木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化

·34· 中间体 Chemica】Intermediate 2005年第1期 木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化 邓静 丁玉兰 赵树进 (1．四川理工学院生物系 2．广州军区陆军总医院药学部) ■姜 采用硫酸铵分级沉淀与离子交换相结合的从市售的木瓜蛋白酶干粉中分离纯化木瓜凝乳蛋白酶。 结果表 明 Macro—Prep High S Support离子交换树脂比 SP—Sepharose Fast Flow 离子 交换树脂 能更好的分 离纯化木瓜凝乳蛋 白酶，经 Macro—Prep High S Support交换树脂二次纯化的木瓜凝乳蛋 白酶 已达到 了与 品 同样的纯度。 关健一 木瓜凝乳蛋白酶 硫酸铵沉淀 离子交换 纯化 中田分爽号：TQ 文章●号：1672—8114(2005)01—0034—04 The purification of chymopapain Deng魄 Ding Yulane刁m S}l (1．Bioengineering Department，SiChuan Univisity of Science and engineering．Zigong 643033， 2．Department of Pharmacy，General Hospital of Guangzhou Army．Guangzhou 510010) A s眦 t Chymopapain was purified from commercially available spray—dried latex of papaya fruit by (NH4)2S04 fractionation and protein chromatography on SP-Sepharose Fast Flow and．Macro-Prep High S Support c~ion—exchange column respectively，The results indicated Macro—Prep High S Support was superi- or to SP-Sepharose Fast Flow resin．Th e chymopapain whose purity equal to standard substance was get by twice protein chromatography on Macro-Prep High S Support． Key w chymopapain，(NH4)2S04fractionation，ion exchange chromatography，purification 木瓜蛋白酶干粉中含有：木瓜蛋白酶[EC 3．4．22．2] (papain)、木瓜凝乳蛋白酶[3．4．22．6](chymopapain)、 木瓜蛋白酶 Q[EC 3．4．22．3O】(papaya pmteinaseQ，也 称 papaya p~ptiaase A、papaya pmteinase Ⅲ、caricain)、 木瓜凝乳蛋白酶M [EC 3A：~9_25](由m M也称 gtycyl endopeptidase、papaya proteinaseIV、Proteinase@ -c) 等四种蛋白酶，其分子量分别为：23500，26000，24900， 24500 1o而木瓜凝乳蛋白酶是其中含量最大的蛋白酶。 除了可以治疗腰椎间盘突出症外，还可以用于肿瘤的 辅助治疗，Rh血型的鉴定，消炎 。由于它在医药 工业用途的日益广泛，越来越受到人们的重视。木瓜 凝乳蛋白酶是木瓜蛋白酶家族中最特别的一种蛋白 酶，含有两个自由的巯基。自1941年发现木瓜凝乳蛋 白酶来，人们对其进行了大量的研究，现 已知木瓜凝 乳蛋白酶具有多种色谱形式。通常从阳离子交换树脂 上先洗脱出来的是木瓜凝乳蛋白酶 A，紧接着出来的 是木瓜凝乳蛋白酶 B，Brocker发现木瓜凝乳蛋白酶 A 和木瓜凝乳蛋白酶 B与双质子反应探针所得的结果 不一样。Khan等在 1983年又分离到一种木瓜凝乳蛋 白酶其性质介于木瓜凝乳蛋白酶A和B之间，同年 Brocklehurst等又认为根据双质子反应探针可以得到 4种不同性质的木瓜凝乳蛋白酶I川。正由于木瓜凝乳 蛋白酶的理化性质和木瓜乳汁中的其他成分相似，而 本身又具有多种色谱形式，所以其分离纯化相当困 难。国外的学者已对此酶的分离纯化作了大量的研 究，虽然取得了一定的成绩，但要得到高纯度、高活性 的木瓜凝乳蛋白酶还是比较困难，直到 1996年人们 才成功的获得此酶的晶体，测定了它的X一射线结构 【4】 。 德国的Mohamed等人l 114年来一直从事木瓜凝 乳蛋白酶的分离纯化工作，企图找到一种方便、经济 有效的分离纯化方法，以期望能大规模的生产此酶。 而我国对于木瓜凝乳蛋白酶的研究报道很少，还没有 相关的产品生产，临床试用的制剂也靠国外进口。本 文采用盐析和离子交换相结合的方法，旨在得到木瓜 维普资讯 http://www.cqvip.com 2005年 1月 木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化 ·35· 凝乳蛋白酶的纯品，以用于单克隆抗体和多克隆抗体 的制备，从而为更好的检测和分离纯化木瓜凝乳蛋白 酶打下基础。 1材料与方法 1．1材料 木瓜蛋白酶粗酶，广州酶制品厂；低分子量蛋白 质标准，上海生化试剂有限公司；梯度层析仪仪， Pharmacia—LKB公司：SP—Sepharose Fast Flow离子交 换树脂 ，Pharmacia公司；Macro-Prep High S Support 离子交换树脂，BIO—RAD公司：木瓜凝乳蛋白酶标准 品 ，Sigma公司 1．2方 法 1．2．1木瓜凝乳蛋白酶分离纯化 1．2．1．1硫 酸铵沉淀t 1 取 10g木瓜蛋白酶粗酶溶于 100ml含 20mmol／L 半胱氨酸和 1mmol／LEDTA的双蒸水中，放置 15min； 加入 200mmol／L的巯基乙醇搅拌，放置 15min，然后在 20min内用 1mol／L的NaOH调 pH至 9．0；于4~C离心 30rain，弃去沉淀，在 20min内用 1mol／L的 HC1调 pH 至 6．0；加入硫酸铵 (0．277g／mL)，20~C下放置 1h，离 心，弃去沉淀(木瓜蛋白酶 )；将上清液继续加入硫酸 铵使其浓度达到0．472g／ml，在20~C下放置lh，离心弃 去上清液，得到含木瓜凝乳蛋白酶的粗品；将此固体 溶于 25ml含 lmmol／LEDTA，4mmol／L巯基乙醇，0．01％ NaN，，pH5．0的0．05mo]／L的醋酸钠缓冲溶液中：用同 样的醋酸钠缓；中溶液 500ml透析，换液三次。 1．2．1．2离子交换柱的初次分离层析： 将约 10mg用硫酸铵沉淀所得固体，用 6mmo]／L 巯基乙醇处理，然后分别上 SP—Sepharose Fast Flow 和 Macro—Prep High S Suppo~ 离子交换树脂 ，用 0．05mo]／L、pH5．0的醋酸钠缓冲溶液洗去未结合的蛋 白，然后用0．1～0．8mol／L、pH5．0的醋酸钠缓冲溶液梯 度洗脱。 1．2．1．3离子交换柱的再次分离纯化 ： 将经 Macro—Prep High S Suppo~离子交换层析 得到的含木瓜凝乳蛋白酶的馏分用 PEG浓缩，加入 6mmol／L的巯基乙醇处理 30min，再上 Macro—Prep High S Suppo~离子交换柱，先用0．05mo／L、pH9．5的 硼酸钠缓冲溶液平衡柱子，然后再用 0．05~0．3mol／L、 pH9．5的硼酸钠梯度洗脱。 1．2．1．4离子交换柱的再生、清洗和消毒 用 1mol／LNaC1溶液洗脱至基线，再用0．5mol／LNaOH 溶液 5个柱体积洗脱 ，20％乙醇5个柱体积洗脱至基 线出现，取下柱，凝胶溶于20％乙醇，4~C保存。 1．2，2木瓜凝乳蛋白酶纯度的确定 SDS-PAGE凝胶电泳，12．5％分离胶，5％浓缩 引。 1．2．3木瓜凝乳蛋白酶活力的测定 参照 FIP，以酪蛋白为底物，经木瓜凝乳蛋白酶 水解后，用紫外分光光度计测定水解酪氨酸的浓度， 计算酶活力【 。 酶活定义：在 pH7．0，37~C条件下，每分钟释出得 三氯乙酸可溶物在 275nm的吸光度与lug酪氨酸的 吸收度相当时，所需的酶量为一个单位。 1．2．4蛋白质含量的测定 考马斯亮兰 】 2结果与讨论 2．1 SP—Sepharose Fast Flow 离子 交换树脂分 离木瓜凝乳蛋白酶 将约10mg硫酸铵沉淀部分先用巯基乙醇处理， 如实验部分所述，再用pH5．0的醋酸钠缓冲溶液梯度 洗脱，得到其洗脱曲线如图 1所示。 洗脱渣体秘 ‘ 图 1木瓜蛋 白酶粗酶经 sP—Sepharose Fast Flow离子交换柱后 的洗脱 曲线 Fig．1 The eluate curve through SP—SeDhar0se Fast Flow resin for the first time 研究表明经磺化处理后的木瓜蛋白酶粗酶经 SP—Sepharose Fast Flow离子交换柱后，用醋酸钠缓 冲溶液梯度洗脱往往得到三个洗脱峰，第一个峰为木 瓜蛋白酶，第二个峰为木瓜凝乳蛋白酶，第三个峰为 木瓜蛋白酶 Q【川。由图可见，我们共得到两个洗脱 峰，前面没有出现木瓜蛋白酶的／J、峰，表明我们用硫 酸铵除木瓜蛋白酶是比较彻底的。由此可以确定第一 个峰为木瓜凝乳蛋白酶，第二个峰为木瓜蛋白酶 Q。 维普资讯 http://www.cqvip.com ·36· 中问体 Chemical Intermediate 2005年第 1期 另外这两个洗脱峰几乎没有交叉，可以认为经 SP— Sepharose Fast Flow后木瓜凝乳蛋白酶和木瓜蛋白 酶 Q能很好的分开，经检测其分解酪蛋白的能力都 比较强。 2．2木瓜凝乳蛋白酶的纯度鉴定 为了确定各洗脱峰的纯度，将经硫酸铵沉淀后的 木瓜凝乳蛋白酶粗酶和经 SP—Sepharose Fast Flow离 子交换柱层析的两个峰以及木瓜凝乳蛋白酶的标准 品进行SDS—PAGE电泳，结果如图2所示。 97 t0(} 66，200 13．tWO0 1．tX,'O Mak“r l 2 ：j { 1．木瓜凝乳蛋白酶粗酶 2．洗脱分离第一峰 3．洗脱分离第一I峰 4．木 瓜凝乳蛋白酶标准品 图 2 SDS—PAGE电泳分析图 Fig．2 The electophoresis analysis of SDS-PAGE 由图可见，经离子交换柱分离前的木瓜蛋白酶有 很多条带，其杂蛋白含量较多，而经分离纯化的第二 峰几乎是为一条带，得到的木瓜蛋白酶 Q纯度较高。 分离纯化得到的第一个峰其分子条带和标准品的几 乎相似，但低分子条带更明显。所以经 SP—Sepharose Fast Flow离子交换柱层析得到的木瓜凝乳蛋白酶其 纯度还不够高。这可能是在原料预处理过程中，一些 低分子的蛋白质与木瓜凝乳蛋白酶的等电点相接近， 当经此离子交换柱后，得到与木瓜凝乳蛋白酶相似的 洗脱峰。由于从电泳检测得的结果木瓜凝乳蛋白酶电 泳纯度不是特别高，因此我们换用Macro—Prep High S Support离子交换树脂来分离它。 2．3 Macro-Prep High S Support离子交换树 脂分 离木瓜凝乳蛋白酶 将约 10mg硫酸铵沉淀部分也如实验部分所述进 行处理，再用 pH5．0的醋酸钠缓冲溶液梯度洗脱，得 到其洗脱曲线如图3所示。 由图可见经 Macro—Prep High S Support离子交 换柱后共得到四个洗脱峰，据前面的分析我们可知第 四个峰为木瓜蛋白酶 Q，木瓜蛋白酶已经除去了，那 前三个峰则 为木瓜凝 乳蛋 白酶 ，与前面 的 SP— Sepharose Fast Flow离子交换树脂相比，这种离子交 睨嫩 俸 ( ) 图 3第一次经 Macro-Prep High S Support离子交换柱后 的洗脱曲线 Fig．3 The eluate curve through Macro-Prep High S Suppor resin for the first time 换树脂能更好的把木瓜凝乳蛋白酶分离开，所得图谱 和David等人【 得到的洗脱图谱相似。只是他们得到 的第二个和第三个峰的酶活力较高，而我们测得的第 一 个峰酶活力最高，其次是第三个峰，最低的是第二 个峰。这可能和我们的木瓜蛋白酶粗酶的来源以及预 处理方法不同有关。由于第一个峰和第二、三个峰有 明显的交叉，所以木瓜凝乳蛋白酶没有彻底的被完全 分开，因此我们对其进行了二次分离纯化。 2．4木瓜凝乳蛋 白酶的二次分离纯化 将上面得到的木瓜凝乳蛋白酶活力最高的第一 个峰收集，并用 PEG进行浓缩后，加入巯基乙醇处理 半小时，上 Macro—Prep High S Support离子交换柱， 用0．05～0．3mol／L、pH9．5的硼酸钠梯度洗脱，洗脱曲线 如图4所示。 6 工 0 6 7 t 0{ 《 一 0．2 鉴 ~_ 蓑 譬 * 0(} 0 洗脱液体积 (ml ) 图 4第二次经 Macro-Prep High S Support树脂交换柱的洗脱 曲线 Fig．4 The eluate curve through Macro-Prep High S Suppor resin for the second time 由图可见，将木瓜凝乳蛋白酶第一峰经二次分离 后，得到一个单一的洗脱峰，经测定其具有较高的酶活 力。而上面的第二峰和第三峰都没有洗脱下来，这与我 们选择的洗脱条件有密切的关系。从洗脱峰来看，可以 初步确定其为比较纯的物质，将它作进一步的检测。 2．5木瓜凝乳蛋 白酶纯度鉴定 将上面分离得到的单峰收集浓缩，和木瓜凝乳蛋 白酶标准品以及经硫酸铵沉淀得到的木瓜凝乳蛋白 一 一^ N《(v 蟮￡ ≤ * ¨ 维普资讯 http://www.cqvip.com 2005年 1月 木瓜凝乳蛋白酶的分离纯化 ·37· 酶粗品进行 SDS-PAGE电泳，其结果如图 5所示。 97，tO(3 66、200 13．0(m 31．000 20，100 l I' U0 (Ik I’ 】 Z 0 1．木瓜凝乳蛋白酶粗酶 2．木瓜蛋白酶标准品 3．分离得到的峰 图 5 SDS—PAGE电泳分析图 Fig．5 The electophoresis analysis of SDS-PAGE 由图可见经二次分离纯化后木瓜凝乳蛋白酶在电泳 图上呈现出单一的明显条带，几乎没有低分子的条带存 在，其分子量和标准的木瓜凝乳蛋白酶一致，具有较高的 纯度，可以用于单克隆抗体和多克隆抗体的制备。 2．6各分离峰的蛋白质含量及酶活分析 将经硫酸铵沉淀后的木瓜凝乳蛋白酶粗酶，经SP_ Sephamse Fast Flow离子交换的第一峰，以及经Macro— Prep High S Support离子树脂二次交换后的第一峰分别 收集，测定其蛋白质含量和酶活力，结果如(表 1所示 )。 虽然木瓜凝乳蛋白酶在木瓜乳汁中含量最大，但 从表中可见，经硫酸铵沉淀后，蛋白质回收率为24％， 经 Macro—Prep High S Support离子交换树脂二次纯 化后，蛋白质回收率仅为4．8％，我们用此法得到的纯 木瓜凝乳蛋白酶的产量极低。一方面可能与我们用的 离子交换柱比较小有关，另一方面由于木瓜凝乳蛋白 酶具有多色谱形式，而我们分离得到的只是其中的一 种色谱形式，这都影响了酶的回收。由于我们主要是 想将纯化的木瓜凝乳蛋白酶用于单克隆和多克隆抗 体的制备，纯度是我们最关心的问题，而对其产量缺 乏过多的考虑。因此如果要想大规模的分离纯化木瓜 凝乳蛋白酶需要另辟途径。 3结论 3．1经硫酸铵分级沉淀可以较彻底的除去木瓜 蛋白酶干粉中的木瓜蛋白酶，简化木瓜凝乳蛋白酶离 子交换所得的洗脱峰。 3．2 Macro-Prep High S Support离子交换树脂 比SP—Sepharose Fast Flow离子交换树脂能更好的分 离纯化木瓜凝乳蛋白酶，经 Macro—Prep High S Sup— port离子交换树脂二次纯化的木瓜凝乳蛋白酶已达 到了与标准品同样的纯度。 3．3经硫酸铵沉淀后，蛋白质回收率为24％，经 Macro—Prep High S Support离子交换树脂二次纯化 后，蛋白质回收率仅为4．8％，所以此法不适用于大规 模生产木瓜凝乳蛋白酶。 表 1木瓜蛋白酶分离成分分析 Table 1 analysis of purification ingredient 参考文献： 【1】Bernard P．0 H,Andrew 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