溶血空斑试验

溶血空斑试验 来源：生物学实验中心 发布时间：2010-04-04 查看次数：453 一、 原理 溶血空斑试验是体外检测单个抗体形成细胞(B淋巴细胞)的一种方法，即将经绵羊红细胞(SRBC)免疫过的家兔淋巴结或小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC结合，于37℃作用下，免疫活性淋巴细胞能释放出溶血素，在补体的参与下，使抗体形成细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体形成细胞周围，形成肉眼可见的溶血空斑。每个空斑示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。由于溶血空斑试验具有特异性高，筛检力强，并可直接观察等优点，故可用作判定免疫功能的指标，观察免疫应答的动力学变化，并可进行抗体种类及亚类的研究。 二、 材料和方法 (一) 材料 平皿(直径55×15cm)，温箱(37℃)，水浴箱(45℃)，离心机，显微镜及白细胞计数器，18～25g昆明系小鼠等。 (二) 试剂 1． SRBC悬液取无菌脱纤绵羊血(或阿氏液保存的血液)，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，每次2 000r/min离心5min，最后取压积红细胞，悬于灭菌pH值72 PBS(含Ca2+、Mg2+)中，使成为20%浓度，经细胞计数后，调整细胞浓度为2×109/ml。 2． 01mol/L pH值72 PBS(含Ca2+、Mg2+)。 3． 底层和顶层琼脂取抗补体作用小的琼脂(日本琼脂粉或旅大水产制品厂的产品)用PBS配成14%和07%两种浓度。将07%的琼脂分装小试管，每管15ml备用。 4． DEAE右旋糖酐分子量5万，用蒸馏水配成1%浓度备用。 5． 补体采集3只以上豚鼠血清，应用时用PBS稀释成1:30浓度(如不加DEAE右旋糖酐，可采用原补体或作1:5稀释)。 (三) 方法 1． 免疫脾细胞悬液的制备 (1) 免疫小鼠：每只小鼠经尾静脉或腹腔注入上述SRBC悬液02ml。 (2) 制备脾细胞悬液：将免疫后第四天的小鼠，拉颈处死，解剖取出脾脏，放入含Ca2+、Mg2+冷的pH值72 PBS中漂洗后，去掉结缔组织，加入适量的PBS，用弯头镊子挤压出脾细胞，稍静置，吸上清液至离心管中，1500r/min离心5min，弃上清后，定量加入PBS，混匀，按白细胞计数法计算脾细胞，最后用PBS调整细胞数至107/ml的浓度。一般每只脾脏细胞数为1～15×108。 2． 倾注底层琼脂将14%琼脂凝胶经加热融化后，倾注于水平位置的平皿内，每皿2～3ml，凝固后，置37℃温箱，平皿反扣，开盖1h后备用。 3． 顶层琼脂的制备将07%的琼脂融化后，置于45℃恒温水浴箱中，依次加入：①2×109/ml SRBC悬液01ml；②1% DEAE右旋糖酐005ml；③107/ml脾细胞悬液0.1ml。迅速混匀后，倾注于已铺好底层琼脂的平皿内，使之均匀铺开，凝固后，静置约15min，放37℃温育1～15h。 4． 加补体从温箱中取出平皿，每皿加入1:30稀释的新鲜豚鼠血清15ml(如未加DEAE右旋糖酐，则加原血清或1:5稀释的新鲜血清15ml)，继续放37℃温箱中温育30min后，取出，观察溶血空斑。也可在室温下放置1h ,4℃冰箱过夜，翌日观察结果。如需保存，则可加入用生理盐水或PBS配制的025%戊二醛6ml进行固定。 三、 试验结果 观察时，将平皿对着光亮处，用肉眼或放大镜观察每个溶血空斑的溶血状况，并记录整个平皿中的空斑数，同时求出每百万个脾细胞内含空斑形成细胞的平均数。 四、 注意事项 (一) 对SRBC的因为SRBC既是免疫原，亦是靶细胞和指示细胞，故要求SRBC应新鲜，洗涤不超过3次，每次2000r/min 离心5min，细胞变形或脆性增大者均不能使用；阿氏液保存的血液可用两周。 (二) 免疫所用SRBC的数量尾静脉注射以2×104/02ml为宜。腹腔注射为4×108/ml，用量过小，如低于107/ml注射05ml，空斑形成极少；用量过大，超过25×109/ml，多不能形成空斑。 (三) 采取免疫脾的时间无论是经尾静脉还是腹腔免疫，均以免疫后第四天取脾为宜，过早过晚空斑都形成极少。 (四) 脾细胞的活力为了保持脾细胞的活力，制备脾细胞过程中所用PBS(或Hank′s液)，最好临用时方从4℃冰箱中取出，或整个操作过程应在冰浴中进行。 (五) 倾注平板的要求底层要平，上层要把握好温度。 (六) 补体的活力补体活力的大小，对溶血空斑的形成关系甚大。如出现抗体或补体的活力低下，将不形成空斑。所以补体要新鲜，并宜将3只以上豚鼠血清混合。 试验中加入Ca2+、Mg2+是为了活化补体。DEAE右旋糖酐是一种多盐的水溶性物质，由于琼脂的半乳糖链上含有抗补体的硫酸酯基团，DEAE右旋糖酐能与它形成不可置换的结合，而使之沉淀，从而消除琼脂的抗补体作用。 (七) 空斑计数要求判读准确，避免辨认造成的误差，遇可疑空斑时，应镜检，以对肉眼结果进行核对。