二氧化硫在红葡萄酒中的抗氧化性研究

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2o03 No．5 二氧化硫在红葡萄酒中的抗氧化性研究 王 华 李 华 郭安鹊 (西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100) 摘 要：系统地阐述了二氧化硫 (so2)在红葡萄酒生产中抗氧化性的研究状况。通过大量的文献分析认为 ，二 氧化硫在红葡萄酒中并不能表现出抗氧化特性。因此 ，寻求新的红葡萄酒抗氧化剂就成为主要的研究方向之一。 关键词 ：二氧化硫 ，红葡萄酒 ，抗氧化剂 Study on the Antioxidant Properties of Sulfur Dioxide in Red W ine W ang Hua，Li Hua，Guo Anque (CoBege of Enology，Northwest Sci—Tech University of Agriculture and Forestry， YansUng Shaanxi，712100) Ab! 阳ct：3"ne review of research advances of antioxidant properties of sulfur dioxide in red wine makes us consider that the sul— fur dio)dde could not express effects of an antioxidant in red wine．and s0 it would be very importm~t to search new types of all— tioxidants to pmtect red wines． Key words：Sulfur dioxide，Red wine，Antioxidant 饮用适量的葡萄酒对人体健康十分有益，葡萄 酒特别是红葡萄酒中丰富的类黄酮物质能有效地 清除体 内自由基 ，舒张血管 ，抗菌消炎，抗病毒 ，抗 心脏病，抗癌等_1 j。二氧化硫在葡萄酒中具有多 种功能 ，主要表现为防腐灭菌和抗氧化作用 ，近来 也有研究表明其对葡萄皮中花色素苷有较强的提 取效果H~5j。但过量 的 so2不但影响 了葡萄酒 的 风味，而且也影响了人体的健康_6~8j。世界卫生组 织(WH0)一直要求降低食品中so2的浓度，国际葡 萄与葡萄酒组织 (orv)和各国都了葡萄酒 中 so2的最高限量 j。美国 FDA(美国食品药物管理 局)把 so2从食 品添加剂“GRAS”(一般认为安全) 一 类中去除，并规定如果产品中游离 so2含量超过 10ppm，必须在标签上 注 明 so2的含 量【l0j。在我 国，按照 GB／T15037的规定 ，游离 so2被划为 B类 不合格 ，当一个葡萄酒中其它项 目完全合格而仅仅 游离 soz超标时，该酒将被划为不合格l11j。近来 国内外有关少用或不用 so2生产优质葡萄酒 的报 道较多_10~1引。但关于 So2在红葡萄酒中作为抗氧 化剂的多项研究表明：在规定添加量的前提下 ，so2 在红葡萄酒 中不能表现出抗氧化性 ，而酒中原有的 成分特别是 酚类物质 比 so2吸收及消耗氧更快。 因此 ，找到一种新型的抗氧化剂，这在红葡萄酒的 抗氧化方面很有意义。 1 葡萄酒中 SOz的作用基础 1．1 S02的溶解性 so：常温下为气体，易溶于水。20~C时，1体积 水溶解 4JD体积 so2；10~C时 1体积水溶解 55体积 so2，而同条件下的 o2、N2、co2相应 的溶解度要小 得多。温度对 so2溶解度影响很大 ，当饱和溶液从 IO~C升温到 20℃时，可能释放 出大约 50mg／L so2 (或 1体积 so2溶液释放出 15体积气体 so2)。 1．2 葡萄酒中 so2的变化 1．2．1葡萄酒中 so2的离子化 so2溶 于水 中 为 中强 度酸 ，pKa为 1．77和 7．20，在葡萄酒中有溶剂作用和解离作用。在类似 葡萄酒条件(体积分数 14％乙醇溶液中，离子强度 31 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 8mmol／L时 so2的解离 )下，这一常数接近 2．0，在 饱和 so2的水溶液中 pH约 0．8(20~C)。当 pH低 于 1．86时，主要为分子态 so2；pH为 1．86—7．18 (即在葡萄汁和葡萄酒中)时 ，主要是一级电离形式 亚硫酸氢根离子(HSO3一)；pH高于 7．18时，主要 为二级电离形式亚硫酸根离子(S030一)。也有其它 离子如 Sa050一的报道 。 1．2．2葡萄酒中 so2的存在形态 1．2．2．1游离 so2 游离 so2主要包括 l{S 一、so30一以及相应的 盐、溶解态 so2即分子态 so2。 (1)分子态 so2在葡萄酒 中，分子态 so2最重 要，它对于微生物活力的抑制 ，防止酒的变质 ，以及 与过氧化氢结合检测酒的“灼烧”感都有重要作用。 在葡萄酒 pH范 围内，这种游离 so2很少，并且随 pH和 温度有很 大变化：pH3．0时 so2为 6．O％， pH4．0时 so2为 0．6％，相差约一个数量级 ；当温度 增加 2OclC，so2的挥发性增加 1倍【 J。 (2)so30一具有抗氧化作用。在葡萄酒 pH范围 内，其浓度非常低，一般为 1～3banol／L，即使在稍 高 pH的环境中，由于浓度较低 ，其在葡萄酒 中消 耗溶解氧的能力受到了限制。 (3)HSO3一在葡萄酒 pH范围内(3．0～4．0)，该 种形式 的游离 so2占总游离 so2的 94％ ～99％， pH4．5时达最 大值。酿酒专家认为 ，这种形式 的 so2可能恰 恰是最不需要 的，因为它参与 了与 乙 醛 、糖、酮酸以及红葡萄酒花色苷的结合【16]。 1．2．2．2结合态 so2 (1)so2与糖的结合 在发酵基质中，so2可与 糖化合物形成不稳定化合物。 (2)so2与乙醛的结合 so2与乙醛生成相对 稳定的乙醛亚硫酸，可以除去过多乙醛产生的过氧 化味。so2与 乙醛 的反应速度要 比其与糖 的反应 速度快得多。当亚硫酸 、乙醛 和葡萄糖 同时存在 时 ，so2优先与 乙醛结 合，最后才与葡萄糖发生反 应 [1 。 (3)sth与花色素的结合 生成无色的不稳定 物质 ：亚硫酸色素化合物。当有乙醛存在时 ，该不 稳定化合物分解 ，重新释放出 so2[ ]。 因此，so2在葡萄酒 中存在多种形态，因而受 到了多种因素的影响(如糖、色素、细菌、氧、pH、温 32 2o03 No．5 度等)，尤其是 pH和温度的影响。同时 ，游离 so2 只占很少的一部分 ，大部分 so2以结合态存在。 2 红葡萄酒中 SO2的抗氧化性 传统的红葡萄酒生产工艺 中通常 以 so2作为 抗氧化剂。1974年“食品法规中的抗氧化剂”对抗 氧化剂所下定义是“任何能推迟 、妨碍或阻止因氧 化而引起食品酸败或变味的物质” 。so2在红葡 萄酒中的抗氧化性 ，一般认为是 so2对葡萄酒中氧 化酶活性的抑制及对溶解氧的较快消耗。而越来 越多的研究对此提 出质疑，并一致认为：在规定添 加量的前提下 ，so2在红葡萄酒 中几乎表现不出抗 氧化性 ，而酒中的酚类物质比 S02更易于吸收且消 耗酒中的溶解氧。 2．1 S02对氧化酶活性的抑制 so2具有还原作用 ，能抑制葡萄酒 中多种氧化 酶的活性 ，从而抑制酶促氧化。多酚氧化酶是葡萄 酒中的主要酶类 ，主要来源于葡萄原料，并以酚类 物质为氧化底物l18,20]。S02对酶的抑制机制 ，目前 尚不清楚，可能是 so2不可逆地与醌生成无色加成 物；与此同时 ，降低 了酶作用于一元 酚和二羟基酚 的活力，从而推迟了褐化_2 j；也可能是 so2与酶直 接作用_l 。Boulton等_l 6_认为，亚硫酸氢根形式的 二氧化硫使多酚氧化酶不可逆的失活并抑制了其 活性 。葡萄中的多酚氧化酶主要是酪氨酸酶和漆 酶。近年研究表 明：酪氨酸酶对 so2很敏感 ，发酵 前轻微地通气或加入 so2便可破坏其活性 J。但 是漆酶活性较强，溶解性强 ，且对 so2水平不敏感， 它以花青素及其前体为底物 ，在发酵后的葡萄酒中 仍会起作用【16,20j。但也有报道，酶在消耗酚类物 质的同时本身也被破坏【20]。因此 ，发酵后的红葡 萄酒 中，以非酶氧化为主。 2．2 so2对非酶氧化反应的抑制 在葡萄酒中存在着多种易氧化组分(如亚铁离 子、亚硫酸、抗坏血酸、多酚物质和乙醇)，但是氧化 的难易程度不同。通常认为 so2在葡萄酒 中有极 强的嗜氧性 ，与葡萄酒中的其它组分相比，它们容 易与氧发生反应而被氧化为硫酸或亚硫酸，进而推 迟其它组分的氧化 J。但在红葡萄酒中越来越多 的试验研究对此提出了新的看法。 与氧反应的 so2是亚硫酸根(S030一)形式，在 葡萄酒 pH条件下它 的量极少。它进行的氧化还 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 No．5 原反应为 ： so3。一+H20 H SO4。一+2H +2e— Eo= 一0．08V 1／202+2H +2e—H H2O Eo=1．229V 根据以上反应，lmg氧消耗 4mg二氧化硫，但 实际上葡萄酒 中氧的消耗要高得多。Poult0n[ ]模 拟葡萄酒条件下的亚硫酸氧化研究表明：s02 消耗 饱和氧浓度一半大约用 30天，而白葡萄酒消耗饱 和氧的一半需 2天，红葡萄酒需要的时间更少。结 果是葡萄酒 中游离 s02 实际并不具备耗 氧能 力。 葡萄酒条件下 (pH3．0～4．0，ll0g／L乙醇)亚硫酸 反应动力学研究【16]也表明：二氧化硫几乎不具备 耗氧能力；而在此 pH下 ，抗坏血酸与氧反应 的速 率比二氧化硫与氧反应的速率几乎快 1700倍。 利用氧化还原电位理论，一个化合物的氧化还 原电位是它对电子亲和力的量度，氧化还原电位是 相对于氢来测量 的，因此，一个正的氧化还原电位 就表示这个化合物与氢相比有更大的亲和力 ，而且 将会从氢接受 电子。一个负的氧化还原 电位则表 示该化合物对电子有较低的亲和力，这样，这个分 子就会把电子供给氢【24]。亚硫酸与抗坏血酸的被 氧化能力相似 ，但低于酚类物质。 抗坏血酸 一 脱氢抗坏血酸 +2H +2e— Eo= 一0．06V 儿茶酚 H 1，2苯醌 +2H +2e— E0=一0．792V 由上反应，酚类物质氧化的氧化还原电位低于 亚硫酸氧化的氧化还原电位 ，理论上则更易氧化。 但 Boulton等【16J认为短时间内以上反应程度往往 受反应速率的影 响，而不是受氧化 一还原 电位 的 影响。 一 项试验在研究温度 28012～49℃条件下灌装 后的红葡萄酒和白葡萄酒颜色变化和总二氧化硫 的变化时发现：红葡萄酒中总 s02 的损失速度比白 葡萄酒的损失速度快 2～3倍，而损失过程 中的活 化能却不同。研究者认为：这说明红葡萄酒和白葡 萄酒总 s02 损失 的限速反应不 同。并对总 s02 的 可能损失途径进行了分析 ：(1)气体经过软木塞挥 发损失；(2)s02 被瓶中氧气氧化损失；(3)生成强 键结合的亚硫酸加成物，分析时一部分不水解；(4) 已经氧化的酚类物质缓慢氧化亚硫酸。而正常条 件下 ，s02 损失途径(1)并不重要 ；途径 (2)则较慢 ； 途径(3)主要是亚硫酸与醌生成加成物，且已经证 明许多不饱和羰基化合物与其生成不可逆的磺酸 加成物 ；最重要的是途径(4)：葡萄酒中酚类化合物 的氧化产物起初将受反应相对速率而不是其氧化 还原反应强度的控制 ，但是后来则出现类似烯醇式 的重排反应 ，这些反应更接近于从反应平衡考虑的 模式。于是，许多迅速生成的氧化产物随后将与其 它组分进行还原反应 ，这些也包括氧化速率并不快 的酚类和亚硫酸。这就是葡萄酒 中的酚类物质的 自氧化过程 ，整体上表现为葡萄酒本身的自动氧化 现象 ，目前关于葡萄酒中酚类物质的自氧化机制已 经得到了证明【16J。因此，长时间储存条件下 ，实际 上已排除了葡萄酒进一步氧化的过程，有可能出现 重排反应。已经氧化的酚类物质氧化亚硫酸 ，其结 果是生成硫酸和使总二氧化硫损耗。同时，这也将 延缓醌式酚类物质的缩合，使得棕色色素产生，正 如白葡萄酒中出现的情况一样。 另外 ，葡萄酒中酚类物质自氧化过程中产生了 大量的过氧化氢 ，而乙醇在葡萄酒中的含量十分丰 富，过氧化氢首先将乙醇氧化为乙醛 ，二氧化硫和 氨基酸也能够被氧化。葡萄酒中过氧化物的形成 可能导致在不存在亚硫酸的情况下，乙醛浓度有相 应的增加。与氧和亚硫酸的反应不同，过氧化氢在 pH较低时与分子形式的亚硫酸反应，而不是与离 子形式 的亚硫酸反应。Wildenradt等[25j已经证实 在模拟葡萄酒条件下 ，当没食子酸和抗坏血酸在有 游离 s02 存在时被氧化 ，过氧化物与 s02 的反应对 限制乙醛生成有影 响。P0ntaJJie 26 J也在试验 中观 察到：当游离 s02 超出 35～40mg／L时，其对葡萄酒 中乙醛的产生有影响。 近期 的多项 试 验研 究也 证 明 了上述 结论 。 Fab 27,28]利用生物耗氧量(BOD)法测定葡萄酒中 各组分对氧的吸收，该法允许葡萄酒中的主要耗氧 物质问建立一种氧化平衡 ，试验结果表明：多酚是 酒中氧的主要吸收物质 ，其次是 s02、乙醇和乙醛。 Vivas和 Gloriest驯通过对添加和未添加 s02(50mg／ L)的不 同红葡萄酒耗氧能力的比较 ，结果两者对 于酒中溶解氧的消耗几乎都没有作用 ；而同浓度的 S02 在白葡萄酒和桃红葡萄酒中却表现出明显的 抗氧化效果。Vivas等【30]通过对红葡萄酒 自由基 33 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 No．5 清除和抗氧化性研究证明：红葡萄酒生产中实际应 用的 S0 浓度 (50mg／L)没有有效的 自由基清除特 性 ，抗坏血酸则依赖其浓度有一定的 自由基清除能 力，酒中的酚类物质却有很强的自由基清除活性 。 Vivas等[31 J通过对不同红葡萄酒酒样大量通气(氧 化)后的多项有效分析进一步证明：sO2(50mg／L)没 有表现出抗氧化性的效果 ，尤其是没有表现出对氧 消耗率的增加和氧化还原电位的变化 ；sO2氧化条 件的研究则表明 ：so2对分子氧及其不同的激活反 应形式(O2一、OH和 H2O2)并不十分有效 ，而酒 中的 一 些酚类物质 ，特别是儿茶酚和低聚花色苷比 soz 吸收及消耗氧更快。Sato等_32j通过对原产地不同 的葡萄酒的总酚 、总 So2、游离 So2以及超氧 自由 基清除物质经回归分析后证明：游离 So2及总 So2 含量和葡萄酒颜色直接相关 (R=0．7517)，而和超 氧自由基清除活性没有相关性 ，但总酚含量(特别 是红葡萄酒)与葡萄酒超氧 自由基清除活性明显相 关(R=0．9908)。Manzocco等[33 J在试验中得出结 论 ：白葡萄酒中酚类物质除浓度低外 ，与红葡萄酒 中的酚类物质具有相似的抗氧化性 ，向葡萄酒模型 和葡萄酒中添加 sO2不仅不能 中断酒样的链式反 应 ，却极大地提高了氧的消耗率。Mastrocola等I34 J 也认为加入 soz并不能影响酚类物质对葡萄酒链 式中断和对氧清除活性 ，却极大地提高了它们对氧 的消耗能力 ；且陈酿中葡萄酒的抗氧化活性下降同 酚类物质聚合作用有关。 3 讨 论 3．1 红葡萄酒中 s02的抗氧化性 红葡萄酒生产中通常用 s02作为抗氧化剂 ，但 多项有效试验结果和理论研究表明：在规定添加量 的前提下，sO2不能表现出其在红葡萄酒中作为抗 氧化剂的有效特性 ，尤其是不能表现出对氧消耗和 氧化还原电位的降低 ，更不能表现出对氧 自由基的 有效清除。而红葡萄酒中的酚类物质却表现 出较 强的耗氧能力。这可能与 SO2在红葡萄酒中的特 性有关 ： (1)葡萄酒 中的酚类物质 ，特别是 1，2一二羟 基邻酚和邻 一氢醌结构的多酚，由于其有较强的耗 氧能力，使得 so2的抗氧化性表现很微弱或不能表 现出来。并且 ，由于酚类物质 自氧化过程中生成了 大量的氧化性多酚和过氧化物 ，SO2的抗氧化作用 34 就愈加不明显。 (2)在葡萄酒条件下 s02以多种形态存在 ，有 活性的分子态 so2在此条件下含量最低，HSO 一又 主要 以结合态存在 ：与糖、酮 、酚类物质结合。特别 是 s02在葡萄酒生产 中存在着多处损耗 ：葡萄破碎 除梗后一入罐 ，其杀菌 ，抑制酵母 ，对多酚氧化酶的 抑制和破坏，发酵结束后对乳酸菌的破坏等，以致 于葡萄酒中 so2最终的存在状态主要为结合态 ，而 这样就阻碍了其抗氧化性的发挥。Vivas等L3l_研 究者认为，正是由于与乙醛的结合，使得 s()’本身 可能的抗氧化性不能得到体现。他们在红葡萄酒 允许完成组分和颜色变化的条件下 ，加入乙醛和大 量通气，结果观察到 ：预先加入乙醛的溶液结合了 大量的 sO2，而同样条件下未加乙醛的溶液却引起 了很小的颜色变化。Bouhon等_1 6_却认为这可能是 过氧化氢与 so2反应所致。其认为 so2作为一种 抗氧化剂在葡萄酒 中唯一的作用是与过氧化氢的 反应，并认为过氧化氢 一二氧化硫的反应比氧 一亚 硫酸的反应速率要快得多 、原因是：当葡萄酒中游 离 s02含量保持 5—25mg／L，将会防止乙醛 的生 成。如果这仅仅因为 SO2与生成的乙醛起加成反 应 ，结果应该是总二氧化硫不变 ，而结合二氧化硫 增加 ，但事实却是总二氧化硫的减少。 (3)SO2在红葡萄酒中表现不出抗氧化性 ，Vi． va．s等 J却在白葡萄酒和桃红葡萄酒中发现 so2 (50mg／L)表现出较强的抗 氧化性。这可能和葡萄 酒中酚类物质组分、酚类物质浓度有关，也可能与 葡萄酒中的酶有关。也有试验证明，亚硫酸在水溶 液中的氧化 比在酒精 水溶液 中氧化快地 多[16 ； Gonzalez等-35 J也 认 为 so2和酒精 问有重要 的相 关性。 3．2 红葡萄酒中新型抗氧化剂的研究 既然 so2在红葡萄酒中表现不出有效的抗氧化 性 ，那么寻找红葡萄酒中新型的抗氧化剂，这不仅在 红葡萄酒抗氧化保护方面十分必要 ，而且也降低了 酒中 so2的含量，对红葡萄酒更好地满足人类身体 健康需要具有重要的现实意义。传统的抗氧化剂是 丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲醚(BHT)、没 食子酸酯(PG)等合成抗氧化剂。但 70年代以来，人 们不断发现合成的抗氧化剂有一定的毒性 ，有的还 致畸、致癌l ， 。因此 ，越来越多的国家开始限制并 禁止使用。许多植物 中含有天然抗氧化成分，其毒 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 性也远远低于合成抗氧化剂，且高效，原料又易获 得。特别是一些酚类物质(如茶多酚、栎精等)，既可 作为氧的吸收剂，又可作为有效的自由基清除剂，表 现出强大的抗氧化能力；同时，酚类物质又有较强的 抑菌作用【18,21,24j。开发利用天然抗氧化剂已成为当 今食品科学的发展趋势。此外，抗氧化剂之间混合 往往具有协 同增效作用【孙 。而柠檬酸、氨基酸、 抗坏血酸、乙二胺四乙酸(Ⅱ胜 )等在充当抗氧化剂 的同时，又是很好的抗氧化剂增效剂即能螯合铁铜 等金属离子的增效剂[21j。因此，探讨红葡萄酒中新 型的抗氧化剂 ，研究红葡萄酒 中 SO2的可能替代物， 尤其是天然抗氧化剂或天然抗氧化剂复合物，生产 优质葡萄酒，促进葡萄酒 的发展及人类身体的健康 有重要的现实意义。 参考文献 1．Giugliano D．Dietary antioxidants for cardiovascular prevention． Nutrition Metabolism and Cardiovascular Diseases，2000，10(1)： 38—44 2．Motoaki S，DebasisB，Arp~dT，DipakKD．Grape seedproantho— cyanidin cardiomyoeyte apoptosis by inhibiting ischemia／reperfusion — induced activation ofJNK一1 and C—JUN．Free Radical Biolo． & Medicine，2001，31(6)：729—737 3．Acquaviva R．EllJss0 A．Campisi A et a1．Antio：ddaat activity and protective effect on DNA cleavage of resveratro1．Journal of Food Science，20O2，67(1)：137—141 4．Bltkker J，Bridle P，Bellworthy SJ et a1．Effect of sulfur dioxide and must extraction on color， phenolic ctmaposifion and sensory que ry of red table wine．Journal the Science ofFood 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Additives 20o3 No．5 Ⅲ，苏 丹 Ⅳ 和 甲基 红 的 最 大 吸 收 波 长 分 别 为 505 nln，515 nln，485 nln，因此选定苏丹 工为制作标 准曲线的替代色素。 根据实验结果 ，番茄红素的浓度(C值)在 0．5 ～ 2．5u ml与吸光值 A呈线性关系。曲线和 回归方程如图： 图 5 标 准 曲线 2．2．2 萃取物中番茄红素的含量测定 选取 30 Mpa，55℃，2h，co2流量为 30kg／h条件 下的萃取物(H组)和 B，E，F，G组 的萃取物，准确 称取 0．072克，2Oral环己烷充分溶解 ，取 0．1ml稀 释为 3ml，Ultrosper 4300 pro紫外分光光度计 472nm 波长下比色测定 ，再计算 C值和质量分数。结果 见表 1。 由表 1中数据可知 ，H组 30 Mpa，55％，2h，co2 流量为 30kg／h，提携剂是 3Oral大豆色拉油的条件 下 ，100克干料可以获得 29．15克纯度为 1．37％的 番茄红素提取物。 参考文献 1．Nguyen札 ，et a1．Lyeopene：clinical and biological印 】pen ． Food Tedanolo~．1999，53(2)：38—45． 2．T Angu~lova，J Warthe~ a．Lyeopene stability in tamato powers． Joumal offood science 2OOO，65(1)：67—70． 3．Giovannucci E．T~matoes，Tomato-Based Products，Lyeopene，and Cancer：Review ofthe Epidemiologie Literature．J．Nail．Cancer In— st．1999，91(4)：317—331． 4．Wang Q．et a1．Effects of Caroten oids on irr~nunologie function in mice．First~1lina-Japan International Conference on Vitamin(held in Beij~ ， )，1998：34—35． 5．左爱仁 ，范青生．超声波萃取番茄红素的研究．食品工业， 2003，24(4)． 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