重组人表皮生长因子的分离和纯化工艺的研究

12 浙 江 化 工 2o01年 文章编号 ：10o6—4】48(2001)增刊-OOl2MM 重组人皮生长因子的分离和纯化工艺的研究 童望宇 姚善渔 朱 自强 (浙江大学化学与生物S-程学系 杭州 310027) 摘 要 探计了人表皮生长因子的分离思路并据此研究了人表皮生长因子的分离工艺，特别 是对／-程发酵液理化特征和各层析单元操作的结果进行了详细地研究分析。结果表明：发酵液中目 标产物与杂蛋白质问的分子量相差较大，其等电点也有一定的差距。在层析分离单元中，凝胶层析 可使人表皮生长因子的纯度提高至94％以上，收率达72％以上；而离子交换层析与扩张康吸附则具 有较高生产力的特点。根据不同的层析操作所提出的三条生产工艺而生产的人表皮生长因子可满 足不同的市场需求。 关键词 人表皮生长因子 离子交换层析 扩张床层析 凝胶层析 生化分离 蛋白质 1 引 言 随着对人表皮生长因子生物学效应及作用机理 研究的深入 ，逐渐显示出其重要的应用价值。在 基础研究方面，人表皮生长因子(human epidermal growth factor rhEGF)及其受体系统已成为探讨细胞 调节机制的良好模型 ]，是了懈细胞恶性转化、肿 瘤发生的重要线索 ；在临床 医学领域，人表皮生 长因子可用于多种疾病的诊断和治疗 ：眼科角膜损 伤、白内障切除后角膜移植 、皮肤烧伤与创伤、外伤 性皮肤溃疡、口腔溃疡、胃肠道溃疡以及神经胶质 瘤、鳞状细胞癌等’刮；还可制成含人表皮生长因子 的药物化妆品，促进人体表皮细胞的新陈代谢 。 自20世纪90年代以来，人表皮生长因子潜在的 巨大经济效益吸引了越来越多的国内外研究机构与 企业进行其系列产品的研究与开发 】。据估计，目 前人表皮生长因子的年产值达数十亿美元。 本实验室近年来，对采用基因工程菌发酵生产 重组人表皮生长因子进行了较为深人的研究，并在 此基础上，着重研究了重组人表皮生长因子的分离 纯化工艺。根据所得到的研究结果、经验与体会，以 及对重组人表皮生长因子的生产规律性，本文 将提出一些产业化的设想，以期对今后生物产品生 产特别是分离过程的优化与设计有所帮助。 2 rhEGF分离与纯化的思路 Ji ~ 联 系 In 人 B1 ：2 车 00 项 1- 目 1 为 O- 国 2O 家自然科学基金贤助项 目(缩号：2 361加 ) 作者葡舟：童望宇 ．【1963一)，男．湖南人，博士后，现从事生物化工研 究 rhEGF是基因工程产物，其生产工艺路线的研 制，概括起来说，大致可分为6个阶段： (1)构建一个合适的工程菌株； (2)优化一个有效的发酵工艺； (3)建立一个适当、方便、灵敏的分析方法； (4)进行目标产物的回收与初步纯化； (5)进行目标产物的进一步纯化与产品的精制； (6)临床研究。 由于产业化操作的难易和成本高低将对产品的 经济价值和竞争能力有很大的影响，在设计生产工 艺时拟从以下方面加以考虑： (1)上下游兼容：在基因重组时，选择合适的宿 主细胞，扩大目标产物与宿主正常代谢产物的性质 差异；在发酵过程中，优化发酵条件，减少杂蛋白质 含量，降低后续分离纯化的负担，以促进上下游集 成 ，降低生产成本的作用； (2)分析发酵液组成性质：特别是发酵液的粘 度、组分的分子大小、电荷性质、稳定性、目标产物及 杂蛋白质的含量与种类，以选择适当的分离方法，特 别是确定何种层析技术； (3)合理组合层析技术以达到集成分离的功能： 在生物提取时，往往倾向于以离子交换层析作为提 纯的第一步或第二步，尤其是扩张床吸附层析，因为 它具有去除菌体和细胞碎片、浓缩产品 (可达到约 110n1g蛋白质／rid柱体积)的过程集成特点。而凝胶 层析则具有分离与脱盐的集成功能，但上样体积通 常很小，只占柱体积的1—5％，分离规模小，因此一般 适宜放在最后精制阶段； (4)根据产品的不同使用目的，建立不同的生产 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 32卷 增刊 浙 江 化 工 工艺：人表皮生长因子既可用作医药，也可用于化妆 品领域，不同的应用领域对其产品的纯度和浓度及 产量要求各不相同。 通常来说，操作越复杂、收率越低、成本越高；而 收率一般与纯度成反比。考虑操作步骤、产品质量与 成本的关系。本生产工艺的基本如下：发酵、预 处理(离心)、浓缩、精制、干燥。 3 rhEGF的分离纯化工艺的结果比较 3．1仪器与试剂 层 析 系 统 (7tKTA explorerl00)、(GradiFrac System)、扩张床 (STREAMLINE25)、层析柱 (XK 16／20)、进样柱 (SupedooprM50)、凝胶(Streamline DEAE)、(SephadexG一5O Superfine) 购 自Amemham Pharmacia Biotech AB．Sweden。 电泳仪(Mini VE eomple[e)、低分子量标准蛋 白质试剂盒购 白(MW：14，400～94，000D)Amersham Pharnmcfa Biotech Inc．．USA。 标准人表皮生长因子购白Pepro Tech EC Dd．． England；其它试剂均为市售的分析纯试剂。 0．2tool pH7．0磷酸缓冲液的配制见文献“ 。 平衡 液 ：取0．2mo1／L NaH~O 溶液39．0ml， 0．2mol／L Na~HPO 溶液61．Oml，加蒸馏水定容到 1000ml，配制成pH7．0，0．02M的磷酸缓冲夜(PBS)； 洗 脱液 ：取0．2mo~L NaH~O 溶 液39．0ml， 0．2mo~L Na2HPO4溶液61．Oml，称取116．88g NaCI固 体，加蒸馏水定容到10(~wl，配制成pH7．0 PBS+2M NaCI的磷酸盐缓冲液； 不同pH值下的缓冲液配制见文献“ 。 rhEGF标准品购白Pepro．Tech EC．Ltd．England。 3．2 实验方法 3．2．1 发酵液预处理 (1)将含有 rhEGF的发酵液用冷冻离心机在 4 C条件下以80001"pill的速度离心 30min，收集上清 液，置于4℃冰箱中备用(填充床)； (2)用冷冻离心机将发酵液于 4℃条件下以 4000wm的速度离心 lOmin，收集上清液于4℃条件 下保存备用(扩张床)。 3．2 2 盐析 取除去菌体的发酵上清液 1000ml，用 1M浓度 的盐酸小心调节发酵液的 pH于 4．5左右，缓慢加入 21og硫酸铵(硫酸铵饱和度为：35％)，搅拌溶解，4℃ 下静置4-24小时，至沉淀彻底，人表皮生长因子进 入沉淀中。虹吸去除7oo一85O 上清液 ，剩余的 150~30~nl于4 条件下 8000rpm、30rain离心，收集 沉淀。用 50ml O 02M磷酸盐缓冲液(pH7．4)搅拌溶 解沉淀，形成悬浊液，4℃下静置4～24小时，侍溶解 充分后，于4℃条件下 8000rpm、30min离心．收集上 清液，于4℃条件下保存备用(凝胶层析)，人表皮生 长因子进入上清液中； 3．2．3 rhEGF的离子交换层析 rhEGF的离子交换层析方案自行设计，操作模 板根据文献“ 自行修改制定。 3．2．4 rhEGF的扩张床吸附层析 发酵上清液 扩张模式泵人扩张床后，用平衡 液将其洗涤至紫外吸收峰值为零，再将扩张床连接 到AKTA explorer100层析系统上，用洗脱液 填充 床模式进行洗脱。rhEGF的扩张层析方案自行设计． 根据文献_【4 自行修改制定。 3．2．5 rhEGF的凝胶层析分离 rhEGF的凝胶层析分离操作见参考文献 3．2．6 rhEGF的分析 rhEGF定性分析用 SDS—PAGE电泳；rhEGF定 量分析用分离纯化快速开拓系统 AKTAexplorer 100紫外测定，详见文献~15．16】。 3．3 纯化工艺流程 根据上述 、^表皮生长因子的分离思路，对人表 皮生长因子层析分离优化研究后[17,181，为满足不同 的市场需求，从工程菌发酵液中分离纯化人表皮生 长因子的工艺流程设计如表 l所示。 衰 1 三条分离纯化 rhEGF的工艺路线 3．4 分离纯化结果夏比较 在 rhEGF分离纯化中，经多批实验，得到了如表 2 所示的三种层析分离的优化条件。 表 2 rhEGF分离纯化的优化条件 表中IEC为离子交换层析、EBA为扩张床吸附 层析、GFC为凝胶层析。在上述优化条件下 ，三种层 析的分离纯化 rhEGF的结果如表3所示。 维普资讯 http://www.cqvip.com 14 浙 江 化 工 表 3 rhEGF的分离结果 从表中层析结果可知，凝胶层析的纯化效果比 用离子交换层析和扩张吸附显著，这与发酵液中 rhEGF的分子量与其它杂蛋白质分子量相差较大相 一 致。虽然发酵液中多数杂蛋白质的等电点高于 rhEGF的等电点，但仍有一些杂蛋白质的等电点接 近甚至低于rhEGF的等电点，故用阴离子交换剂虽 可除去大部分杂蛋白质，但难以达到高效的纯化效 果。同时，凝胶层析的低生产能力可能将成为产业化 的瓶颈。扩张床吸附层析本来就是作为初步纯化方 法 ，纯化倍数不高已在意料之中。 本文提出的 3条不同的生产工艺路线，各有特 点 ，既相互独立 ，又有联系。3种不同生产工艺的特 点如表 4所示。 表 4 rhEGF的生产工艺特点 工艺特点 工艺路线 1 工艺路线 2 工艺路线 3 层析操作数 分离纯化时间 生产能力 回收率 纯度 设备投资 产品用逾 1 1 1 <2．Oh <2．5h <4h >0 15nw,／run >4 25nw,／run>24mgatrun >36％ ～75％ ～72％ >94％ > l0％ >20％ Lowest Medium Highest M edicine Collieric Ccernetic 表中结果显示，工艺流程 l具有产品质量高、投 资低的优点，也存在收率低、产量小的不足：工艺流 程 2和 3具有收率高，产量大的优势，而却存在产品 质量低的歃点 若将工艺流程 2、3分别与工艺流程 l中的凝胶层析相结合．显然可达到提高收率、产量 和产品质量的效果。而三种不同的工艺流程因可分 别满足不同的生产条件与不同的产品质量需求，故 仍有其存在的价值。生产工艺的最终确定 ，影响因素 很多，主要取决于市场需求(质与量)。因此最终的工 艺路线必须与市场的有机结合。也即如果产品作为 医用，那么必须加上凝胶层析一步，而产品只是作为 化妆品之用，显然就经离子交换层析或扩张床层析 就可达标 4 rhEGF产业化的初步设想 rhEGF要面向市场，生产成本将是一个重要依据。用 于 rhEGF生产的成本主要包括由发酵和分离材料、 设备成本、建筑、水、电、劳动力及税收等方面组成。 这里仅就材料与设备费用作一简单计算 发醇培养 基中材料消耗如表 5所示 。 表5 材料消耗一览表 试 剂 价格(Y／g)用量(g／L)成本(~IL) 由上表可知每升发酵液成本为46元人民币，由 于种子培养基不含异丙基一13一D一硫代半乳糖苷，故每 升约需人民币 32元，且以 10％的接种量计，则每升 发酵液总成本约为 49．2元人民币。加之分离中所用 磷酸盐及氯化钠并加 20％的损耗，故每升发酵液生 产所用材料费约 6O元人民币。发酵液中rhEGF含 量以 100mg／l计．总收率以50％计，则每克 rhEGF 消耗材料费约为 l200元人民币。 发酵过程与分离过程中所用主要设备估价如表 6所示。 表 6 设 备估价一 览表 设备和仪器 价格(万元人民币) 发酵罐 AKTA explorex 100 高教液相色谱 扩张床系统 电苏装置 扩张床填料SI~ INEDEAE 17—0994—0l 凝眭填料 phad G一50＆驴 l7—0041一毗 其它 总计 20 60 20 20 0 5 0 7￥／L 2 ，L 10 】33 鉴于 目前 rhEGF试剂价约台人 民币 5000元／ 毫克，即5百万元人民币／克。而根据我们前面的粗 略估算 ，生产成本并不高，远远小于该价格。因此从 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 32卷 增刊 浙 江 化 工 技术以及成本核算上看，要开发这一工艺是可行的。 必须要指出产品的用途不同，对工艺路线要求也不 同，譬如产品用于化妆品，由于对产品的纯度要求并 不高，所以只要采用相对简单的流程即可，譬如我们 所提出的工艺流程2或 3与工艺流程 l。 但是若按照生产试剂的要求或作为临床试验的 要求来设计工艺路线，就必须加强产品的精制与纯 化，相应的生产成本和操作要求要比生产化妆品为 目的的产品要高得多。按照我们的设想，在工艺流程 2或 3与工艺流程 1中再加上凝胶层析一步 就基 本能达到要求。而事实上，在我们的多次比较试验 中，确认产品的纯度可以满足要求。如果我们将以此 过程进一步完善放大，并用于临床研究，可望获得良 好的经济效益和社会效益。 由此可见，在将生物产品实现产业化过程中，需 要根据不同需要，进行多方案、多途径的比较，设计 出能符合多种产品用途的工艺路线，并且在各种工 艺路线之间要有结合点，既要在生产过程中采用高 新技术，也要注意在满足产品要求的情况下采用虽 简单的方法。当然影响产品产业化的因素是多方面 的，有时其它因素甚至比技术因素还要重要，特别是 社会的需求量和市场变化，而这些因素是难于把握 的。因此本文只能从技术的角度提出我们对生产人 表皮生长因子产业化的一点初步设想。 参考文献 1 Cohen S．Carpenter G．(1975)Hunmn epidermal growth fltelor：iso]allon end chemical end bldogieal properties，Proeeedlngs 0f Nati~ud Academy 0f Seiences o／"the USA．72：1317一I321． 2 Cooke RM，Wilkinson J^，Baron M，P~store A．Tappin MJ， Cm pbdl ID，GregoU,H．Sheard B．(1987)The solution stmelttt~ hⅢ an epidermal growth factor ．Nmure，327；339—341 3 Dmltfiev I，Kashenl 怔 E，Rogers BE．Krasnykh V．Curiel DT．(200O)Ectodomain 0f Coxsaekiedras end Adenovirus Receptor G．：metieally Fused to Epidermal Growth-Factor Mediates Adeno+in Ta．-g'eting to Epidermal Growth—Factor Receptor-P~itive Cells ． J0LLIT“ 0f Virology，74(15)：6875~5884． 4 Morales AAM．Dueonge J，Alvarezmiz D，Bet-quer~iad MDA． Nunezgandolff G．Feramadez E．Calmllerotorres I．1ztragaescobar N． (2000)Humanized Versus Murine Anti—Humm't Epiddermel Growth— Factor Receptor Monoeloaal一,Matihed ies for lmmuno~eintigraphle Studies．~uelear bIediclne and B ．27(2)：199—206 5 Bmwn RE．Bemath AM，Levis GO，(2OOO)Her一2／Neu 15 P~aeln R~eptor P(mitive Breaa．q —Carcinoma—An Immunological Persp~-ti ve，Annals of Clinical and Laboralo~ Science ．30 3 J：249— 258 6 Chert Z．Ke LD，Yuen XH，Adievstorthz K，(2000)Co~elation of Cisplatln Se nsillvlt~ with Differential Aheralion ·1f EGFr Expression in Head aad Neck—Cancer Cells．Anticancer Re盹町℃h．20 (2A)：899—902 7 Cho JY．Y。0n JD，Kim JY．Y∞ E8．YuYH．P MH．(2000】 Hepatoproteetion by Hunmr, Epidermal Gm~lh —t'~lor (P,hEGF】 A捌 list Experimental Hepatitis Induced by D—Galaetosamine (D— Gain)or D —G n p。 y ch ，Bidogleat ＆ Ph~ eutieal Bulletin．23(10)：1243—1246 8 Patel N V．Acarregui J M．Sn ． *'der JM．Klein Mj，Sliwkowski It,LX，Kern JA，(2000)Neurngulln一1 aad Human Epidemaal Growth— Factor Receptor一2 en d Receplor一3 Play Role in HuInaII Lung Development in —Vilro．American Jourmal of Respirator-Cell Molecular Biology，22(4】：432—440． 9 SI p CJM．Weber W ．Nimtz M，Gallego RG，Kamerling JP， Vliegenthart JFG，(2000)Fuc~ylated Hybrid-Type N—Glycatrs on the Secreted Human Epidermal Growth —Factor Receptor from Swainsonine-Treated A431 Ce]ls．Archives 0f Bi~hemlstrv and Biophysics．374(1)：42—51 10 Strr'er L．(I988)Biochemistry．3rd ed．．w．H F~ nmn 叽d Company．New York． 11 Watson JD．Hopkins NH．Roberts JW，Steltz JA，Welner AM．(1987)Moleediar lliMogy 0f the c彻e．4th ed．．The Benjamin／ Cummings publishing C~ pany，Inc．，California． 12 Lee JY，Yoon CS，Chung IY，Lee YS， EK，(2t]00) S~lle—Up PT0cess for Expression Bnd Renatumtion of Recombinant Human Epidenmal G坤wI】】-Factor from Eseheriehla—Cofi Inclusion一 ／~dles．Rioteehnology and Applied Biochemistry ． ，31{JUN)：245—248 13 李建武，肖能庚，泉瑞元等．(1994)生物化学实验原理和方 法 ．北 京太学出版杜，北京 ．207~06． 14 Amemh~ Plutrmacia Biol~h(I998)．User Manual Hnieo~ Vemion3 0Edition AA．Uppsala．Sweden 15 ~ hagger H．Von Jng ow ＆ (1987)Tricjne~oodium ded ecyl sulfate-pelyaerylamlde gel electrephomsis for the sepa~ ion of proteins in the raage from 1 to 100 kDa．Adiytie,al Chemistry．，166： 368—37 16 童望字 (2001)^ 表皮生长因子工艺的应用基础研究．浙 江太学博士学位论文．杭州．29—36． 17 ng wY．Yao sJ．Zhu ZQ (2001)Separation elmmcteris— ties 0f human epidermal gro~h factor in ion exchange ehromatog- mphy vdth STREAMLINE DEAE resin，Chemical Engineering Se i— enee(Aeeepted) 1 8 童望字 ．蚺善径．束 自蛆．(2001)^ 表皮生长因子在凝腔层 析中的某些分离性质．化工学报(已接受) 维普资讯 http://www.cqvip.com