蛋白酶水解驴皮制备多肽口服液的研究

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 No．1 蛋 白酶水解驴皮制备多肽 口服液的研究 陆晓滨 董贝磊 赵祥忠 刘庆军 (山东轻工业学院食品与生物工程学院，济南250100) 摘要：本文以驴皮为主要原料，研究了不同蛋白酶的水解情况，用正交实验确定了A．$1398中性蛋白酶最佳 水解工艺条件，并对制得的富含多肽的水解液的脱苦、脱腥及沉淀等问进行了探讨。 关键词 ：酶，水解 ，多肽 ，正交实验 The Study of the Preparation of Oral Polypeptide Fluid by the Hydrolysis of Donkey Skin with Proteinases Lu Xiaobin，Dong Beilei，Zhao Xiangzhong，Liu Qingjun (School of Food and Boiengeering of Shandong College of Light Industry，Jinan 250100) Abstract：The hydrolysisofdonkeyskinwithdeferent proteinaseswasstudied．Theoptimal hydrolysis conditionwaSde— termined wi th neutral proteinases A．S1398 by o~thogoml experimental design．The hydrolytic polypeptide was ob- tained．The debitter and destinkingofthe hydrolysisfluidandthe precipitationwere also studied． Key words：Proteinases，Hydrolysis ，Polypeptide，Orthogonal experimental 现代生物学实验证明，多肽与蛋白质和氨基酸 相比具有更多优点：多肽在肠道中的吸收率最好， 一 些低肽如二肽、三肽的吸收速度比同一组成的氨 基酸快⋯1；多肽具有低抗原、促进脂质代谢、降低 胆固醇、促进矿物质吸收、降血压、抗氧化等生理功 能【2，3 ；一些多肽具有强化机体免疫、促进人体新 陈代谢的作用[ ；多肽具有较好的酸、热稳定性、 水溶性 ，而且粘度随浓度变化迟钝l5J5。目前 多肽 产品的研究主要集中在酪蛋白和水解大豆方面，以 动物皮为原料开发的多肽产品较少。其中，阿胶产 品中含有较多的多肽，它能促进血中红细胞和血红 蛋白的生成，具有补血、止血、滋阴润燥等作用l6J6。 这种产品在食用过程中常出现一些问题，如块状阿 胶熬煮时间长 ，易发生焦糊现象；阿胶 口服液也带 有一定的焦糊味 ，而且粘稠、口感差 ，这些问题都严 重制约了阿胶产品的进一步开发。本文利用酶法 水解驴皮，解决了上述产品存在的问题，开发出一 种口感好、营养价值高、食用方便的多肽产品。 1 材料与方法 ： 1．1 材料 ： 驴皮：市场购得； 木瓜蛋白酶 ：广东江门生物技术中心生产； A．S1398中性蛋 白酶：无锡市酶制剂厂生产； 胰蛋白酶：济南维尔康肉联厂提供； p一环状糊精 ：山东禹城保龄宝公司生产 ； 其它试剂均为纯。 1．2 方法： 总蛋白质含量的测定[ ]用微量凯氏定氮法。 1．2．2可溶性蛋白含量的测定 可溶性蛋白含量的测定采用 Folin酚法 8(稀 释 20倍)。 作用机理主要是蛋 白质中的肽键与碱性铜盐 产生双缩脲反应，同时也由于蛋白质中存在的酪氨 酸与色氨酸同磷钼酸试剂反应产生颜色 ，呈色强度 与蛋 白质含量成正 比。首 先配制 Folin酚 甲、乙 液，混匀后于室温放置 30min，以水做参照，在 64Onto处 比色 ，绘制曲线 ，得到回归方程。再 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 No．1 将驴皮水解液稀释适当倍数后 ，移取 0．5ml，按照 标准曲线制作的步骤操作。最后在 640nm处比色 测定，由回归方程计算得到对应蛋白含量。 1．2．3低分子肽含量的测定 低分子肽含量的测定采用磷钼酸沉淀法[9] (稀释 20倍)。 驴皮酶解液经 100"(2水浴灭酶 5min后取 10ml 置于 25ml容量瓶中，加 7．5ml水及 lml钼酸钠溶 液，定容，摇匀。置 20℃水浴中保温 15--20min，加 入 lml相对体积质量为 1．4的硫酸，加水至刻度， 摇匀 ，立 即用折叠滤纸重复过滤至澄清。取滤液 lml稀释适当倍数后，移取 0．5ml用 Folin酚比色 法测定低分子肽含量。 低肽含量(％)= Folin酚测定的低肽量 蛋 白量 ×稀释倍数 ×100 1．2．4水解度的测定 采用 TCA法【9 J(稀释 30倍)。 取 5ml酶解物加入 5ml 20％TCA，混合振荡 ， 4000r／rain离心 15rain。取上清液 ，作适当稀释 ，总 蛋白和上清液中可溶性蛋 白含量分别用微量凯氏 定氮法和 Folin酚法测定。 ClH(％)= (N2一N1)／(N0一N1)×100 式中：DH为水解度 ；N2为驴皮酶解液中 10％ TCA可溶性蛋白(ug)；N1为反应前驴皮蛋白液 中 10％TCA可溶性蛋白(ug)；No为驴皮蛋 白中总蛋 白(ug)。 1．3 水解方法 将驴皮上附着的脂肪、毛发刮净 ，清洗后切成 冉 小块，用绞肉机绞碎，称取一定量的驴皮，用胶体磨 精磨两遍(料 ：水 =1：5)，加蒸馏水至一定的体积 ， 置恒温水浴器上加 热至指定温 度并恒温。配置 lmol·L 的 NaOH 和 lmol·L-1的 HCl溶液 ，用 pH 自动调节器调整 pH始终在蛋白酶的最适 pH， 加入一定量 的蛋 白酶，开始水解 。记 录水解 时间 t，反应至设定时间后，煮沸 5min灭酶活。冷却后 8000r·min 离心分离 15min，取上清液。分别测 定可溶性蛋白含量、低分子肽含量及水解度。 2 结果与讨论 2．1最佳水解用酶的确定[10·ll】 本实验采用的蛋白酶有三种 ：胰蛋白酶、木瓜 蛋白酶、A．S1398中性蛋白酶。三种酶实验条件的 选择见表 1所示。 表 1 不同蛋白酶水解驴皮的条件 *为每 g底物中酶活单位 U 在不同时刻分别取 5mL水解液 ，测定水解度 ， 结果见图 1。 0 30 60 90 l20 l50 l80 2l0 240 270 时阅 (Iin) 图 1 酶的水僻度曲线 图 — ◆-_术瓜量白奠 + 中性置白蠢 + 胰量白奠 印 仰 {弓 {己 5 0 ^ 蔓 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 No．1 从图 1的水解度曲线上可以看出，木瓜蛋白酶 的水解度最低 ，A．S1398中性蛋白酶次之 ，胰蛋 白 酶的水解度最高。从水解液外观看，胰蛋白酶、A． S1398中性蛋白酶的水解液外 观相似 ，腥臭味轻、 稍有苦涩味；木瓜蛋 白酶的水解液有腥臭味，苦涩 味重。从实际生产考虑，胰蛋 白酶价格昂贵 ，不适 合规模化工业生产 ；木瓜蛋 白酶价格适中，但水解 效果较低 ；A．S1398中性蛋 白酶的价格低廉 ，酶解 条件温和(温度 45℃，pH7．0)，水解效果适中，适于 工业化生产 ，故本实验选择 A．S1398中性蛋 白酶 作为水解驴皮的最佳工具酶 。 2．2 A．S 1398中性蛋 白酶 最佳水解 条件 的确 定[12】 本实验的目的是制备多肽 口服液，水解过程中 适当控制水解度得到较多的多肽是技术关键 。以 低分子肽含量为指标 ，进行三 因素 (A底物浓度、B 中性蛋 白酶用量、C水解时间)三水平正交实验 L9 (3 )，正交实验结果及极差分析见表 2、3。 表 2 正交试验水平因素表 因素 试验号 低肽含量／％ 31．91 38．57 39．55 10．64 12．86 13．18 2．54 36．18 36．89 36．96 12．o6 12．3O 12．32 O．26 37．51 35．72 36．8O 12．30 11．91 12．27 O．39 10．97 10．58 10．36 11．96 13．19 13．42 13．25 13．12 13．18 从表 3可以看出各因素对低分子肽含量影响的 主测 I哽序为：A> C>B，最佳条件为 、 、 。分 析结果可以得出：在一定的水解时间内，低分子肽含 量随着底物浓度和酶量的增加而增加，达到一定值 后增加趋势变缓，原因是粘度上升降低了酶的活性； 在一定的底物浓度和酶量下，低肽含量随着水解时 间延长呈上升趋势，达到一定数值后反而降低，这是 由于水解时间延长，多肽继续水解生成氨基酸的原 因。因此应适 当控制水解度，以获得较多的多肽。 同时，水解时间适 当缩短 ，既可以缩短生产周期，提 高产量，又可以更好地避免微生物的侵染。 2．3 水解液后处理研究 用 A．S 1398中性蛋白酶水解驴皮制得的水解 液仍然带有苦味和腥味，水解液过滤后放置一段时 间仍会出现沉淀，严重影响多肽口服液的质量，因 此需要对水解液进一步的处理。 2．3．1澄清处理 对水解液沉淀物化验分析 ，发现沉淀物成分主 要为蛋白质 ，可能是由于水解液中残留的未水解的 可溶性蛋白质随时间的延长逐渐沉淀所造成的。 实验中采用等电点沉降法进行处理，较好地将 水解液中的可溶性蛋白质除去，效果非常理想。具 体操作为水解结束后，用适当的柠檬酸调整水解液 的pH到 4．5左右，此时可溶性的蛋白质逐渐絮凝 并沉淀下来 ，静止 30分钟后过滤 ，然后用 NaHCXh 调 pH到 6．0。得到的水解液杀菌后放置 6个月 ， 底部无沉淀物出现。 2．3．2脱苦处理 水解液中的苦味主要来 自苦味肽——由某些 疏水基或疏水性氨基酸构成 的苦味物质。苦味直 接影响食品的风味和 口感 ，往往决定了活性肽的应 用前景。本实验采用参考文献[13]的方法，经过多 次实验，采用 p一环状糊精(p—CD)结合柠檬酸的 掩盖法 ，对水解液脱苦明显。实验结论 ：在澄清后 的水解液中添加 0．2％的 p—CD、0．05％的柠檬酸 液、0．5％的蛋 白糖，对脱苦有明显的效果。 2．3．3脱腥处理 驴皮水解液前处理时残留的部分脂肪 ，在水解 过程中发生氧化反应产生腥臭味 ，采用水解前脱腥 和水解后包埋可有效脱除腥味。水解前处理：尽量 将驴皮去脂彻底，并与胡萝 b、白醋、白酒同时煮沸 5分钟 ，胡萝 卜可以吸收部分腥味成分，白醋、白酒 23 C 3 —1 2 3 2 3 1 3 1 2 B 2 —1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 —1 1 1 2 2 2 3 3 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 u s}k 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 No．1 可去除部分腥味；水饵后处理 ：调配多肽口服液时 ， 加入适量的柠檬酸、糖、可以掩盖部分腥味 ；同时加 人 p—CD可以包埋腥味。 3结论 以驴皮为主要原料 ，用 A．S1398中性蛋 白酶 水解处理，水解温度 45℃、时间 1．卟、底物浓度 9．0％、酶用量 7000U／g。用蛋白质等电点沉降法 解决了水解液的沉淀问题；在水解液 中添加 0．2％ 的 p CD、0．05％的柠檬酸液、0．5％的蛋白糖明显 地去除了水解液的苦味和腥味。这种多肽 口服液 中低分子肽含量≥1．3％。产品澄清透明、无沉淀、 口感较好。 通过动物试验 ，观察驴皮多肽 口服液在补血、 壮骨及促进钙吸收方面的作用 ，与阿胶对照未显显 著差别(P>0．05)，对贫血大 白鼠周围血象有 明显 的效果 ，作者将以另文进行讨论。 参考文献 1．赵新淮 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制潮流，符合中国实际，具有中国自身特点，并且可 用于指导中国食品生产企业进行科学、安全加工的 重要工具和手段，建立具有中国特色的“食品加工 的安全评估和危害控制(SafetyAssessmentonFood Processing and Hazard Control，SAFPHC)”模式、规 范、体系及其法规。 令人关注的是 ，中国认监委于 2002年 3月 20 日发布了《食品生产企业危害分析与关键控制点 (HACCP)管理体系认证管理规定》，国家鼓励从事 生产加工出口食品的企业建立并实施 HACCP体 系 ，对肉品、水产品、果汁等列人产品的企业是 强制性要求。相信，将会有更多的产品被列人 HACCP强制执行的。 因此 ，为加强我国农产品深加工食品工业企业 的食品安全控制体系建设，促进国内农产品深加工 企业与国际接轨，提升我国加人 WTO以后农产品 深加工企业的国际竞争力，我 国要进一步推动 HACCP在我国农产品深加工食品工业中的应用。 参考文献 1．梁杰 ．食品生产企业 HACCP体系实施，中国农业科学 出版社，北京 ，2002 2．吕晓莲 ，贾建会 ，王熊 ，刘诚 ．我国食 品企业应尽 快建立 HACCP体系，食品科学，2002，23(7)：141—145 3．沈志远 ．酿造食醋 HACCP体系的建立 ，食品科学，2002，23 (8)：320—324 维普资讯 http://www.cqvip.com