术是利用混合物中各组分的物理化学性质(分子的形状和大小、分子极性等)的不同,使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中,当流动相流过固定相时,各组分以不同的速度移动,而达到分离的技术。 **南昌大学 生命科学学院第三章 层析技术第三章 层析技术本章内容: 第一节 概述 第二节 吸附层析 第三节 分配层析 第四节 凝胶过滤层析 第五节 离子交换层析 第六节 亲和层析 第七节 聚焦层析 第八节 薄层层析 第九节 气相色谱 第十节 高效液相色谱 **南昌大学 生命科学学院第一节 概述第一节 概述层析法也称色谱法,是1906年俄国植物学家Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸附剂的柱子,各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开,由此得名为“色谱法”(Chromatography) 。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。 自1944年应用滤纸作为固定支持物的“纸层析”诞生以来,层析技术的发展越来越快。1950年以来,相继出现了气相层析,高压液相层析,薄层层析,薄膜层析,亲和层析,凝胶层析等。 层析技术操作简便,样品可多可少,既可用于实验室的研究工作,又可用于工业生产, 还可与其他分析仪器配合,组成各种自动分析仪器。 **南昌大学 生命科学学院第一节 概述第一节 概述基本原理: 层析系统都由两个相组成: 固定相,它或者是固体物质或者是固定于固体物质上的成分;固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂,凝胶,离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附,溶解,交换等作用。 流动相,即可以流动的物质。在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等,都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂,薄层层析时称为展层剂。 **南昌大学 生命科学学院null基本原理: 当待分离的混合物通过固定相时,由于各组份的理化性质存在差异,与两相发生相互作用(吸附、溶解、结合等)的能力不同,在两相中的分配(含量对比)不同,与固定相相互作用力越弱的组份,随流动相移动时受到的阻滞作用小,向前移动的速度快。 反之,与固定相相互作用越强的组份,向前移动速度越慢。分部收集流出液,可得到样品中所含的各单一组份,从而达到将各组份分离的目的。**南昌大学 生命科学学院null**南昌大学 生命科学学院第一节 概述第一节 概述层析技术的分类 :**南昌大学 生命科学学院第一节 概述第一节 概述层析技术的分类 : 按流动相的状态分类: 用液体作为流动相的称为液相层析,或称液相色谱; 以气体作为流动相的称为气相层析,或称气相色谱。 按固定相的使用形式分类:可分为柱层析(固定相填装在玻璃或不锈钢管中构成层析柱) 、纸层析、薄层层析、薄膜层析等。 按分离过程所主要依据的物理化学原理分类:可分为吸附层析、分配层析、离子交换层析、分子排阻层析、亲和层析等。本章后续主要按第三种分类进行叙述。 **南昌大学 生命科学学院第二节 吸附层析第二节 吸附层析吸附层析技术是近代生物化学最常用的方法之一。 它是利用混合物中各组分的物理性质的差别(如溶解度、吸附能力、分子形状和大小及分子极性等),使各组分随流动相通过由吸附剂组成的固定相时,由于吸附剂对不同物质的不同吸附力而使混合物分离的方法。根据操作方法不同,吸附层析又分为柱层析和薄层吸附层析两种。 吸附层析是应用最早的层析方法,由于吸附剂来源丰富、价格低廉、易再生、装置简单、灵活,又具有一定的分辨率等优点,至今仍广泛应用于各种天然化合物和生物发酵产品等初级产品的分离制备,如尿激酶、绒毛膜促性腺激素等粗品的制备。**南昌大学 生命科学学院第二节 吸附层析第二节 吸附层析凡能够将其它物质聚集到自己面上的物质,都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体。 吸附作用:固体内部的分子所受的分子间的作用力是对称的,而固体表面的分子所受的力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大,而表面向外的一面所受的作用力较小,因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的,故在一定的条件下,被吸附物可以离开吸附剂表面,这称为解吸作用。 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。**南昌大学 生命科学学院第二节 吸附层析第二节 吸附层析凡能够将其它物质聚集到自己表面上的物质,都称为吸附剂。能聚集于吸附剂表面的物质称为被吸附物。在吸附层析中应用的吸附剂一般为固体。 吸附作用:固体内部的分子所受的分子间的作用力是对称的,而固体表面的分子所受的力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大,而表面向外的一面所受的作用力较小,因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。 吸附剂与被吸附物分子之间的相互作用是由可逆的范德华力所引起的,故在一定的条件下,被吸附物可以离开吸附剂表面,这称为解吸作用。 吸附层析就是通过连续的吸附和解吸附完成的。**南昌大学 生命科学学院第二节 吸附层析第二节 吸附层析影响吸附的因素: 吸附剂的特性。 吸附现象发生在界面,因此吸附剂表面积愈大,吸附量愈多。吸附剂的这一特性,常用“比表面积”表示。比表面积指每克吸附剂所具有的表面积,例如活性炭的比表面积一般为300~500m3/g,有的甚至达到1000m3/g。 增加吸附剂表面积的方法有:将吸附剂磨碎成小的颗粒;通过处理使颗粒表面凹凸多变;使吸附剂成为凝胶状态;将吸附剂制成具有大量微孔的颗粒。 吸附物质的性质。 一般说来,极性吸附剂易吸附极性物质,非极性吸附剂易吸附非极性物质。**南昌大学 生命科学学院null影响吸附的因素: 吸附剂吸附条件 温度。吸附过程一般是放热的,所以只要达到了吸附平衡,升高温度会使吸附量降低。 pH。溶液的pH 往往会影响吸附剂或吸附物的解离情况,进而影响吸附量。对蛋白质或酶类等两性物质,一般在等电点附近吸附量最大。 吸附物的浓度。吸附达到平衡时,吸附物的浓度称为平衡浓度。一般规律是:吸附物平衡浓度愈大,吸附量也愈大。 盐的浓度。盐类对吸附作用的影响比较复杂,有些情况下盐能阻止吸附,所以,在低浓度盐溶液中吸附的蛋白质或酶常用高浓度盐溶液进行洗脱。但在某些情况下,盐能促进吸附,甚至有的吸附一定要在盐的存在下,才能对某种吸附物进行吸附。正是因为盐对不同物质的吸附有不同的影响,盐的浓度对于控制选择性吸附很重要,需要经过试验来确定合适的盐浓度。**南昌大学 生命科学学院第二节 吸附层析第二节 吸附层析一、吸附柱层析 将吸附剂填装在玻璃或不锈钢管中,构成层析柱,层析时欲分离的样品自柱顶加入,当样品溶液全部流入吸附层析柱后,再加入溶剂冲洗。冲洗的过程称为洗脱,加入的溶剂称为洗脱剂。**南昌大学 生命科学学院null*南昌大学 生命科学学院*null将在洗脱过程中,柱内不断地发生解吸、吸附,再解吸、再吸附的过程。即被吸附的物质被溶剂解吸而随溶剂向下移动,又遇到新的吸附剂颗粒被再吸附,后面流下的溶剂又再解吸而使其下移动。经过一段时间以后,该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同 ,移动速度也不同。吸附力弱而解吸力强的物质,移动速度就较快。 经过适当的时间以后,不同的物质各自形成区带,如果被分离的是有色物质的话,就可以清楚地看到色带(色层)。 如果被吸附的物质没有颜色,可用适当的显色剂或紫外光观察定位,也可用溶剂将被吸附物从吸附柱洗脱出来,再用适当的显色剂或紫外光检测,以洗脱液体积对被洗脱物质浓度作图,可得到洗脱曲线。 吸附柱层析成败的关键是选择合适的吸附剂、洗脱剂和操作方式。 *南昌大学 生命科学学院*第二节 吸附层析第二节 吸附层析一、吸附柱层析 1. 层析柱 柱层析是利用玻璃柱装填固定相的一类层析方法。柱层析所用的玻璃柱,是一根适当尺寸的细长玻璃管,一般层析柱径高比为1∶ 10~1∶40,可根据实际需要选择。下端封闭只留下一个细的出口管。在柱的底部要铺垫细孔尼龙网、玻璃棉、垂熔滤板或其他适当细孔滤器,使装入柱内的固定相不致流失。 2. 吸附剂 吸附剂的性质与选择是吸附层析法的关键。如果选择得当,分离常可顺利进行,否则就不易分离。作为吸附层所用的吸附剂种类很多,一般分为无机和有机两大类,以无机吸附剂最常用。 常用有机吸附剂有:淀粉、纤维素、聚酰胺凝胶、大孔吸附树脂等。其中大孔吸附树脂和聚酰胺近年用于中药活性成分的分离。**南昌大学 生命科学学院null2. 吸附剂 常用的无机吸附剂有极性的和非极性的两种。羟基磷灰石、硅胶、氧化铝和人造沸石属前者,活性炭属后者。在实践中不论选择那种类型的吸附剂,都应具备表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强和成本低廉等性能。 羟基磷灰石(简称HA)的吸附容量高,稳定性好(在T<85℃,pH5.5-10.0均可使用),因此在制备及纯化蛋白质、酶、核酸、病毒和其它生命物质方面得到了广泛的应用。 HA的Ca2+基团和生物分子表面的负电荷基团的相互反应,在用HA分离生物分子过程中起着重要作用。 硅胶具有微酸性,适用于分离酸性和中性物质,如有机酸、氨基酸、甾体等。其硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 氧化铝分酸性、碱性和中性三种,分别适用于不同酸碱性的化合物。*南昌大学 生命科学学院*null2. 吸附剂 上述吸附剂中,一般常用亲水性吸附剂。氧化铝、硅胶和硅藻土等是亲水性的,含水量越低,其活性越高,吸附能力也越强,所以在使用前可酌情除水活化。这类吸附剂对样品中亲水性强的组分具有较强的吸附作用和分离能力,可反复使用20次。硅藻土在国内外普遍用于尿激酶粗品的制备。 在选择具体吸附剂时,主要是根据吸附剂本身和被吸附物质的理化性质进行的。一般来说, 极性强的吸附剂易吸附极性强的物质,非极性的吸附剂易吸附非极性的物质。但是为了便于解吸附,对于极性大的分离物,应选择极性小的吸附剂,反之亦然。理想的吸附剂必需经过多次试验才能获得。*南昌大学 生命科学学院*null3. 洗脱剂 洗脱剂指的是溶解被吸附样品和平衡固定相的溶剂。合适的洗脱剂应符合下列条件: 纯度较高;稳定性好;能较完全洗脱所分离的成分;黏度小;易和所需要的成分分开。 洗脱剂可根据分离物中各成分的极性、溶解度和吸附剂的活性来选择。一般蛋白质或核酸被极性强的羟基磷灰石吸附后,要用含有盐的缓冲液洗脱。而甾体或色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后,则可用有机溶剂洗脱。所用洗脱剂的浓度大小和极性强弱的选择,需通过试验确定。 在实践中,选择洗脱剂的顺序是由极性小到极性大(正向层析)。当把极性小的洗脱剂换成极性大的时,宜先将极性大的和极性小的洗脱剂混合使用,浓度则由低到高。总之,选用洗脱剂的原则是能较完全地洗脱所要分离的成分,并力求用量少、洗脱时间短。*南昌大学 生命科学学院*第二节 吸附层析第二节 吸附层析一、吸附柱层析 4. 操作 柱层析的设备主要有层析柱、部分收集器、磁力搅拌器和恒流泵。有条件时,配置一台检测仪和一台仪就构成一个完整的层析系统。 层析柱 采用极细吸附剂装柱时,宜用比例大的层析柱。反之,则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积是由吸附剂的量和膨胀度决定的。 吸附剂的用量 吸附剂的用量是根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。当操作容量高时, 吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30-50倍。若样品中各成分的性质相似难以分开时,则吸附剂用量应增大,有时大于样品的100倍 。**南昌大学 生命科学学院null4. 操作 装柱 装柱前要先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装法和湿装法两种。 干装法系直接加吸附剂到柱中,然后倒入溶剂。此法不易将气泡排尽。 湿装法系先加适量溶剂到柱内, 排走其中的空气,然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀,随即将此悬浮液连续倾入柱中,待其自然沉降至柱高的1/4-1/3时打开柱下端口,让溶剂慢慢流出,使柱上端悬浮液徐徐下降至需要的高度。吸附剂表面要平整,应使其一直浸没在溶剂中,严防气泡产生。这种装柱法对各种基质都适用。 装好的层析柱应立即与洗脱剂连接,在一定的操作压下(贮液器内液面与层析柱出口之间的压力差),控制其流速,让2-3倍柱体积的洗脱剂流过固定相,使其达到平衡,也使固定相高度恒定或离子强度与洗脱剂一致。此时层析柱中基质应合乎填装均匀、松紧一致和没有气泡的。*南昌大学 生命科学学院*null4. 操作 上样和洗脱 经过平衡的层析柱,当平衡液流到与固定相表面一致位置时,用滴管轻轻地把样品溶液加到固定相表面,要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(当加入的样品量相同时,体积越小越有利于提高分辨率)。 待样品液的液面流到固定相表面时,用滴管加入洗脱剂(其体积用液面距固定相表面的高度约5厘米计),并在柱上端与装有洗脱剂的贮液瓶连接开始冼脱。同时在柱下端与部分收集器接通,立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。 随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果,即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标,以每管溶液中样品的浓度或活性为纵坐标,有合适的检测器和记录仪时,洗脱液流经检测器再收集,用记录仪可自动绘制洗脱曲线)。*南昌大学 生命科学学院*null**南昌大学 生命科学学院 理想的洗脱曲线如图3-1所示。图中的A峰和B峰均呈对称形,二者没有重叠,这表明样品液中的组分已完全分开。层析峰的面积(FEG)、峰高(BE)和半峰高宽度(HI)等参数是定性、定量洗脱物的依据。第二节 吸附层析第二节 吸附层析一、吸附柱层析 注意: 为了获得满意的分离结果,洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快,洗脱物在两相中的平衡过程不完全;如果太慢,洗脱物会扩散。 若峰与峰之间有重叠,宜降低洗脱剂的强度,若峰间距离过大,或某些成分不能洗脱时,宜加大洗脱剂的强度(极性),成分复杂时,可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法见离子交换层析)。 由层析柱分离出的样品经浓缩或冻干处理后,可进行纯度测定。如杂质含量仍大时,应该用其它方法继续纯化。 **南昌大学 生命科学学院第二节 吸附层析第二节 吸附层析二、聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜(尼龙薄膜)层析是指样品溶液随流动相通过聚酰胺薄膜时,由于聚酰胺与各极性分子产生氢键吸附能力的不同,而将各组分分离的方法。 聚酰胺是由己二酸与己二胺聚合而成或由己内酰胺聚合而成的高分子化合物。含有大量酰胺基团,其羰基可与含羟基的物质形成氢键,其亚氨基又可与硝基化合物或醌类形成氢键,而产生吸附作用。不同的物质由于形成氢键的能力不同,故吸附力也不同,通过吸附和洗脱就可达到分离目的。**南昌大学 生命科学学院null二、聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜层析只适用于极性分子的分离。如,酚类、醌类、硝基化合物、氨基酸及其衍生物、核酸类物质等。特别是在蛋白质的化学结构分析中,氨基酸衍生物,如DNS(二甲氨基苯磺酰)-氨基酸、DNP(二硝基苯)-氨基酸等的分析,灵敏度高,分辨力强,操作方便,速度较快。 洗脱时,洗脱剂取代被吸附物与聚酰胺形成氢键,而使被吸附物解吸。 各种化合物与聚酰胺形成氢键的能力主要由物质的分子结构所决定。此外也与所使用的溶液有关。一般用水作溶剂时形成氢键的能力最强,故容易吸附,难于洗脱。在有机溶剂中形成氢键的能力较弱,在碱性溶液中形成氢键的能力最弱,所以洗脱剂最好选用碱性溶液,如二甲基甲酰胺(DMF)溶液、稀氢氧化钠溶液或稀氨水等。 *南昌大学 生命科学学院*第三节 分配层析第三节 分配层析分配层析是利用混合物中各组分在两相中分配系数不同而达到分离目的的层析技术,相当于一种连续性的溶剂抽提方法。 分配系数(K)是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时,该溶质在两相溶剂中的浓度比值: 分配系数与溶剂和溶质的性质有关,同时受温度、压力的影响。所以不同物质的分配系数不同。而在恒温恒压条件下,某物质在确定的层析系统中的分配系数为一常数。 分配系数小的溶质在流动相中的分配的数量多,移动快;分配系数大的溶质在固定相分配的数量多,移动慢。因此可彼此分开。**南昌大学 生命科学学院第三节 分配层析第三节 分配层析在分配层析中,通常用多孔性固体支持物如滤纸、硅胶等吸着一种溶剂作为固定相,另一种与固定相溶剂互不相溶的溶剂沿固定相流动构成流动相,某溶质在流动相的带动下流经固定相时,会在两相间进行连续的动态分配。**南昌大学 生命科学学院当样品中含有多种分配系数各不相同的组分时,分配系数越小的组分,随流动相迁移的越快。两个组分的分配系数差别越大,在两相中分配的 次数越多,越容易被彻底分离。第三节 分配层析第三节 分配层析分配层析的种类: 纸层析属于典型的分配层析,且系统简单,使用方便,在生物化学的发展中发挥过极其重要的作用。本节主要通过纸层析介绍分配层析的基本知识。 将硅胶、硅藻土等铺在玻璃或金属板上进行层析可构成薄层层析系统,由于薄层层析还可做吸附、离子交换等层析,将在本章第七节专门叙述。 在硅藻土上吸附或化学键合一定的溶剂,装到层析柱上,以气体为流动相可构成气液分配层析,即气相色谱系统。 在硅胶等固体材料上吸附或化学键合一定的溶剂,装到层析柱中,用一定的洗脱剂洗脱, 可构成液液分配层析,这种系统在高效液相色谱中应用普遍。 气相色谱和高效液相色谱系统复杂,将在本章第九节和第十章专门介绍。 **南昌大学 生命科学学院第三节 分配层析第三节 分配层析纸层析 滤纸一般能吸收22%-25%的水,其中6%-7%的水是以氢键与滤纸纤维上的羟基结合,一般情况下较难脱去。纸上层析实际上是以滤纸纤维的结合水为固定相,而以有机溶剂(与水不相混溶或部分混溶)作为流动相。展开时,有机溶剂在滤纸上流动,样品中各物质在两相之间不断地进行分配。由于各物质有不同的分配系数,移动速度因此不同,从而达到分离目的。 溶质在滤纸上移动的速率可用Rf值表示: Rf = a/ b 式中a:溶质斑点中心的移动距离;b:溶剂前沿移动的距离 Rf值决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下,两相体积比是一常数,所以Rf值决定于分配系数。不同物质的分配系数不同, Rf值也不相同,由此可以根据Rf值的大小对物质进行定性分析。 **南昌大学 生命科学学院null纸层析 影响Rf值的主要因素: 物质的结构和极性 物质的结构和分子极性是影响Rf值的主要因素。极性较大的物质,在水中的溶解度较大,其Rf值就较小,反之亦然。 滤纸 不同滤纸的厚薄程度和纤维松紧度各不相同,因此结合的水量不一样,两相的体积比也就不同。所以同一种物质在不同型号的滤纸上进行层析时,所得到的Rf值也不相同。 此外,滤纸上所含的杂质也会影响Rf值,必要时要进行预处理,以去除杂质的影响。层析滤纸由高纯度的棉花制成。质地均一,厚薄一致,纤维松紧度适中,具有一定的机械强度,并具有一定的纯度。*南昌大学 生命科学学院*null纸层析 影响Rf值的主要因素: 层析所用的溶剂 同一物质在不同的溶剂系统中进行层析时, Rf值不同。所以溶剂的配制和使用必须严格,才能使Rf值的重现性好。在好的溶剂系统中被分离物质的Rf值应在0.05-0.85之间,样品中被分离组分的Rf之差最好大于0.05。 pH值 溶剂和样品的pH值会影响物质的解离,从而影响物质的极性和溶解度,使Rf值改变。溶剂的酸碱度增大则流动相的含水量增高,使极性物质的Rf值增加;反之则降低。 为了避免或减少pH值对Rf值的影响,可将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理,使之保持一定的Rf值,通过调节溶剂或样品溶液的pH值,使pH值保持恒定。*南昌大学 生命科学学院*null纸层析 影响Rf值的主要因素: 温度 温度能影响物质在两相中的溶解度,即影响分配系数;也影响滤纸纤维的水合作用,即影响固定相的体积;同时在多元溶剂系统中,温度显著地影响溶剂系统的含水量,即影响流动相的组分比例。所以温度的改变使Rf值变化很大,为此,层析必须在恒温条件下进行。 展开方式 同一物质在其他层析条件完全相同的情况下,用不同的展开方式进行层析时,所得到的Rf值不相同。用下行法展开时, Rf值较大;用上行法展开时, Rf值较小;用圆形滤纸层析时,由于内圈较外圈小,限制了溶剂的流动, Rf值也较小。 样品溶液中杂质。样品溶液中存在杂质时,有时对Rf值有所影响。例如:氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。 *南昌大学 生命科学学院*第三节 分配层析第三节 分配层析纸层析 操作方法: 样品处理 。 用作纸层析的样品,应尽可能除杂纯化。调节到一定的pH值,浓度太低的可用真空浓缩提高浓度,浓度太高则需稀释。 点样 。 点样一般采用少量多次,每点一次必须用冷风吹干,然后再点第二次。每次点样的位置应完全重合,否则会出现斑点畸形现象。 平衡。 点样以后展开以前先将滤纸与层析缸用配好的溶液系统的蒸汽来饱和,这个过程称之为“平衡”。若不经平衡,滤纸和层析缸未被溶剂蒸汽饱和,在层析过程中,滤纸会从溶剂中吸收水分,溶剂也会从滤纸表面挥发,从而改变溶剂系统的组成,严重时纸上会出现不同水平的溶剂前沿,严重影响层析效果。平衡一般在密闭的层析缸内进行。**南昌大学 生命科学学院null操作方法: 展开 平衡结束后,将滤纸靠样品点的一端浸入溶剂中开始展开。当溶剂前沿快到达滤纸另一端时,展开结束。按溶剂在滤纸上流动的方向不同分为以下几种方式: 上行法:将滤纸点样的一端向下浸入溶剂中,溶剂因毛细管引力的作用从下向上流动。 上行法操作简单,重现性好,是最常用的展开方法,但展开时间较长。 下行法:在层析缸上部有一盛展开剂的液槽,将滤纸点样的一端朝上浸入槽中,溶剂主要靠重力作用自上而下流动。下行法展开速度快,但Rf值的重现性较差,斑点易扩散。 环行法:又称水平法,样品点于圆形滤纸距圆心1cm左右的环形线(原线)上。 双向展开法:如果样品组分较多,用一种溶剂系统(常为酸性)不能将各组分全部分开时,可将样品点在方形滤纸的一角,用一种溶剂系统展开后吹干溶剂,将滤纸转动90度后再用另一种溶剂系统(常为碱性)展开,这称为“双向展开法”。 *南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*null操作方法: 显色。为了显示层析斑点位置,可根据物质的性质不同,采用显色剂显示或紫外光显示。 显色剂显示: 被分离物质与显色剂生成有颜色的化合物,显示斑点位置。常用喷雾法 、浸渍法或涂刷法。 紫外光显示:有些物质有紫外光吸收性质,有些物质受紫外光照射会发出荧光,所以可在紫外光照射下观察到被分离物质的斑点。 定性分析。层析后的斑点显示出来后,计算出各斑点的Rf值,就可以对物质进行定性。 定量分析。对被分离的物质进行定量的方法很多,常用的有: 剪洗比色法:将斑点剪下,用适当的溶剂洗脱后,通过分光光度计进行比色定量。 直接比色法:用特制的分光光度计直接测量滤纸上斑点颜色的浓度,画出曲线,由曲线所包含的面积可求出待测物的含量。 面积测量法:实验证明,圆形或椭圆形斑点的面积与物质含量的对数成正比。所以,可用测量斑点面积的方法求得物质的含量。*南昌大学 生命科学学院*第四节 凝胶过滤层析第四节 凝胶过滤层析 凝胶层析,又称为凝胶过滤、分子排阻层析或分子筛层析。是以各种凝胶为固定相,利用流动相中所含各物质的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。 其设备简单,操作方便,不需要再生处理即可反复使用,适用于不同相对分子质量的各种物质的分离,已广泛地用于生物化学、生物工程和工业、医药等领域。*南昌大学 生命科学学院*第四节 凝胶过滤层析第四节 凝胶过滤层析*南昌大学 生命科学学院*基本原理: 当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时,大分子物质由于分子直径大,不易进入凝胶颗粒的微孔,沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度 流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中,向下移动的速度较慢,从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱,而达到分离的目的。null*南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*第四节 凝胶过滤层析第四节 凝胶过滤层析基本原理: 样品中各组分的流出顺序,可用分配系统Ka来量度: Ka=(Ve-Vo)/Vi Ve:为洗脱体积,表示某一组分从层析柱洗出到最高峰出现时,所需的洗脱液体积; Vo:外体积,为层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积; Vi:内体积,为层析柱内凝胶颗粒内部微孔的体积。 当某组分的Ka=0时(即Ve=Vo),说明该组分完全不进入凝胶颗粒微孔,洗脱时最先流出; 若某组分的Ka=1(即Ve=Vo+Vi)时,说明该组分可自由地扩散进入凝胶颗粒内部的微孔中,洗脱时,最后流出; Ka在0-1之间的组分,洗脱时Ka值小的先流出 ,Ka值大的后流出。 *南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*基本原理: 内体积Vi可以从凝胶的干重和吸足水后的湿重求得,也可用小分子物质(如NaCl等)实际测量而得到(Vo+Vi) 。 外体积Vo可用相对分子质量很大的物质溶液(如血红蛋白、印度黑墨水、相对分子质量为200万的蓝色葡聚糖-2000、铁蛋白等)通过实际测量求出。也可从下式间接计算: Vo = Vt –Vi -Vg Vg:凝胶基质本身的体积;Vi:内体积;Vt:层析柱内凝胶床的总体积。 Vt可通过测量柱内径和凝胶床高度计算出来,即 Vt = 0.25πR2h 洗脱体积Ve可通过加进某一组分后实际测量而得,也可以在已知Ka后计算出来。即 Ve = Vo + KaVi null*南昌大学 生命科学学院*基本原理: 在一般情况下,凝胶对组分没有吸附作用。当洗脱液的体积等于Vo+Vi时,所有组分都应该被洗脱出来,即Ka的最大值为1。然而在某种情况下Ka值会大于1。这种反常现象说明这一层析过程不是单纯的凝胶层析,其中可能还夹杂有吸附或离子交换等过程。 对于同一类型的化合物而言,组分的洗脱体积Ve与相对分子质量(Mr)的关系可用下式表示: Ve = K1- K2lgMr K1,K2为常数。 第四节 凝胶过滤层析第四节 凝胶过滤层析凝胶的选择: 凝胶的种类很多,其共同特点是内部具有微细的多孔网状结构,其孔径的大小与被分离物质的相对分子质量大小有相应的关系。常用的有: 聚丙烯酰胺凝胶 是一种人工合成凝胶,由丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺共聚而成。 商品名称为生物胶P(Bio-Ge1P)。聚丙烯酰胺凝胶是完全惰性的,适宜于各种蛋白质、核苷及核苷酸等的分离纯化。缺点是遇强酸时酰胺键会水解,一般在pH2-11的范围内使用。 *南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*凝胶的选择: 葡聚糖凝胶 由相对分子质量为4×104~20×104的葡聚糖交联聚合而成。由Pharmacia (GE)公司生产的商品名为Sephadex的葡聚糖凝胶,具有良好的化学稳定性等优点,为最常用的凝胶之一。 Sephadex耐碱,在0.01mol/L盐酸中放置半年不受影响,故广泛用于各种物质的分离纯化。 Sephadex有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、等多种型号、和粗、中、细、超细多种规格。 G后面的数字越大,胶粒内的孔经越大,越适合于大分子的分离,但颗粒的机械强度随孔经的增大而降低,较高的操作压会使G75、G100、G150、G200等颗粒变形而使洗脱液的流速下降,故用上述型号的Sephadex进行层析时,流速慢,时间长。同型号的Sephadex,颗粒越细,在同样柱长的柱子中分辨力越好,但流速也越慢。 null*南昌大学 生命科学学院*凝胶的选择: 琼脂糖凝胶 从琼脂中除去带电荷的琼脂胶,可制成不带电荷的琼脂糖,商品为Sepharose。Sepharose的孔经大,机械强度好,层析时流速较快,但只能分离相对分子质量较大的分子。 聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶 商品名Sephacryl,是由甲撑双丙烯酰胺交联丙烯葡聚糖形成的球形凝胶颗粒,反压特别低,机械性能好,分离速度快,分辨率高,理化稳定性好,在SDS、6mol/L盐酸胍及8mol/L尿素中均可使用。 Superdex Pharmarcia公司提供的新型凝胶过滤介质,是将葡聚糖共价结合到交联多孔琼脂糖珠体上制成的球形凝胶珠,流速快、反压低、非特异性吸附很低,因而样品回收率很高,理化稳定性很高,是目前分辨率和选择性最好的凝胶过滤介质。第四节 凝胶过滤层析第四节 凝胶过滤层析凝胶过滤在试验室中的应用: 生物大分子物质的分离纯化 分子量的测定 分级分离 溶液浓缩 平衡常数的测定 细胞及颗粒的分离 若以组分的洗脱体积(Ve)对组分相对分子质量的对数(lgMr)作图,可得一曲线,其中主要部分成直线关系。以此为标准曲线,可以通过测定某一未知组分的洗脱体积,而从标准曲线中查得其相对分子质量。*南昌大学 生命科学学院*第五节 离子交换层析第五节 离子交换层析离子交换层析是在以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的。此法广泛应用于很多生化物质(例如氨基酸、多肽、蛋白质、糖类、核苷和有机酸等)的分析、制备、纯化,以及溶液的中和、脱色等方面。 1. 基本原理 : 离子交换剂是由基质、电荷基团(或功能基团)和反离子构成的,基质与电荷基因以共价键连接,电荷基因与反离子以离子键结合。 离子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以离子交换方式进行,假设以RA+代表阳离子交换剂,其中A+为反离子,A+能够与溶液中的阳离子B+发生可逆的交换反应,反应式为:RA++B+ RB++A+ 。null1. 基本原理 : 离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力,这种结合力的大小是由离子交换剂的选择性决定的。 强酸性(阳性)离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小;强碱性(阴性)离子交换剂对OH -的结合力比对Cl-的小得多;弱酸性离子交换剂对H+的结合力远比对Na+的大;弱碱性离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-的大。 因此,在应用离子交换剂时,采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因子之一。离子交换剂与各种水合离子(离子在水溶液中发生水化作用形成的)的结合力与离子的电荷量成正比,而与水合离子半径的平方成反比。 所以,离子价数越高,结合力越大。在离子间电荷相同时,则离子的原子序数越高,水合离子半径越小,结合力亦越大。null1. 基本原理 : 两性离子如蛋白质、酶类、多肽和核苷酸等物质与离子交换剂的结合力,主要取决于它们的物理化学性质和在特定pH条件下呈现的离子状态。当pH低于pI时,它们带正电荷能与阳离子交换剂结合;反之,它们带负电荷能与阴离子交换剂结合 。pH与pI的差值越大,带电量越大,与交换剂的结合力越强。 离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分开,主要依据是离子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力。null1. 基本原理 : 离子交换过程由五个不同步骤组成: 离子扩散到交换剂的表面。在均匀的溶液中这个过程是非常快的。 离子通过交换剂扩散到交换位置。这由交换剂的交联度和溶液的浓度所决定。这个过程被认为是控制整个离子交换反应的关键。 在交换位置上进行离子交换。这被认为是瞬间发生的,并且是一个平衡过程。被交换的分子所带的电荷越多,它与交换剂的结合也就越紧密,被其他离子的取代也就越困难。 被交换的离子通过交换剂扩散到表面。 用洗脱液洗脱,被交换的离子扩散到外部溶液中。*南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*氨基酸的分离过程null1. 基本原理 : 离子交换反应是可逆的,一般都遵循化学平衡的规律。 吸附过程是由于一定量的混合物通过层析柱时,混合物的离子不断被交换,其浓度逐渐减少,因而可全部或大部分被交换而吸附在介质上。 洗脱过程是由于连续添加新的交换溶液,交换平衡不断地朝正反应方向移动,直至完全,因而可以把离子交换剂上的离子全部或大部分洗脱下来。*南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*第五节 离子交换层析第五节 离子交换层析*南昌大学 生命科学学院*2. 离子交换剂 离子交换剂应满足的基本条件有: 有高度的不溶性。即在各种溶剂中不发生溶解; 有疏松的多孔结构或巨大的表面积,使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换; 有较多的交换基团; 有稳定的物理化学性质。在使用过程中,不因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。 离子交换剂的种类 根据离子交换剂中基质的组成和性质,可将其分成疏水性离子交换剂和亲水型离子交换剂。 null离子交换剂的种类 疏水性离子交换剂 疏水性离子交换剂中的基质是人工合成的、与水结合力较小的树脂。在树脂中可以共价键引入不同的电荷基团。离子交换树脂以电荷基团的性质分则有:阳离子交换树脂、阴离子交换树脂(分别包括强、中、弱三种电荷基团)和螯合离子交换树脂(对金属离子有较强的选择性)。 阳离子交换剂。其电荷基团带负电,反离子带正电。因此,可以与溶液中的正电荷化合物或阳离子进行交换反应。 阴离子交换剂。其是在树脂中分别引入季胺、叔胺、仲胺和伯胺基团构成的。当引入季胺和叔胺基团时,分别为强阴性和中强阴性离子交换剂。当引入仲胺和伯胺基团时,为弱阴性离子交换剂。 *南昌大学 生命科学学院*null离子交换剂的种类 疏水性离子交换剂 疏水性树脂型离子交换剂一般都呈网络结构的珠状体,其大小在20-50目之间。近年Bio-Rad公司还制造了50-100目、100-200目以及200-400目的产品,目数大的树脂对提高分辨率和交换容量是有利的。 疏水性的离子交换剂由于含有大量的活性基团,交换容量高、机械强度大、流动速度快。因此,主要用于: 分离无机离子、有机酸、核苷、核苷酸和氨基酸等小分子物质。 从蛋白质溶液中除去表面活性剂(如十二烷基硫酸钠)、清洁剂(如tritonX-100)、尿素、两性电解质(Ampholyte)。 分离某些不易变性的蛋白质。*南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*疏水性的离子交换剂对带电荷多和疏水性强的被分离物有较强的截留能力。阳离子交换树脂对氨基酸的分离null离子交换剂的种类 亲水性离子交换剂 这类交换剂与水的亲和力较大,载体孔径大,适合于分离生物大分子,有多种类型: 纤维素离子交换型 以纤维素为基质,常用的功能基因有磷酸基、磺酸乙基、等,可制成纤维状、微粒、短纤维、球形四种类型。 葡聚糖系离子交换剂 以Sephadex G25和G50为基质,分别引入DEAE等功能基团。交换容量较离子交换纤维素大,除离子交换作用外,还有分子筛作用。 此外还有琼脂糖系列离子交换剂等离子交换剂。*南昌大学 生命科学学院*第五节 离子交换层析第五节 离子交换层析*南昌大学 生命科学学院*2. 离子交换剂 离子交换剂的选择: 任何一种离子交换剂都不可能适用于分离所有的样品。因此,选择理想的离子交换剂是提高有效成分的得率和分辨率的一个重要环节。 阴、阳离子交换剂的选择。如果被分离物质带正电荷,应选择阳离子交换剂;如果被分离物质带负电荷,则应选择阴离子交换剂;如果被分离物质为两性离子,要按照其稳定状态的净电荷来选择交换剂。 强、弱离子交换剂的选择。一般来说,强离子交换剂适用的pH范围很广。所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。而弱性离子交换剂适用的pH范围较窄,在pH为中性的溶液中交换容量也高,用于分离生物大分子物质时,其活性不易丧失。所以,分离生物样品多采用弱离子交换剂。null2. 离子交换剂 离子交换剂的选择: 任何反离子的选择。离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。为了提高交换容量,一般应选择结合力较小的反离子。所此,强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和OH型;弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和Cl型。 基质的选择。脂基质是疏水性化合物,而纤维素、葡聚糖和琼脂糖基质则是亲水性化合物。在分离生物大分子时,亲水性基质交换容量高,且对生物大分子物质的吸附和洗脱都比较温和,被分离物质活性不易受到破坏。 要恰当地选择离子交换剂,必须对被分离物的性质和所处溶液组分及酸碱度等因素进行全面分析 。综合考虑上述4个方面,选择的离子交换剂才能成功地分离样品。 *南昌大学 生命科学学院*第五节 离子交换层析第五节 离子交换层析*南昌大学 生命科学学院*3. 操作 3.1. 离子交换剂的处理、再生和转型 离子交换剂的处理:取适量的固体离子交换剂先用水浸泡,待充分膨胀后加大量的水悬浮除去细颗粒,再改用酸碱浸泡,以便除去杂质和使其带上需要的反离子。酸碱处理的次序决定了离子交换剂携带反离子的类型。在每次用酸(或碱)处理后,均应先用水洗涤至近中性,再用碱(或酸)处理。最后用水洗涤至中性,经缓冲液平衡后即可使用或装柱。 使用过的离子交换剂,可采用一定的方法使其恢复原来的性状,这一过程叫做再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成,但有时也可以通过转型处理完成。 转型是指离子交换剂由一种反离子转为另一种反离子的过程。如,欲使阳离子交换剂转成钠型时,则需用NaOH处理;欲使其转成氢型时,则需用HCl处理;欲使其带铵离子时,则需用NH4+OH或NH4+Cl处理。null3. 操作 3.2. 缓冲液的选择 离子交换剂不仅可以与被分离物进行交换,而且还可以与缓冲液中的离子进行交换。因此,离子交换剂吸附被分离物的量与缓冲液的pH值和离子浓度有密切关系。 起始缓冲液pH值和离子强度要能使样品中有效成分与离子交换剂结合,而杂质与交换剂不结合,则pH值一般比有效成分的pI高一个单位(用阴离子交换剂)或低一个单位(用阳离子交换剂),离子强度为0.1时,就可很快地把有效成分与杂质分开。 或者选择起始缓冲液的离子强度和pH值,使有效成分与离子交换剂结合得不牢固,而杂质与离子交换剂结合得牢固,也能得到高纯度有效成分。 选用的洗脱液,其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来,一般离子强度要比起始缓冲液高,pH值要按离子交换剂性质来选择。 *南昌大学 生命科学学院*null3. 操作 3.3. 被分离物质的交换 使用离子交换剂的方法有两种: 一种是柱层析法,也叫动态法,即将离子交换剂装入层析柱内,让溶液连续通过。该法交换效率高,应用范围广; 一种是分批法,也叫静态法,即将离子交换剂置入盛溶液的容器内缓慢地搅拌。该法交换率低,不能连续进行,但是,需要的设备简单,操作容易。 柱层析法装柱的操作和要求与吸附柱层析相同。离子交换剂的总用量要依据其交换容量和待吸附物质的总量(包括连续使用的全部量)来计算。当溶液含有各种杂质时,必须考虑使交换量留有充分余地,实际交换量只能按理论交换量的25%-50%计算。在样品纯度极低,或有效成分与杂质的性质相似时,则实际交换量应控制得更低些。层析柱高与直径比例一般要大于10∶1,分离样品的成分复杂时,比例宜高一些,用于样品浓缩和脱盐时,比例可低一些。 *南昌大学 生命科学学院*null3. 操作 3.4.分离物质的洗脱与收集 在离子交换层析过程中,常用梯度溶液进行洗脱,而溶液的梯度则是由盐浓度或酸碱度的变化形成的。 梯度溶液按组成来分,一般有二种: 一种是增加离子强度的梯度溶液。是用一简单的盐(如NaCl或KCl)溶解于稀缓冲液制成的,习惯上不用弱酸或弱碱的盐类; 一种是改变pH值的梯度溶液。该溶液是用两种不同pH值或不同缓冲容量的缓冲液制成的,所用缓冲液的种类、pH值以及缓冲容量要认真选择,否则将达不到预期目的。 对于增加离子强度的梯度溶液,不管用于何种类型的离子交换剂,其离子强度绝大部分是增加的。而改变pH值的梯度溶液则不然,如果使用的是阳离子交换剂,pH值应从低到高递增;如果使用的是阴离子交换剂,pH值应从高到低递减,实际许可的pH值范围由待分离物质的稳定pH范围和离子交换剂限制的pH范围来决定。 *南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*梯度的形成 可以借助梯度混合器第六节 亲和层析第六节 亲和层析*南昌大学 生命科学学院*亲和层析是利用生物分子间所具有的专一而又可逆的亲和力而使生物分子分离纯化的层析技术。 基本原理: 具有专一而又可逆的亲和力的生物分子是成对互配的。主要有:酶和底物、酶与竞争性抑制剂、酶和辅酶、抗原与抗体、DNA和RNA、激素和其受体、DNA与结合蛋白等。 在成对互配的生物分子中,可把任何一方作为固定相,而对样品溶液中的另一方分子进行亲和层析,达到分离纯化目的。例如,酶与其辅酶是成对互配的,既可把辅酶作为固定相,使样品中的酶分离纯化,也可把酶作为固定相,使样品中的辅酶分离纯化。 null*南昌大学 生命科学学院*null*南昌大学 生命科学学院*亲和层析 原理示意图第六节 亲和层析第六节 亲和层析*南昌大学 生命科学学院*亲和层析的特点 纯化效率极高:亲和层析由于配体与待分离物质进行特异性结合,所以分离提纯的效率极高,提纯度可达几千倍 。 优点:设备要求不高,操作简便,适用范围广,特异性强,分离速度快,效果好,条件温和。 缺点:通用性较差,洗脱条件要求苛刻。 亲和层析的应用 酶和抑制剂的纯化 抗体、抗原的纯化 结合蛋白的纯化激素受体的纯化 分离病毒细胞 核酸蛋白互作研究第六节 亲和层析第六节 亲和层析*南昌大学 生命科学学院*1. 配基与偶联凝胶的选择与处理 在亲和层析中,作为固定相的一方称为配基(ligand)。配基必须偶联于不溶性母体(matrix) (又称载体或担体)上,常用的载体主要有:琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素等。 当用小分子作为配基时,由于空间位阻不易与载体偶联,或不易与配对分子载体结合。故通常在载体和配基之间接入不同长度的连接臂。 偶联时,必须首先使载体活化。即通过某种方法(如溴化氰法等)为载体引入某一活泼的基团。第六节 亲和层析第六节 亲和层析*南昌大学 生命科学学院*第六节 亲和层析第六节 亲和层析*南昌大学 生命科学学院*1. 配基与偶联凝胶的选择与处理 在活化载体(包括带连接臂的)已有商品出售。Pharmacia公司出产的偶联凝胶(coupling gel)可以很简单地与所需的配基偶联,不需要特殊的设备和复杂的化学反应。常用的有: 溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B :通过自发反应可安全 、简便、快速地与含有伯胺基的配基偶联。 氨基琼脂糖凝胶4B:含有六碳 (C6) 长度的连接臂,可与含有羧基的配基偶联。 羧基琼脂糖凝胶4B:含有六碳 (C6) 长度的连接臂,可与含有氨基的配基偶联。 进行亲和层析之前,首先要根据目的物质的特性,选择与之配对的分子作为配基,然后根据配基的大小和所含基团等特性选择适宜的偶联凝胶,再在一定条件下使配基与偶联凝胶接合。第六节 亲和层析第六节 亲和层析*南昌大学 生命科学学院*1. 配基与偶联凝胶的选择与处理 亲和层析载体的选择 具有多孔的立体网状结构,能使被亲和吸附的大分子自由通过; 具有良好机械性能的均匀珠状颗粒,具有良好的流速; 具有惰性,尽量减少非专一性吸附; 具有相当量的易活化的基团,在温和的条件下能与配基共价合偶联; 在偶联、吸附和洗脱时,有较好的物理化学稳定性。 影响吸附亲和力的几个因素:配基浓度;空间障碍;配基与载体的结合位点;载体的孔径;微环境(化学因素)。第六节 亲和层析第六节 亲和层析*南昌大学 生命科学学院*2. 亲和层析的操作条件 亲和柱层析装柱方法与凝胶层析相同,层析操作与离子交换层析相似。但由于亲和层析的对象都是生物分子,为防止生物大分子变性,常在低温(4℃)下进行。 亲和层析柱所用的平衡缓冲液应与样品缓冲液一致,pH一般在近乎中性的范围内。上柱时流速应尽可能缓慢。上柱后,用大量平衡缓冲液洗去杂质,然后用洗脱液洗脱亲和物。洗脱结束后,继续用洗脱液洗涤,直至无亲和物为止。最后用平衡缓冲液使亲和层析柱平衡,即可重复使用。 暂时不用时,亲和层析柱应置于4℃低温保存。 第七节 聚焦层析第七节 聚焦层析*南昌大学 生命科学学院*聚焦层析是一种操作简单、廉价、根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的层析技术。 聚焦层析是利用层析过程中固定相偶联具有两性解离功能的有机分子为配基,与流动相中某些具有两性粒子发生等电聚焦反应而进行分离的一种方法。 因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一等特点。 聚焦层析也是一种柱层析。因此,它和另外的层析一样,照例具有流动相,其流动相为多缓冲剂,固定相为多缓冲交换剂第七节 聚焦层析第七节 聚焦层析*南昌大学 生命科学学院*聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 PH梯度溶液的形成 在离子交换层析中,PH梯度溶液的形成是靠梯度混合仪实现的,使柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低变化的。而在聚焦层析中,当洗脱液流进多缓冲交换剂时,由于交换剂带具有缓冲能力的电荷基团,故PH梯度溶液可以自动形成。 聚焦层析柱中的PH梯度溶液是在淋洗过程中自动形成的,但是随着淋洗的进行,PH梯度会逐渐向下迁移,从底部流出液的PH却由9逐渐降至6,并最后恒定于此值,这时层析柱的PH梯度也就消失了。第七节 聚焦层析第七节 聚焦层析*南昌大学 生命科学学院*聚焦层析原理可以从PH梯度溶液的形成、蛋白质的行为和聚焦效应三方面来阐述。 蛋白质的行为 蛋白质所带电荷取决于它的等电点(PI)和层析柱中的PH值。当柱中的PH低于蛋白质的PI时,蛋白质带正电荷,且不与阴离于交换剂结合。而随着洗脱剂向前移动,固定相中的PH值是随着淋洗时间延长而变化的。当蛋白质移动至环境PH高于其PI时,蛋白质由带正电行变为带负电荷,并与阴离子交换剂结合。由于洗脱剂的通过,蛋白质周围的环境PH 再次低于PI时,它又带正电荷,并从交换剂解吸下来。随着洗脱液向柱底的迁移,上述过程将反复进行,于是各种蛋白质就在各自的等电点被洗下来,从而达到了分离的目的。 不同蛋白质具有不同等电点,它们在被离子交换剂结合前,移动之距离是不同的,洗脱出来的先后次序是按等电点排列的。第七节 聚焦层析第七节 聚焦层析*南昌大学 生命科学学院*聚焦层析所用的凝胶首先用高pH溶液平衡,然后用多元缓冲液进行洗脱,多元缓冲液pH呈梯度下降。 聚焦层析所用凝胶主要有两种: MONOP。MONOP是带孔小珠,孔中被带正电荷的胺基填充,适用于高效聚焦层析。 多元缓冲液交换剂(PBE)。多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶,适用作普通聚焦层析的介质。第八节 薄层层析第八节 薄层层析*南昌大学 生命科学学院*薄层层析是将作为固定相的支持剂均匀地铺在支持板(一般是玻璃板)上,成为薄层,把样品点到薄层上,用适宜的溶剂展开,从而使样品各组分达到分离的层析技术。 如果支持剂是吸附剂,如硅胶、氧化铝、聚酰胺等,则称之为薄层吸附层析; 如果支持剂是纤维素、硅藻土等,层析时的主要依据是分配系数的不同,则称之为薄层分配层析; 如果支持剂是离子交换剂,则称为薄层离子交换层析; 薄层若由凝胶过滤剂制成,则称为薄层凝胶层析第八节 薄层层析第八节 薄层层析*南昌大学 生命科学学院*薄层层析的特点: 薄层层析的操作与纸层析相似,但比纸层析速度快,一般仅需15-30min,分辨力比纸层析高10-100倍,它既能分离0.0
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