双歧杆菌及寡糖类双歧因子研究

《中国食品添加剂》 China Food Additives 20I No．2 双歧杆菌及寡糖类双歧因子研究 杨东升 (海南大学 理工学院生物工程教研室， 海口570228) 摘要：本文研究了双歧杆菌的一系列特性及在医学领域的广泛应用，阐述了双歧因子对双歧杆菌的促生长 作用及其作用于人体的生理功能，介绍了双歧杆菌和双歧因子的研究进展情况。 关键词：双歧杆菌，双歧因子，非消化寡糖(NDO~)，研究 Researching of Bifidobacterium and Bifidus—Factors (Bio-engineering staffroom of Technology College，Hainan University，Haikou 570228) ~ ：'llais pflt~r have studied the characteristics of bitidobacterium and the widely application in the medical field．Intro— dIloedthefln~on ofBitldusfactors(BF)pI瑚lxItiI1gthe growth ofbifidobacterium andthe physicalfunctions ofBF．The devel— ol~nent of reseaI℃IliIlg bifidobacterium and Bitldus factors also being reviewed． 1【ey m -"Bitldobacterium，Bifidus factors(BF)；Non-digestible oligosaecharides(NDOs)，Research 1 概述 1．1 生物学特性 双歧杆菌(Bifidob aeterium)归于放线菌科双歧 杆菌属(Bifidobacterium Orla—Jensen 1924，472)。革 兰氏阳性双歧杆菌属呈多形态，有分枝，无动力，严 格厌氧，耐酸。目前共有 29个种，其中 l0个种与 人类有关，如青春双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧 杆菌、短双歧杆菌等。双歧杆菌主要寄居的微生态 空间是胃肠道。双歧杆菌与其他人类胃肠道寄居 的400余种肠内菌群一样，随年龄推移而发生变 化。双歧杆菌在婴儿、成人肠道菌群中占很高比 例，在婴儿尤为突出。双歧杆菌在宿主出生和断奶 前的数最多，到中年保持一个恒定的水平，到老年 则明显减少。双歧杆菌的消长与大肠杆菌、肠球 菌、乳杆菌和梭菌增加相适应。双歧杆菌菌在大肠 中起重要的调节作用，控制 pH，对抗外源致病菌的 感染。 1．2 致病性 在正常情况下，双歧杆菌对人体无害。但在某 20 些特定状态下，这些厌氧菌作为条件致病菌可导致 内源性感染，甚至会危及生命。比如当人体抵抗力 下降或因外科手术，改变了人体内生态环境时，可 能会导致双歧杆菌象其它正常菌群一样侵入肠道 以外的脏器或组织，引起内源性感染。曾有一 例因外科手术感染双歧杆菌，导致定位转移而致伤 口感染。另外齿双歧杆菌(B．denfium)与龋齿和牙 周炎有关，但其致病作用仍不明确。 1．3 双歧杆菌在肠道内存在的机制 双歧杆菌在肠道存在的机制是定植与粘附。 定植：定植是正常肠菌群在宿主的特异性定位 定居与繁殖的微生态学现象。它是正常菌群对宿 主产生生态效应和发挥生理作用的前提条件。新 生儿出生时，肠道是无菌的。在出生后 2小时左 右，在胎粪内就可检出双歧杆菌，但其数量很少，可 能是从口腔食人或从肛门进入。在出生后第 3天 开始迅速增加，到第7天达到高峰，成为新生儿的 优势菌。 粘附：双歧杆菌通过粘附多糖体与肠上皮细胞 壁通过生物化学作用产生的特异性的粘附，形成亚 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．2 优势菌群而定居下来，并形成与肠壁密切相联系的 细菌生物膜，产生各种代谢产物，从而对宿主发生 生态效应和生理作用。如双歧杆菌能改变上皮细 胞受体位点，从而导致对其他微生物菌群的粘附抑 制。双歧杆菌胞外酶能降低致病菌或其毒素的特 异性位点。 1．4 微生物学检查方法 双歧杆菌的培养与其它无芽胞厌氧菌培的培 养步骤一样。应在厌氧环境中进行接种(如厌氧手 套箱等)。采用营养丰富、新鲜，含有还原剂的培养 基或特殊培养基、选择培养基中，最常用的培养基 是牛心脑浸液为基础的血平板。接种后置于 37。C 厌氧培养 2～3天，如无菌生长，继续培养至 1周。 挑取生长菌落接种两只血平板，分别置于有氧和无 氧环境中培养，在两种环境中都能生长的是兼性厌 氧菌，只能在厌氧环境中生长的才是专性厌氧菌。 获得纯培养后，再经生化反应进行鉴定。此外，利 用气液相色谱检测细菌代谢终末产物能迅速作出 鉴定，需氧菌和兼性厌氧菌只能产生乙酸，而检测 出其它短链脂肪酸，如丁酸、丙酸则提示为厌氧菌。 核酸杂交、PCR等分子生物学方法已可对一些重要 的无芽胞厌氧菌作出迅速和特异性诊断。 2 双歧杆菌在微生态平衡中的重要作用 2．1 双歧杆菌的营养作用 喂养方式对新生儿肠道菌群演替有重要影响， 肠道菌群因喂养方式的不同而出现明显差别[1．2]。 母乳中存在着双歧因子(普遍认为是一种寡糖)能 促进双歧杆菌的生长发育。双歧杆菌的存在又在 许多方面利于婴儿的生长发育。从营养学角度，双 歧杆菌的意义不可忽视：它在维生素 B族的产生， 对蛋白质、碳水化合物、脂质代谢以及 Ca2 、Fe2 和维生素 D的吸收等方面都起到不可忽视的作 用。 2．2 一些疾患的辅助治疗 急性腹泻：应用双歧杆菌配合抗生素调整肠菌 群治疗感染性腹泻取得效果 3。双歧杆菌对腹泻 病原菌如致病性大肠、志贺菌属、其他革兰阴性杆 菌及葡萄球菌等的抑制作用是通过双歧杆菌对肠 菌群结构的改变、降低肠内容物的 pH、改变上皮细 胞受体位点等间接方式抑制致病菌，实现治疗目 的。 慢性腹泻及便秘：慢性腹泻的主要原因是肠菌 群持续性菌群失调，双歧杆菌减少，可通过口服双 歧杆菌，增加其绝对数量，以改善肠道功能、降低 pH、扶植正常肠道菌群。曾有一例慢性腹泻患者 通过服食自体粪便稀释液成功治愈的报道，证实人 粪便中可检出双歧杆菌，通过适当处理可用于补足 自体肠道双歧杆菌。 肝脏病：肝炎、肝硬化患者，胆汁成分不足导致 下消化道革兰阴性杆菌上行，固有菌体破坏释放出 大量内毒素，侵害肝脏。此时配合口服双歧杆菌， 可抑制革兰阴性杆菌，减少内毒素分泌，达到减缓 症状的目的。 另外，通过口服双歧杆菌，抑制致病菌可治愈 皮肤炎、复发性1：3腔炎、湿疹等 3。 3 双歧杆菌的非特异性免疫增强和调节作用 双歧杆菌通过粘膜的刺激，一直起着免疫激活 作用，使宿主保持对各种肠道传染病的防御作用。 双歧杆菌还可增强免疫球蛋白Isa的产量，同时能 增强抗毒素的产量，双歧杆菌具有免疫佐剂作 用[4l。 3．1 应用于抗肿瘤辅助治疗 双歧杆菌在人体内发挥着生物学屏障、抗突变 及抗肿瘤等多种重要的生理功能L5．6 J。这些生理 功能通过对嗜中性细胞、巨噬细胞、NK细胞及调节 免疫活性细胞的激活，以及诱导各种重要的细胞因 子发挥作用。 3．2 作为抗肿瘤基因治疗的导向载体 利用双歧杆菌专性厌氧特性和实体肿瘤的瘤 体内氧分压偏低的特征，双歧杆菌成为肿瘤的基因 治疗的一个十分理想的导向载体。1998年，徐根 兴将抑制血管生长的人内皮抑素基因转入双歧杆 菌，研制出转基因双歧杆菌口服制剂，并迅速试用 于临床。经305例多种类型实体瘤病人志愿服用， 显示出明显的抑癌效果，没有发现毒性反应。徐根 兴实验室进一步研制人内皮抑素转基因双歧杆菌 针剂，用于实体肿瘤的介入治疗。从前期动物实验 的结果看，瘤体内坏死严重，残余瘤组织中几乎找 不到血管，与对照实验动物相比，差异十分明显。 4 双歧因子(Bifidus factors，BF)的研究应用 4．1 双歧因子的种类及特性 初乳对新生儿肠道菌群的影响是通过初乳中 2l 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．2 特有的成分实现的。初乳中含的一种低聚糖物质 即双歧因子，双歧因子促进双歧杆菌生长。半乳糖 寡糖(Galacto—oligosacchrides，GoS)被证明是母乳 中的重要组分[ 。半乳糖寡糖是 』3一半乳糖苷酶 在水解乳糖的过程中通过转糖苷作用合成的低聚 糖[0， ，它是在乳糖的半乳糖一侧又结合上了 1—4 个分子的半乳糖的结合糖，分子式为(Ga1)n，含单 糖数 2—6，半乳糖之间以p(1—3)、p(1—4)、p(1— 6)键相联，其中以』3(1—4)键为主【10,11 3。 随着研究的深入，人们还发现了一系列促进双 歧杆菌生长的功能性低聚糖(Oligosaccharide)或称 寡糖。包括水苏糖、棉籽糖、乳酮糖、低聚果糖、低 聚木糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖和低聚龙胆糖 等。人体肠胃道内没有水解这些低聚糖的酶系统， 因此它们不被消化吸收而直接进入大肠内优先为 双歧杆菌所利用。它们都有以下几个特点：1、在哺 乳动物胃肠道的上部，不能被水解及吸收；2、只能 选择性地对肠内双歧杆菌进行刺激生长繁殖或激 活代谢功能；3、能起到增强宿主机体健康的作用。 这些非消化寡糖(NDoS，Non—digestible oligosaccha- tides)由于其不能被消化且对肠内细菌有促生长的 作用所以被认为是双歧因子的一种即寡糖类双歧 因子。 4．2 双歧因子(BF)的作用机制及生理功能 双歧因子促有益菌增殖生长的机理还不清楚， 有人认为有益菌的细胞表面可能具有 NDOs的受 体，NDOs也是细菌细胞壁粘肽的成分，缺乏此类物 质则细菌细胞壁的合成将会受阻，生长繁殖受到抑 制。还有研究报道，双歧杆菌对 NDOs的利用必须 要有其所产生的水解酶的辅助。大多双歧杆菌属 都能产生促糖酵解的酶，能水解各种单糖和不同类 型的糖苷键。但是在同一个肠内微生态环境中不 同的细菌活性有所不同，如双歧杆菌中促糖酵解酶 的活性要高于乳杆菌属、埃希氏杆菌和链球菌属。 4．2．1 饮食对双歧杆菌的影响 当功能性寡糖到达肠的下段的时候他们就能 被细菌所利用从而对寄主和结肠细菌产生不同的 生理作用。肠道中的微生物具有选择性利用不同 寡糖的能力。因此，人们认为食物中碳水化合物的 组成对肠道菌群的组成起着决定性作用。一项调 查中发现，饮食结构对双歧杆菌生长的影响是很大 的。1、主食的影响：据日本的调查，吃精米者双歧 22 杆菌少，吃粗米者多，双歧杆菌在进食普通饮食人 群的体内较多；2、肉菜比例的影响：多吃蔬菜的人 双歧杆菌多，在高比例进食高脂肪、肉类的人群中 双歧杆菌减少。有一项更直接的调查结果：长寿老 人与一般健康老人相比较，肠道内双歧杆菌数量较 后者多。 4．2．2 双歧因子对双歧杆菌生长的影响 王筱兰[ ]用半乳糖三寡糖和半乳糖四寡糖纯 品，添加到培养基中在体外培养双歧杆菌和喂食小 白鼠，验证GOS在体内、体外对双歧杆菌生长的影 响。 体外实验：直接把半乳糖三寡糖和半乳糖四寡 糖添加到硫乙酸盐液体培养基中，能使菌体浓度比 对照组分别提高3．5倍和4．0倍。体内试验：喂食 了半乳糖三寡糖的小鼠，盲肠内双歧杆菌数比对照 组高出了35倍。因此，通过体内、体外试验都验证 了半乳糖寡糖是一种双歧因子，具有 』3一半乳糖苷 酶，能分解利用半乳糖寡糖，能高效专一地促进双 歧杆菌的生长繁殖。 4．2．3 双歧因子的生理功能 4．2．3．1 很难或不被人体消化吸收。可在低能量 食品中发挥作用，最大限度地满足了那些喜爱甜品 又担心发胖者的要求，还可供糖尿病人、肥胖病人 和低血糖病人食用。 4．2．3．2 活化肠道内双歧杆菌并促进其生长繁 殖。双歧杆菌是人体肠道内的有益菌，其菌数会随 年龄的增大而逐渐减少，直至老年人临死前完全消 失。因此，肠道内双歧杆菌数的多少成了衡量人体 健康与否的指标之一。随着医药科学的突飞发展， 广谱和强力的抗菌素广泛应用于治疗各种疾病，使 人体肠道内正常的菌群平衡受到不同程度的破坏， 有目的的增加肠道中有益菌的数量显得十分必要。 摄取入功能性低聚糖来促使肠道内双歧杆菌自然 增殖显得更切实可行。 4．2．3．3 不会引起牙齿龋变，有利于保持口腔卫 生。龋齿是由于 口腔微生物特别是突变链球菌 (Streptococcus mutans)侵蚀而引起的，功能性低聚糖 因不是这些口腔微生物的合适作用底物，因此不会 引起牙齿龋变。 4．2．3．4 属于水溶性膳食纤维，具有膳食纤维的 部分生理功能。能降低血清胆固醇和预防结肠癌 等。 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o4 No．2 4．3 双歧因子的研究现状 功能性低聚糖因具独特的生理功能而成为一 种重要的功能性食品添加基料，己引起全世界广泛 的关注。目前，13本在这方面的研究、开发与应用 位居前列，己形成工业化生产规模的低聚糖品种达 十几种，1990年的总产值就达4．6亿美元，成为功 能食品基料的一大支柱。在 日本，功能性低聚糖替 代或部分替代蔗糖而广泛应用在饮料、糖果、糕点、 冰淇淋、乳制品及调味料等450多种食品。 4．3．1 乳酮糖 乳酮糖为白色不的结晶粉末，相对密度 1．35，熔点 169℃，易溶于水，其甜度仅为蔗糖的 48％ 60％，且带有清凉醇和的感觉。日本市场上 己有含量在 50％以上的糖浆产品。乳酮糖的制取 一 般采用碱液处理将乳糖异构化，异构化反应是在 氢氧化钠溶液中进行的，用硼酸盐作催化剂。此 外，也可用酶法异构化来制取乳酮糖。 4．3．2 大豆低聚糖(Soybean oligosaccharide) 大豆低聚糖广泛存在各种植物中，以豆科植物 含量居多，除大豆外，扁豆、豌豆、绿豆和花生等中 均有存在。典型的大豆低聚糖是从大豆籽粒中提 取出可溶性低聚糖的合称，主要成分为水苏糖 (Stachyose)、蜜三糖(Ramnose)和蔗糖(Sucrose)。 4．3．3 低聚果糖(Fructooligosaccharide) 低聚果糖是指在蔗糖分子的果糖残基上结合 l一3个果糖的寡糖，，又称寡果糖或蔗果三糖族低 聚糖。存在于日常食用的水果、蔬菜中，如牛蒡 (3．6％)、洋葱(2．8％)、大蒜(1．0％)、黑麦(0．7％) 和香蕉(0．3％)等。天然的和微生物酶法得到的低 聚果糖几乎是直链状，在蔗糖(GF)分子上以8(1— 2)糖苷链与 l一3个果糖分子结合成的蔗果三糖 (GF2)、蔗果四糖(G )和蔗果五糖(GF4)，属于果糖 和葡萄糖构成的直链杂低聚糖。据报道，日本的玉 米制品公司还生产出具有支链的果糖低聚糖【13 J。 工业生产上一般采用黑曲霉(Aspergillus niger) 等产生的果糖转移酶作用于高浓度(50％ 60％) 的蔗糖溶液，经过一系列的酶转移作用而获得低聚 果糖产品。为了消除低聚果糖生产中葡萄糖的阻 遏作用，韩国J0Ilg won Yun等使用添加果糖转移酶 和葡萄糖氧化酶的混合酶系统生产低聚果糖，结果 底物蔗糖充分利用，得到了含量高达 98％的低聚 果糖[14'l 5l 4．3．4 低聚乳果糖(Lactosucrose) 低聚乳果糖是以乳糖和蔗糖(1：1)为原料，在 节杆菌(Arthrobacter)产生的B呋喃果糖苷酶催化 作用下，将蔗糖分解产生的果糖基转移至乳糖还原 性末端的cl位羟基上，生成半乳糖基蔗糖即低聚 乳果糖。 商业化生产的低聚乳果糖产品包含37％低聚 乳果糖、28％蔗糖、l3％乳糖、17％的葡萄糖及果糖 和5％其他糖，甜度约为蔗糖的 70％。在 日本，这 种产品已于 1991年推向市场。该糖在 日本经急性 毒理试验和致突变试验等证实是安全无毒的。 4．3．5 低聚半乳糖(Galactooligosaccharide) p一低聚半乳糖是由p一半乳糖苷酶作用于乳 糖而制得，是在乳糖分子的半乳糖一侧连接上 l一 4个半乳糖，属于葡萄糖和半乳糖组成的杂低聚 糖。低聚半乳糖的热稳定性较好，即使在酸性条件 下也是如此。自然界许多霉菌和细菌都可产生 B 一 半乳糖苷酶，如嗜热链球菌 (Strptococcus ther． mophilus)、黑曲霉(Aspergillus niger)各米曲霉 (As． pergillus oryzae)。日本研究开发的一种以蜜二糖为 主要成份的a一低聚半乳糖，方法是先将乳糖用 B 一 半乳糖苷酶水解获得葡萄糖和半乳糖的混合液， 再以此混合液为底物通过 a一半乳糖苷酶进行缩 合反应而生成。 Snow Brand乳制品公司从干酪清中生产唾液 寡糖，这种低聚半乳糖的结构比原有的寡糖更能促 进体内双歧杆菌的增殖【13 J。 4．3．6 低聚异麦芽糖(1somaltooligosaccharide) 低聚异麦芽糖又称分枝低聚糖(Branching Olio． gosaccharide)，是指由葡萄糖以a(1—6)糖苷键结合 而成的单糖数在2 5不等的一类低聚糖。自然界 中低聚异麦芽糖极少以游离状态存在，而作为支链 淀粉、右旋糖和多糖等等的组成部分，在某些发酵 食品如酱油、酒或酶法葡萄糖浆中有少量存在。低 聚异麦芽糖的制取是以由淀粉制得的高浓度葡萄 糖浆为反应底物，通过葡萄糖基转移酶催化作用发 生a一葡萄糖基转移反应而制得。Gunei化学工业 公司申请了阳离子交换法纯化异麦苗芽低聚糖的 专利。日本 Fuokuuezu K．K公司采用水／有机溶剂 系统法生产异麦芽寡糖【13 J。 5 展望 双歧杆菌和双歧因子其特有的生理功能已被 23 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2004 No．2 广泛应用于医学和功能性食品等领域。对双歧杆 菌来说，它的应用范围已从最初的营养、辅助治疗 发展到目前的作为基因载体治疗实体肿瘤，可以说 实现了很大的飞跃。而双歧因子是实现食品保健 功能的重要因子，由于其无毒、无副作用、无残留及 较好的稳定性，在食品加工过程中结构和性质不会 改变，成为理想的食品添加剂。目前有待研究的是 发现双歧杆菌能够选择性利用双歧因子的机制结 合人体肠道微生物菌群生态的研究，以期使双歧因 子能在医疗方面发挥更大的优势作用。 参考文献 1．Ycshilm H，Iseki K，ruiira K．Develolxnent and difference of in— tcstinal flora in the neolqlats]period in breast-·fed and bottle-rod in·- fants．Pediatrics，1983；72(3)：317—321． 2．SinfanA， Ilglasm，Dmsar[IS，Sonthil1．IF．Effect 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