乳清蛋白酶改性综述

《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．1 乳清蛋白酶改性综述 赵晶 张睿 霍贵成 ‘ (东北农业大学食品科学学院， 哈尔滨 150030) 摘 要：乳清蛋白通过改性，可以加强其功能性质，从而合理利用资源，开发新产品，扩大在食品中的应用。 乳清蛋白的改性方法有化学改性、物理改性和酶改性。酶改性主要包括水解和交联。其中，用转谷氨酰胺酶改 性具有比较大的发展潜力。 关键词：乳清蛋白，酶法改性，转谷氨酰胺酶 Enzymatic Modification of Whey Protein (Food Science College，East—north Agriculture University，Harbin 150030) Abs嘣 ：hIlpr0vilflgwheylxoteinfunctionality caI1 be accomplishedby nlodi~cations，which utilize res0urces rationally，develop the new products and increase their food applications．Whey protein modification methods include chemica1．physical and enzy- nlstic techniques．Enzymatic modification includes hydrolysis and cross-ljnking．Among them，with mm．~ulaminase mDdi助Jlg has heavy development potentiality． Key words：Whey protein，Enzymatic nlodi~cation，Transglutaminase 1 引言 乳清蛋白质是从含水 93％的乳清中回收得来 的，它在乳清中的含量约 1．0％左右，占牛乳蛋 白 质总量的18～20％。乳清蛋白是一种高营养价值 的蛋白质 ，是可获得的营养最全面的天然蛋白质之 一 。 大多数乳清蛋白产品的蛋白质效价(PER值) 为3．1，超过了酪蛋白的PER值(2．5)，仅次于鸡蛋 蛋清的 PER值(3．9) J。一般认为当某蛋白质的 PER值超过 2．5时，则被认为是高营养优质蛋白 质 2。通过比较示蛋白质营养价值常用的三种 指标：蛋白质效价(PER)、生物价和蛋白质净利用 率(NPU)，乳清蛋白比其他几种来源的蛋白质更优 越[3l。 表 1 乳清蛋白的营养价值 科学研究证实乳清蛋白不仅易于被消化吸收， 而且其必需氨基酸含量高于其它食用蛋白质，组成 也完全符合或超出 FAO／WHO要求。虽然乳清蛋 白质在乳清中的含量很少，但是世界上乳清的年产 量相当高，仅 1999年全球乳清的排放量就约为 1．5讹 吨，其中美国液态乳清供应量为 3500万吨， 新西兰为 500万吨，加拿大为 400多万吨，澳大利 亚300万吨左右L4J，而且目前仍然在不断增加，但 其利用率却不高，仅占一半左右，如果能够将这些 乳清加以合理处理，特别是乳清蛋白质的利用 ，将 给人类带来一个数量可观的优质蛋白质来源。因 43 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 c}li腿 F00d Additives 20o4 No ． 1 此，工业发达国家非常重视乳清的再利用问题，近 些年来，随着膜技术和离子交换技术的完善，乳清 利用技术有了很大的进步。目前，估计有超过 35 种不同类型的乳清制品可应用在食品、饲料、药品 和化妆品工业[ 。主要产品见表 2： 表 2 主要乳清制品的优点及用途 一 些国家已具备较强的乳清处理能力。如荷 兰处理量达 95％，超过美国的70％，英国和独联体 为50％左右。即便如此，世界上尚有 40～50％的 乳清不能被再次利用 6，以废水形式排放，由于乳 清中乳糖含量较高，消耗水中的溶解氧所造成的环 境污染比污泥大得多，严重污染了环境 ]。因此， 合理开发利用乳清蛋白，对于保护环境，有效利用 廉价资源，创造经济效益，具有重大意义。 2 乳清蛋白质的改性研究现状 蛋白质是由各种氨基酸相互联接而构成的具 有空间结构的生物大分子。蛋白质的功能性质主 要分三类：(1)水化性质，包括水吸收及保留、湿润 性、溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。由蛋白 质肽链骨架上的极性基团与水分子发生水化作用。 (2)与蛋白质 一蛋白质相互作用有关的性质，包括 产生沉淀作用、凝胶作用和形成各种其他结构(如 蛋白质面团和纤维)。蛋白质分子受热舒展，内部 的疏水基团暴露出来，通过疏水作用(高温能提高 此类作用)、静电作用(通过 ca2 和其他二价离子 桥接的)、氢键(冷却能提高此类作用)或二硫交联 形成空间网状结构。(3)表面活性，包括表面张力、 乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有亲水基 又有亲油基，能够吸附在油 一水或空气 一水界面 上，一旦被界面吸附，蛋白质形成一层膜，可阻止小 液滴或气泡聚集，有助于稳定乳化液和气泡。这些 功能特性在食品中常被应用。 蛋白质的功能特性与其结构有关，即氨基酸组 44 成、排列顺序、构象、分子的形状和大小、电荷分布 以及分子内和分子间键的作用。高比例的极性残 基影响肽链间相互作用、水化作用、溶解性和表面 活性，疏水性相互作用在蛋白质三级折叠中相当重 要，它影响乳化作用、起泡性和风味结合能力。带 电氨基酸能增强静电力相互作用，起到稳定球蛋 白，结合水分的作用，以及水化作用、溶解度、凝胶 作用和表面活性。巯基(sn)能被氧化成二硫键， 硫醇和二硫化物的相互转化会影响流变特性。共 价键和非共价键的性质和数量决定了蛋白质的大 小、形状、表面电荷 J。所有这些性质又受 pH、温 度等环境因素及加工处理的影响。乳清蛋白质改 性就是用生化因素(如化学试剂、酶制剂等)或物理 因素(如热、射线、机械振荡等)使其氨基酸残基和 多肽链发生某种变化，引起蛋白大分子空间结构和 理化性质的改变，从而获得较好功能特性和营养特 性的改性乳清蛋白质。 乳清蛋白改性方法主要有：化学改性、物理改 性、酶改性及混合改性法。 化学改性和物理改性(非酶法改性)是 目前常 用的乳清蛋白改性技术，由于其反应简单、应用广 泛和效果显著的特点而倍受欢迎。但非酶法改性 也存在着反应条件苛刻，试剂专一性不强，最终产 品中除去未反应试剂较困难等不足之处；目前国内 外很多科研人员都在进行酶法改性的研究，使该法 得到了很大的发展，酶促反应速度快，条件温和，专 一 性强，更重要的是一些低廉微生物酶的出现 J。 用酶对乳清蛋白进行改性主要分为两种方法：水解 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 C 眦 F A( ti es 2004 No．1 和交联。 2．1 酶法水解 通过酶部分降解乳清蛋白的多肽骨架，增加其 分子内或分子间交联或连接特殊功能基团，可以改 变乳清蛋白质的功能性质[9,10]。部分降解常用蛋白 酶，其最直观的表现是溶液粘度下降，乳清蛋白分子 量降低，在酸性或等电点附近的溶解性提高。水解 后的乳清蛋白热稳定性、乳化力和起泡力提高，而凝 胶形成能力、乳化稳定性和泡沫稳定性下降。这是 因为水解使多肽含量增大，它们有较高的热稳定性 和界面能力，但明显缺乏稳定界面的能力。但酶解 后水解液的功能性质与原料、酶种类、水解度等有 关。若在酶解液中加人羧甲基纤维素(CMC)，可以 提高乳化稳定性和泡沫稳定性[10]。利用乳清蛋白 部分水解物的完全可溶性，可用于强化酸性饮料或 桔子汁。张和平等(1994)发现，用胰蛋白酶水解，使 乳清中的热敏性乳清蛋白变为热稳定的可溶性多肽 混合物，然后以此为母液生产乳清饮料。胰蛋白酶 水解的最适pH为8．0，最适温度为40℃经36h水解， 乳清中蛋白质分解率可达56％以上，水解后乳清中 可溶性含氧化合物达0．39％。以此为母液生产的乳 清饮料具有良好的稳定性。 2．2酶法交联 蛋白酶通过类蛋白反应(Plastein reaction)人为 地引人交联键可使蛋白质发生交联，产生具有良好 流变学性质的聚合物，并改善蛋白质的功能特性， 这在质构化食品中非常有用。也可以利用其他非 蛋白酶使蛋白质磷酸化和硫醇化。酶法改性对蛋 白质的凝胶特性和吸水性有较大的影响。转谷氨 酰胺酶(Transglutaminase，TGase，E．C．2．3．2．13)、 过氧化物酶(POD，E．C．1．11．1．7)、漆酶(E．C．1． 10．3．2)和多酚氧化酶(PPO，E．C．1．14．18．1)能使 蛋白质产生交联作用【11,12J。其中转谷氨酰胺酶是 最早，也是应用最广泛的交联乳蛋白质的酶。蛋白 质经 TGase改性后其胶凝性、塑性、持水性、水溶 性、稳定性等会得到一定程度的改善[B 。 3 转谷氨酰胺酶对乳清蛋白的改性 3．1 转谷氨酰胺酶的酶学性质 转谷氨酰胺酶一词是 Waelsch及其合作者在 1959年首次提出的，Waelsch[16]等用它来描述豚鼠 肝及别的组织中需 Ca2 激活的一种转胺基作用。 目前，研究或工业用的 TGase有下面几个来源：一 是从动物(猪、牛、鱼、豚鼠)的组织、体液或屠宰血 液中提取；二是采用转基因的方法，如将豚鼠肝脏、 鱼的TGase基因转入到大肠杆菌中，人的 TGase因 子基因转人到酵母中，培养基 因工程菌来生产 TGase；三是大量筛选能产生 TGase的微生物，用传 统的发酵方法生产，这是最可能开发成商业应用的 一 种转谷氨酰胺酶生产方法。已报道茂原链轮丝 菌(Streptoverticillum mobaraense)的一个变种具有较 高的产酶能力，此外还有链轮丝菌属的肉桂链轮丝 菌、灰肉链轮丝菌、s一8112以及链霉菌属的一些 菌株可以产生转谷氨酰胺酶。不同来源的 TGase 性质有所差异，由于微生物转谷氨酰胺酶 (MT． Gase)应用较多，因此对其性质的研究也较为深入。 表 3 不同来源的转谷氨酰胺酶的性质 *未查得 MTGa~的活性不依赖 Ca2 ，而豚鼠肝脏的转 谷氨酰胺酶对 Ca2 具有依赖性。食品中蛋白质如 酪蛋白、大豆球蛋白、肌蛋白都对 ca2 敏感，在 45 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．1 Ca2 存在下易沉淀，对酶的反应性降低，MTGfltse对 Ca2 的不依赖性使其应用起来更加方便。大多数 金属离子对该酶活性无影响或影响不大，但 Zn2 具有很强的抑制作用【17 ；该酶活性易受 PCMB、N 一 乙基 一顺丁烯二酰亚胺抑制，而 EDTA可消除其 活性【18]。大多数蛋白质可作为 MTGfltse的底物，特 别是牛乳中的酪蛋白、a一乳白蛋白、B一乳球蛋白、 脂肪球膜蛋白等都是 MTGase作用的良好底物。 3．2 转谷氨酰胺酶的作用基理 转谷氨酰胺酶是一种催化酰基转移反应的转 移酶，具有交联聚合、脱酰胺化和一级胺引进等 3 种反应机理。酰基供体为蛋白质或多肽链上谷氨 酰胺(Glu)残基的 7一羟基酰胺基，受体可以为蛋 白质肽链上赖氨酸(Lys)残基的￡一氨基，游离氨基 酸的 ￡一氨基，初级氨或水【19 J，在分子内及分子间 形成 ￡一(7一Glu)Lys(简称 G—L)交联键(如图 1)。 转谷氨酰胺酶对乳蛋 白质的改性作用表现在改善 凝胶特性、提高乳化性、提高热稳定性、制备可食用 膜几个方面。在乳制品加工中，乳清蛋白较难形成 凝胶，TGase可催化乳蛋白质的分子内或分子间形 成G—L共价键，从而明显改善蛋 白质的功能特 性。由于引人了新的共价键，蛋白质分子内或分子 间的网络结构增强，会使通常条件下不能形成凝胶 的乳蛋白形成凝胶 ，或使凝胶特性发生很大改变。 表现在：凝胶的强度提高；凝胶的耐热性、耐酸性增 强；凝胶的水合作用增强，使凝胶网络中的水分不 易析出。在制作凝胶状食品和蛋白质改性时，可对 这种蛋白质问的交联反应进行活用。 l l A f 一 f N O O 1 l B Gl—f_- 。一 f 。“州 O O l l c f 『_- 一f f_-NHR斗 O O 注：A蛋 白质分子间交联 B蛋白质分子脱酰胺化 C蛋白质分子的一级胺引进 图 1 转谷氨酰胺酶催化反应示意图 TGase作用于蛋白质后，一方面使蛋白质分子 之间发生交联，形成网络状结构；另一方面会使谷 氨酰胺脱酰胺而进一步使氨基酸侧链的亲水性增 46 强。这两种变化都有可能导致蛋白质的持水性增 加[20]。乳球蛋 白由于结构较紧密，不易被 TGase 作用，但空间结构散开之后，也可被催化交联。通 过加人还原剂，如二硫苏糖醇、半胱氨酸，破坏二硫 键或提高 pH，都可解散乳球蛋白的空间结构。大 多数描述谷氨酸残基与赖氨酸残基交联的方法是， 需要额外添加还原剂，如二硫苏糖醇(dithiotreitol， 叩 )。因为加人 UIT后，天然球蛋 白中的二硫键 被还原，蛋白质的空间结构被展开，使 TGase更易 于接近底物蛋白，从而提高反应速率，使得酶作用 下的交联反应发生[21]。乳清蛋白中的 a一乳白蛋 白[21 J和 8一乳球蛋白就可以在 哪 的存在下进行 酶的交联。但是由于 UIT不是食品级的，所以在 应用于食品当中时应考虑其它还原剂，如半胱氨酸 和亚硫酸盐。这些还原剂也可以使乳清蛋白发生 TGase的交联反应，但比 UIT存在下的交联反应速 率要慢很多[22]。除了加还原剂方法外，还有另外 两种方法。一种就是加热法，当温度达到二硫键断 裂的时候，酶交联的反应就会发生。因此，在食品 加工中可用热变性或蛋白质二硫键异构酶使蛋白 质变性 ，再加人 TGase。另一种方法就是提高 pH， 随着 pH的增加蛋白质的结构发生变化，当 pH达 到 8．5～9．0时蛋白质空间结构部分展开就会发生 酶交联反应，而在此 pH值下 TGase仍然具有活 性[ 。 目前 TGase已被用于 B一乳球蛋白、酪蛋白、大 豆球蛋白、小麦麦谷蛋白的交联作用，以及不同食 品蛋白间，如肌球蛋白、大豆蛋白、酪蛋白或谷蛋白 问的交联作用。前面提到的其它交联酶，如过氧化 物酶(POD)及漆酶，这两种酶可以催化阿魏酸氧化 交联，使甜菜果胶形成凝胶 ，这种凝胶是热不可逆 凝胶。其中如使用过氧化物酶，则需同时加人过氧 化氢，而使用漆酶则不需要加人过氧化氢，因为漆 酶可以利用溶解在体系中的氧u 。此外多酚氧化 酶(PPO)已被用于改善蛋白质的功能特性，它可以 氧化面筋蛋白中的巯基，使面筋蛋白发生交联L8 J。 a】mann[23]用该酶在咖啡酸的存在下，催化乳清蛋 白中的 a一乳白蛋白和 8一乳球蛋白形成分子内或 分子间交联。 3．3 酶改性蛋白质的营养价值及安全性 在蛋白质改性中，一个值得注意的问题是其对 乳蛋白质营养价值及安全性的影响。 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．1 转谷氨酰胺酶天然存在于各种畜肉、鱼虾中， 在肉类的烹调过程中，这些内源性TGase会使肉类 蛋白质之间形成 ￡一(7一谷氨酰)赖氨酸键。因 此 ，蛋白质经转谷氨酰胺酶作用后，在食用上是安 全的。牛乳中不含转谷氨酰胺酶，乳蛋白质经转谷 氨酰胺酶作用后，会在分子内或分子间形成 L—G 键，其他部分不会有什么改变，L—G键形成后是否 会影响乳蛋白的营养价值是人们关心的问题。 胃肠道中的消化液可把蛋白质分解为氨基酸， 但不能分解 L—G键，谷氨酰 一赖氨酸二肽到达肾 脏后 ，可被其中7一谷氨酰环化转移酶分解为赖氨 酸和5一羟脯氨酸，5一羟脯氨酸进一步转化为谷 氨酸 J。最近研究表明，在小肠刷状缘细胞、肾 脏、血液中存在7一谷氨酰转移酶，谷氨酰一赖氨 酸二肽进入到小肠刷状缘细胞中，可被其中的7一 谷氨酰转移酶分解，形成赖氨酸和谷氨酸。因此可 以认为，乳蛋白质经 TGase作用，形成 L—G键共价 交联后，在人体内能被消化吸收，不会降低乳蛋白 的营养价值。动物饲养试验也发现，大白鼠饲喂经 TGase处理的酪蛋白与饲喂天然酪蛋白相比较，其 增重、蛋白质效率、蛋白质生物价均相同，通过分析 大白鼠的尿液和粪便证实有 99％的 L—G基团被 动物吸收。 4 酶法改性应用前景 酶法或化学法改性食品蛋白质，是提高食品功 能特性的重要途径。在改变结构和功能性方面，化 学法比酶法更有效。比如化学改性中的乙酰化、磷 酸化、糖基化等，都有利于提高蛋白质的功能特性。 但酶法更有优于化学法改性的特点：酶源更易于得 到，成本相对可以接受，应用更安全，并且可将蛋白 质改性到所期望的功能特性。这也是采用可大量 生产的微生物酶进行酶改性的原因。 目前 ，无论发达国家或发展中国家都对新型食 品的研究给予越来越多的重视，所谓的新型食品， 是指必须满足或具有营养价值高、质地结构好、口 感好、安全卫生、外表美观、贮存期长和抗过敏等特 点的食品。由于酶法在生产过程表现出的反应条 件的温和性和副产物少的专一性，因此采用酶技术 生产或改造新型食品具有很重要的发展潜力。 参考文献 1．包怡红．功能性乳清的综合利用．食品与机械，2001(1)：9～11 2．王文智．乳清产品及其在食品中的应用．食品工业，1998(1)： l8～20 3．美国乳品出口协会．美国乳清蛋 白的应用研究和最新进展． 中国食品添加剂，l998(3)：26—32 4．1999年世界乳业概况．中国乳品工业。1999。5 5．V．L．gra~ 功能性乳清制品和新型保健食品配料的乳清 产品及其新组分．中国乳品工业 ，1999，8：32～37 6．汪家琴，李克杰．乳清酿酒的研究．中国乳品工业 ，1992，20 (6)：243～245 7．[美]0．R．菲尼马著，王璋等译．食品化学．中国轻工业出版 社，199l，279～300 8．李丹，崔凯．食品蛋白质的改性技术．食品与发酵工业，1999， 25(6)：58～62 9．Cherry J．P．ACS．Symp．Ser．147．Am．(：hem．S0c．wa~a．gto．．D． C．，1982，149 10．Whitaver J．R．Adv．(：hem．Ser．160．Am．(：hem．S0c．w~ a．gto． D．C．。l977，95 l1．Damodaran S．ParafA．Food Proteins andTheir ic Ⅱls．New York：MareelDekker，1997 12．NorskerM．and Jens~ M．et a1．Enzymatic gellllioll of sugar oectin in food products，Food hydrocollids，2OOO，14：237～243 l3．叶丹英，彭志英，赵谋明等．转谷氨酰胺酶及其在食品加工 中的应用．郑州粮食学院学报，2OOO，21(2)：46～49 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