番鸭呼肠孤病毒和H9亚型禽流感病毒共感染对番鸭法氏囊和抗体产生的影响

番鸭呼肠孤病毒和 H9 亚型禽流感病毒共感染 对番鸭法氏囊和抗体产生的影响 林锋强 1,2，陈少莺 1,2*，朱小丽 1,2，程晓霞 1,2，王 劭 1,2，陈仕龙 1,2， 蔡 羲 1，李兆龙 1，马春全 3，赵佳荣 3 (1. 福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013；2. 福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013； 3. 佛山科技学院 生命科学学院，广东 佛山 528231) 摘 要：为探讨番鸭呼肠孤病毒(MDRV)和 H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)共感染对番鸭法氏囊免疫应答能力 的影响，本研究将 MDRV或 /和 H9 AIV人工感染 8日龄番鸭，观察法氏囊病理组织学变化，检测法氏囊 B细胞 增殖能力及 RE-5 AIV疫苗免疫后抗体变化规律。结果显示：H9 AIV感染组番鸭发病率低(10 %)，无死亡，法氏 囊无病理变化，显著抑制番鸭法氏囊细胞增殖反应；MDRV感染番鸭发病率 70 %，死亡率 40 %，生长迟缓，法 氏囊病理变化为萎缩，淋巴细胞减少，局部出现范围较小的坏死灶，番鸭法氏囊细胞增殖反应下降；共感染组番 鸭发病率 100 %，死亡率 80 %，番鸭生长迟缓，法氏囊萎缩和淋巴细胞增殖反应下降程度均比单一病毒感染组 严重。病毒感染使番鸭对 RE-5 AIV疫苗免疫应答能力明显下降，其共感染组抑制抗体应答程度最严重；共感染 组的病毒检出时间早于并且检出率大于单一病毒感染组。表明 MDRV与 H9 AIV共感染在番鸭免疫应答抑制方面 有协同作用。 关键词：番鸭呼肠孤病毒；H9流感病毒；法氏囊；免疫抑制 中图分类号：S855.3 文献标识码：A 文章编号：1008-0589(2012)02-0133-05 Influence of co-infection with muscovy duck reovirus and H9 avian influenza virus on bursa and antibody response in muscovy ducks LIN Feng-qiang1,2, CHEN Shao-ying1,2*, ZHU Xiao-li1,2, CHENG Xiao-xia1,2, WANG Shao1,2, CHEN Shi-long1,2, CAI Xi1, LI Zhao-long1, MA Chun-quan3, ZHAO Jia-rong3 (1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350013, China; 2. Fujian Animal Diseases Control Technology Development Center, Fuzhou 350013, China; 3. College of Life Science, Foshan University, Foshan 528231, China) Abstract: To investigate the pathogenicity and immune response of muscovy ducks to co-infection of muscovy duck reovirus (MDRV) and H9 subtype avian influnenza virus (AIV), eight-day old muscovy ducks were divided into 3 groups and artificially infected with MDRV, H9 subtype AIV alone or both, respectively. The pathogenicity of the viruses were evaluated by histopathologic examination of the bursa and proliferation ability of bursa cell, and antibody responses were tested in some of muscovy ducks from each group which immunized with H5N1 subtype Re-5 AIV vaccine post the virus infection. The results shown that the morbidity of ducks was low (10%) and no death in AIV infected group, but proliferation ability of bursa cells were obviously suppressed. Ducks infected with MDRV caused 70% morbidity and 40% mortality. Moreover, co-infection was induced 中 国 预 防 兽 医 学 报 Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine 第 34卷 第 2期 2012 年 2 月 Vol. 34，No.2 Feb. 2012 doi: 10.3969/j.issn.1008-0589.2012.02.13 收稿日期：2011-08-14 基金项目：福建省自然科学基金项目(2008J0061)；国家自然科学基金(30771620) 作者简介：林锋强(1976-)，男，福建福州人，副研究员，主要从事畜禽传染病和分子生物学研究. * 通信作者：E-mail：chensy58@163.com *Corresponding author 番鸭呼肠孤病毒病 (Muscovy duck reovirusis， MDR)和水禽流感 (Avian influenza，AI)均是近年新 出现的严重阻碍水禽饲养业健康发展的重要传染病[1]。 国内福建、广东和浙江等省份自 1997年以来一直有 MDR发生的报道 [2]，1998年以来水禽也由禽流感病 毒(AIV)的携带者和贮存宿主转变为 AIV 的高度易 感宿主 [3-4]。番鸭呼肠孤病毒(MDRV)为免疫抑制性 病毒，感染后引起水禽免疫器官坏死或萎缩等病 变，对免疫功能有抑制作用 [5-6]。H9N2 亚型 AIV 广 泛存在于世界各地，我国 1994 年在鸡中首次发现 H9N2亚型 AIV，目前绝大部分省市区均有 H9 亚型 AIV 流行，某些地区的养殖场 H9 AIV 阳性率达到 90 %以上 [7-8]。近年来研究发现 H9 AIV 能够引起鸡 和鸭的免疫抑制 [9-10]。因此，探讨 MDRV 和 AIV 共 感染情况下法氏囊形态和功能变化过程，为今后 MDR和 AI临床免疫预防程序的制定奠定基础。 1 材料和方法 1.1 病毒株 MDRV 强毒(MW9710 株)和 H9 亚型 AIV均由本实验室分离、鉴定并保存。 1.2 实验动物 1日龄未免疫任何疫苗雏番鸭购自 莆田广东温氏家禽有限公司。 1.3 主要试剂 RPMI 1640 购自 Gibco 公司；胎牛 血清购自 Hyclone 公司；LPS 和 MTT 购自 Sigma 公 司，分别用 RPMI 1640 配成 1 mg/mL和 5 mg/mL 冷 冻保存备用；淋巴细胞分离液购自上海恒信化学试 剂有限公司；重组 AIV 灭活疫苗(H5N1 亚型、Re-5 株 )由肇庆大华农生物药品有限公司生产 (批号 200801)；AIV H5亚型 HI抗原和阳性血清购自中国 农业科学院哈尔滨兽医研究所。 1.4 实验分组及设计 200 羽 8 日龄番鸭分为对照 组 (35 羽 )、 H9 AIV 组 (35 羽 )、MDRV (65 羽 )、 MDRV+AIV 组(65 羽)。对照组注射 0.2 mL Hank's； H9 AIV组以鸡胚尿囊液感染 0.3 mL/羽(口服 0.2 mL +腿肌注射 0.1 mL) (105 TCID50/ 羽)；MDRV 组以 1: 50 稀释的病毒原液腿肌注射感染 0.2 mL/ 羽 (103.8 TCID50/ 羽 )，MDRV+AIV 组按上叙剂量同时感染 MDRV 和 H9 AIV。感染后各组番鸭隔离饲养，每 组取 10羽每天观察并记录发病死亡情况。每组分别 于感染后 7 d 和 21 d 各取 15 羽按照重组 AIV 灭活 疫苗说明免疫 AIV灭活疫苗，0.5 mL/羽。 1.5 病毒感染对法氏囊重量的影响 各组番鸭在感 染后 7 d和 14 d称量体重及其法氏囊的重量。 1.6 病毒感染对法氏囊组织损伤的影响 感染后 5 d、 7 d、10 d无菌采集法氏囊，称重后以中性福尔马林 固定，石蜡切片，HE染色，观察病理组织学变化。 1.7 病毒感染对法氏囊细胞增殖的影响 感染后 7 d、 14 d、21 d 和 28 d，无菌采集法氏囊，分离法氏囊 淋巴细胞，调整细胞浓度为 5×106个 /mL。试验孔 每孔加 50 μL 细胞悬液和 50 μL 20 μg/mL LPS，对 照孔加 50 μL 细胞悬液和 50 μL RPMI 1640 完全培 养基，均设 3个重复，并设 RPMI 1640空白孔。40℃ 5 % CO2培养 60 h，各孔加入 10 μL MTT。加 150 μL DMSO 溶液显色反应 20 min，酶标仪检测各孔 OD570nm值。用刺激指数(SI)评价组间差异性。SI 计 算方法： SI= 试验孔 OD570nm平均值 - 空白孔 OD570nm平均 值 /对照孔 OD570nm平均值 -空白孔 OD570nm平均值。 1.8 病毒感染对 AIV 疫苗诱导抗体反应的影响 分别于第二次免疫后 7 d、14 d、21 d、28 d 采血分 离血清，采用血凝抑制法(HI)测抗 H5 AIV抗体，比 较试验组与对照组之间的差异。 1.9 病毒在法氏囊中的分布 感染后 1 d、3 d、7 d、 10 d、14 d、21 d、28 d，每组分别随机选取 3 羽鸭 无菌采集法氏囊组织，用 TRIzol 试剂提取病毒 RNA。根据建立的 RT-PCR 方法对样品进行 MDRV 检测 [8]，根据中华人民共和国农业行业标准 NY/ T772-2004 对样品进行 H9 AIV 检测。1 %琼脂糖凝 胶以出现约 300 bp 特异扩增条带为 MDRV 阳性， seriously the immune suppression and caused 100% morbidity and 80% mortality. Proliferation ability of bursa cells and immune responses to Re-5 AIV vaccine was also more obviously suppressed than that of other groups and the virus lasted longer in ducks than that of AIV and MDRV infection alone. Above all, infection with H9 AIV was able to aggravate the immunosuppression due to MDRV infection, therefore, co-infection of MDRV and H9 AIV had synergy effect on depressing immune responses. Our data revealed that MDRV played an important role in the occurrence and epidemic of waterfowl influenza. Key words: muscovy duck reovirus; H9 avian influnenza virus; bursa; immunosuppression 中 国 预 防 兽 医 学 报 2012年134 以出现 732 bp特异扩增条带为 H9 AIV阳性。 1.10 数据统计分析 采用 Microsoft Excel 软件进 行标准差和方差分析，不同组别的所有数据用 t 检 验确定差异显著性。 2 结 果 2.1 不同感染组对番鸭发病率和死亡率的影响 各 组番鸭感染后观察至感染后 28 d。AIV 感染组仅个 别番鸭一过性轻微发病，表现为精神差、不爱动， 无死亡；MDRV感染组的发病率为 70 %，死亡率为 40 %，表现为软脚、毛松、缩颈、拉稀、食欲下 降；而共感染组发病率为 100 %，死亡率为 80 %， 临床表现与 MDRV 组相似。表明 MDRV 和 H9 AIV 共感染提高了感染番鸭的发病率和死亡率，加重了 病情。健康对照组在整个试验观察期内均无异常反 应(表 1)。 2.2 不同感染组对法氏囊器官指数的影响 感染 AIV 组番鸭法氏囊器官指数与健康对照组比较差异 不显著；MDRV 组和共感染组番鸭法氏囊萎缩，法 氏囊器官指数均降低，并且共感染组法氏囊器官指 数显著低于 MDRV 组 (p<0.05)；表明 H9 AIV 感染 不影响番鸭免疫器官的发育，MDRV 对法氏囊的损 伤较大，共感染组法氏囊损伤最为严重(表 2)。 2.3 不同感染组对番鸭法氏囊的损伤程度 AIV感 染组番鸭法氏囊病理变化不明显，仅出现轻微的淋 巴细胞坏死和核碎裂等变化；MDRV 感染组番鸭法 氏囊损伤变化与共感染组相似。共感染组接种病毒 1 d 后，法氏囊结构尚完整清晰，部分淋巴滤泡中 淋巴细胞数量开始减少；接种第 3 d，大部分滤泡 淋巴细胞坏死，数量大量减少，出现很多空腔，局 部上皮细胞变性坏死；接种第 5 d～10 d，滤泡淋巴 仍以淋巴细胞减少为主，局部出现范围较小的坏死 灶(图 1~图 3)。 表 1 不同感染组番鸭发病率和死亡率 Table 1 The morbidity and mortality of muscovy duck in different infection groups AIV group MDRV group Co-infection group Control Number of inoculated ducks 10 10 10 10 Number of ill ducks 1 7 10 0 10 % 70 % 100 % 0 Number of dead ducks 0 4 8 0 0 40 % 80 % 0 Morbidity MortalityGroup 表 2 不同感染组对番鸭法氏囊器官指数的影响 (X±SD，n=5) Table 2 The effect of different infected ways on index of muscovy ducks bursa Days post infection (d) 7 14 Control AIV group MDRV group Co-infection group Control AIV group MDRV group Co-infection group 152.15±18.66 151.63±17.25 122.56±10.88 121.35±16.24 188.32±17.24 185.32±12.25 152.22±14.32 144.86±10.32 Bursa /Body weight 0.232±0.018a* 0.242±0.022a 0.152±0.014A 0.112±0.011Ab 0.188±0.032a 0.179±0.028a 0.133±0.012b 0.100±0.008Ac Body weightGroup *：同列数据肩注不同大写字母者差异极显著(p<0.01)，标有不同 小写字母者差异显著(p<0.05)，肩注小写字母相同或未标出者差异 不显著(p>0.05)。 *: Means with the different letters were significant at the p<0.05 level (a, b, c) or p<0.01 (A, B, C) level, with the same letters or no letter were significant at the p>0.05 level. 图 1 健康对照组番鸭法氏囊 Fig.1 Muscory duck bursa of control group 图 3 共感染组番鸭法氏囊(HE 100×) Fig.3 Muscory duck bursa of co-infection group (HE 100×) 图 2 MDRV组番鸭法氏囊(HE 100×) Fig.2 Muscory duck bursa of MDRV group (HE 100×) 林锋强，等. 番鸭呼肠孤病毒和 H9 亚型禽流感病毒共感染对番鸭法氏囊和抗体产生的影响第 2期 135 表 4 H5 AIV疫苗二次免疫后 HI抗体水平的变化 Table 4 The effect on HI antibody titer immunized by H5 AIV vaccine 2.4 不同感染组对法氏囊 B 淋巴细胞增殖的影响 病毒感染组番鸭法氏囊 B淋巴细胞刺激指数均明显 低于对照组，其中 7 DPI～21 DPI AIV 组与对照组 差异显著 (p<0.05)；共感染组、MDRV 组与对照组 差异极显著 (p<0.01)，与 AIV 组差异显著 (p<0.05)； 共感染组和 MDRV 组差异不显著 (p>0.05)。表明 MDRV 和 H9 AIV 均能抑制番鸭体液免疫中枢器官 法氏囊的 B淋巴细胞增殖功能(表 3)。 2.5 不同感染组对 AIV 疫苗 HI 抗体水平的影响 对照组番鸭禽流感疫苗二免后抗体效价上升，二免 后 14 d HI效价最高，维持在 9.2，随后抗体效价维 持在 8.0以上(表 4)。而 AIV感染组番鸭抗体效价上 升缓慢，抗体效价显著低于对照组(p<0.05)；MDRV 组番鸭二免后抗体缓慢上升，二免后 14 d HI 效价 与对照组差异极显著 (p<0.01)，与 AIV 组差异显 著 (p<0.05)；共感染组番鸭抗体效价均低于其他三 组，二免后 14 d HI效价与对照组差异极显著(p<0.01)， 与 AIV 组差异显著(p<0.05)，与 MDRV 组差异不显 著(p>0.05)。 2.6 不同感染组对 MDRV在番鸭法氏囊分布的影 响 MDRV 组番鸭病毒检出时间为 3 DPI～21 DPI， 共感染组番鸭病毒检出时间为 1 DPI～21 DPI。在 28 DPI MDRV 组和共感染组均未检测到病毒。因 此，共感染组的病毒检出时间早于 MDRV单独感染 组，而且检出率大于 MDRV单独感染组(表 5)。 2.7 不同感染组对 H9 AIV在番鸭法氏囊分布的影 响 H9 AIV组番鸭病毒检出时间为 3 DPI～14 DPI， 共感染组番鸭病毒检出时间为 1 DPI～21 DPI。在 21 DPI 后，H9 AIV 组番鸭不能检测到病毒；而共 感染组在 28 DPI后才不能检测到病毒。因此，共感 染组病毒检出时间早于 H9 AIV 单独感染组，而且 检出率大于 H9 AIV单独感染组(表 6)。 3 讨 论 近年来，流行病学调查表明 MDRV在我国番鸭 饲养过程中普遍存在，常引起番鸭其他细菌或病毒 的继发感染或并发感染，而且引起常规疫苗的免疫 效果不佳。陈志胜等研究表明 MDRV对雏鸭免疫器 官的细胞凋亡具有诱导作用，从而引起免疫抑制 [11]。 陈少莺研究表明 MDRV感染引起免疫器官法氏囊中 的部分淋巴细胞、浆细胞坏死和不同程度凋亡，并 且细胞溶解坏死形成大小不一的坏死灶并被大量增 生的吞噬细胞所吞噬，淋巴细胞数量明显减少，导 致番鸭免疫抑制 [12-13]，这与本研究结果相一致。本 研究表明番鸭感染 MDRV后，生长缓慢，法氏囊萎 缩严重，淋巴细胞数量减少；法氏囊细胞增殖功能 降低。法氏囊中淋巴细胞数量和功能的下降引起对 疫苗免疫应答的抑制。 表 3 番鸭法氏囊 B淋巴细胞增殖功能变化(X±SD，n=5) Table 3 The changes of B lymphocytes proliferation of the bursa in muscovy ducks AIV group MDRV group Co-infection group Control 7 d 1.28±0.11b 1.10±0.08Ac 1.08±0.08Ac 1.55±0.12a* 14 d 1.26±0.11A 1.04±0.06Bb 1.05±0.05Bb 1.65±0.16a 21 d 1.42±0.13b 1.21±0.11Ac 1.18±0.10Ac 1.78±0.16a 28 d 1.72±0.16a 1.50±0.12b 1.45±0.13b 1.85±0.15a Days post infection AIV group MDRV group Co-infection group Control 7 d 6.6±7.04 5.6±5.86 4.8±5.76 7.2±8.22 14 d 7.4±0.88b 6.0±0.72A 5.4±0.72A 9.2±1.20a* 21 d 6.6±0.86b 6.4±0.78b 5.6±0.68A 8.6±1.00a 28 d 6.8±0.72b 6.6±0.76b 6.0±0.68A 8.2±0.98a HI antibody titeration post 2nd immunization with H5 subtype AIV vaccineGroup *：同列数据肩注不同大写字母者差异极显著(p<0.01)，标有不同 小写字母者差异显著(p<0.05)，肩注小写字母相同或未标出者差异 不显著(p>0.05)。 * Means with the different letters were significant at the p<0.05 level (a,b, c) or p<0.01 (A, B, C) level, with the same letters or no letter were significant at the p>0.05 level. *：同列数据肩注不同大写字母者差异极显著(p<0.01)，标有不同 小写字母者差异显著(p<0.05)，肩注小写字母相同或未标出者差异 不显著(p>0.05)。 * Means with the different letters were significant at the p<0.05 level (a, b, c) or p<0.01 (A, B, C) level, with the same letters or no letter were significant at the p>0.05 level. 表 5 MDRV组和共感染组番鸭法氏囊中MDRV分布 Table 5 MDRV distribution in the bursa on MDRV- and co-infection groups Group MDRV group Co-infection group 1 d 0/3 1/3 28 d 0/3 0/3 21 d 1/3 2/3 14 d 2/3 3/3 10 d 3/3 3/3 3 d 2/3 3/3 7 d 2/3 2/3 Days post infection 表 6 AIV组和共感染组番鸭法氏囊中 H9 AIV分布 Table 6 H9 AIV distribution in the bursa of AIV- and co-infection groups Group AIV group Co-infection group 1 d 0/3 1/3 28 d ND 0/3 21 d 0/3 2/3 14 d 2/3 3/3 10 d 3/3 3/3 3 d 1/3 1/3 7 d 2/3 2/3 Days post infection Group 中 国 预 防 兽 医 学 报 2012年136 H9N2 AIV 能够造成雏鸡免疫抑制。H9 亚型 AIV 人工感染罗曼蛋鸡，在免疫器官中仅引起法氏 囊部分淋巴滤泡髓质区内的淋巴细胞轻度减少，表 明幼龄肉鸡感染 H9N2 AIV 可以产生免疫抑制 [14]。 人工感染的普通蛋鸡免疫器官中仅引起法氏囊部分 淋巴滤泡髓质区的淋巴细胞轻度减少 [15]。H9N2 亚 型 AIV人工感染樱桃谷肉鸭可以引起法氏囊明显的 病理组织变化，表现出不同程度的水肿、出血、淤 血、淋巴细胞溶解、坏死等一系列病变，导致感染 鸭免疫抑制[16]。而本研究结果表明番鸭感染 H9 AIV 后法氏囊无明显的病理组织变化，仅出现轻微的出 血，淋巴小结中的淋巴细胞坏死，核碎裂。这与李 静萍的报道不一致，这可能与不同品种鸭对 H9 AIV 易感性不同有关。但番鸭感染 H9 AIV 后淋巴细胞 增殖功能的降低引起诱导疫苗免疫后抗体能力降 低，表明 H9 AIV能够导致番鸭不同程度免疫抑制。 由于 MDRV 和 H9 AIV 对法氏囊均有一定程度 的免疫抑制，共感染后引发更为严重的免疫抑制。 本研究表明 MDRV 和 H9 AIV 共感染和单一病毒感 染相比，法氏囊萎缩严重，法氏囊淋巴细胞数量明 显减少，抑制 B淋巴细胞的增殖能力，进一步抑制 流感疫苗的免疫应答。MDRV 的感染导致宿主产生 免疫抑制，加重了 AIV的病理发生过程或抑制了宿 主对流感疫苗的有效应答。因此，在临床上应重视 MDRV引起的病理变化与水禽流感发生和流行之间 可能存在的关系，这将有助于指导水禽流感临床免 疫预防程序的制定。 参考文献： 胡奇林，陈少莺 . 番鸭呼肠孤病毒病研究进展[J]. 福建畜牧 兽医，2004，26(增刊)：7-9. 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