核黄素生产技术进展

《中国食品添加剂》 China Food Additives 2o03 NO．4 核黄素生产技术进展 仪 宏 朱文众 张华峰 (河北科技大学生物科学与工程学院，石家庄 0500{8) 摘要：综述 了核黄素生产中发酵、分离提 酵废液处理的工艺进展 ，展望了核黄素关键生产工艺的发展 前景。 关键词：核黄素，发酵，分离提取，发酵废液处理 Progress in Riboflavin Production Process (College of Bioscience& Bioengineering，Hebei U niversity of Science and Technology，Sh~iazhuang city，050018) Ab~／'act：Developments in the processes for fermentation，extraction and fermentation wastewater treating in riboflavin production a3Fe overviewed．The future development of riboflavin production technologies are previewed in this paper． Key w0rIb：Riboflavin，Fermentation，Separation and extraction．Wastewater treating 核黄素(riboflavin)又名维生素 B，、维生素 G 或乳黄素，是一种人体必需的水溶性维生素。核黄 素具有广泛的生理功能，因此被世界卫生组织 (WHO)列为评价人体生长发育和营养状况的六大 指标之一⋯1。核黄素在临床治疗、饲料工业、食品 工业及化妆品工业等中均有重要价值。 1 核黄素生产的工艺方法 核黄素较早就实现了商业化生产。目前，国际 上生产核黄素的工艺方法主要有4种：抽提法、化 学合成法、微生物发酵法以及半微生物发酵半化学 合成法 2。其中，微生物发酵法是近些年发展起 来的一种十分经济有效的方法。 以往的核黄素商业生产主要采用化学合成技 术路线 3。近年来，许多生产商开始采用微生物 发酵法生产核黄素。由于半微生物发酵半化学合 成法的生产工艺中需要添加某些有毒的化学试剂， 这就使得该方法的废料处理和环保问题比较突出。 采取该方法生产的核黄素纯度可达到96％[ 。 同化学合成法相比，微生物发酵法成本低，污 14 染少，因此日益受到世界核黄素生产商的青睐。德 国的 BASF公司、瑞士的 Roche(罗氏)公司和我国 的湖北广济药业公司均以微生物发酵法为主生产 核黄素。微生物发酵法得到的初提物中约含 80％ 核黄素[ 。 2 核黄素的生产原料 不同核黄素生产商使用的原料不尽相同。目 前，微生物发酵法采用的主要碳源为植物油、葡萄 糖、糖蜜或大米等；清华紫光集团公司还开发了以 米糠油、骨胶等为原料的核黄素发酵生产技术。不 同核黄素生产原料的价格和营养成分含量不同。 BASF公司主要采用豆油作为核黄素的生产 原料。我国的湖北广济药业公司原先主要以糖蜜 作为核黄素生产原料，但是，尽管糖蜜的成本低于 豆油，其供应却难以保障。为此，湖北广济药业公 司先后投资 1．8亿元开发了以大米替代糖蜜生产 核黄素的新工艺，并在湖北省武穴市建成了全国最 大的核黄素糖化发酵工厂。该工厂的投产运营不 仅解决了糖蜜原料的供应难题，降低了原料成本， 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o3 NO．4 而且还扩大了核黄素生产规模，使其由原先的年产 300吨提高到未来的 2000吨。据预测，该工厂投 产运营之后，每年大约可消化 5000万吨稻谷。 3 生产核黄素的微生物菌种 优良的微生物菌种是提高微生物发酵法的核 黄素产量和经济效益的最重要条件之一。可以代 谢产生核黄素的微生物很多，包括真菌(如酵母)、 细菌等。但是，真正应用核黄素工业生产的菌种却 很有限，如 l。 表 1 核黄素工业生产中的常用微生物菌种 菌种名称 学名 分类地位 阿氏假囊酵母 Evemothecium ashb~i 酵母 Candidaflareri 酵母 Sacvharomyces oerevisiae 酵母 棉病阿舒囊霉 A gOSsypii 霉菌 Bci盯m subtilis 细菌 各国的核黄素生产商都十分重视菌种的选育、 研究、开发和保藏[ -1 0l。方尚玲等(t999)r ]以阿 舒假囊酵母为出发菌株，用紫外线对其原生质体进 行诱变育种，得到了一株高产核黄素的突变株，其 核黄素发酵单位比出发菌株高出60％。张星元等 (t997)r11]采用60Co的a射线诱变技术选育出的阿 舒假囊酵母突变株的发酵单位稳定在了5．4g／L。 近年来，随着分子生物学的发展，基因工程等 先进手段已经越来越多地应用到核黄素生产菌种 的选育中[ -6， -1 。例如，Roche公司采用的当 家菌种 Bacillus subtilis Marburg168就是采用基因 工程的手段选育得到的[13]。该菌种具有产量高、 能耗低等优点，经济效益十分显著 9。随着核黄 素生产菌种选育的深入发展，人们开始对微生物代 谢产生核黄素的分子机制进行深入而系统的探 讨[ -1 。研究发现，Bacillus subtilis的核黄素合 成酶的分子量约为75kD，它有2种存在形式：轻酶 和重酶。核黄素合成酶 厄 亚基的分子量约为 25kD，其一级结构已经测序完成【14J。进一步研究 发现，Bacillus subtilis的核黄素合成酶由多基因编 码，这些基因成串的分布于一个长度为4．3×to3 的操纵子(r 操纵子)上[14,15 J。r 操纵子的基 因产物(Ribc、RibB、RibA、RibH)可催化 GTP和 5 一 磷酸核糖转化成核黄素[16]。在 r沾操纵子的5’ 位点有一个约有 300个核苷酸组成的引导序列，该 序列上的一个顺式作用元件和一个由 ribC基因编 码的RNA结合阻遏蛋白构成了核黄素生物合成 的调控系统["]。目前，ribC基因已经成功克隆并 测序完成。令人惊讶的是，该基因具有与编码细菌 黄素激酶(催化核黄素转化成 FMN)以及 FAD合 成酶(催化 FMN转化成 FAD)的基因极为相似的 序列[18,19]。Mack M等(1998)r12]对这一有趣现象 进行了深人研究，结果发现，FMN和 FAD对核黄 素的生物合成起调控作用，而核黄素则无此作用。 综上不难看出，微生物菌株代谢产生核黄素的 分子机制十分复杂。研究该分子机制，并应用于核 黄素工程菌种的选育，对于提高核黄素的产量和经 济效益具有十分重大的意义。但是同时，利用基因 工程等手段选育优良菌种的成本也是十分昂贵的。 据 BASF公司估计，开发一种新的核黄素生产菌种 大约需要2—3．5万英镑和3年时间。 4 核黄素发酵工艺的优化 核黄素的生物合成与积累是一个复杂的代谢 过程，受到碳源、氮源等许多因素的影响。因此，同 选育核黄素高产菌种一样，优化发酵工艺条件也是 提高产量和经济效益的最主要因素之一。李蝾等 (t997)r2J以阿氏假囊酵母为出发菌株，研究了摇 瓶发酵核黄素过程中碳源、氮源、微量元素、初始 pH、接种量和促生因子等发酵条件的优化配方。 4．1 核黄素过量合成的发酵工艺条件 为了进一步提高核黄素的产量，惠明等 (2ooo)r20]对阿氏假囊酵母过量合成核黄素的发酵 工艺条件进行了研究。结果发现，碳源、氮源、发酵 用水、培养基的灭菌方式以及种子液质量等对核黄 素的产量均具有较大影响；采用补料发酵工艺可使 核黄素产量较对照的普通发酵提高 20％强；添加 碘乙酸或 NaF也具有显著的增产效应。 值得注意的是，研究碘乙酸、NaF等对核黄素 发酵的增产效应和增产机理，不仅在理论研究上具 有较大价值，而且在核黄素生产实践中也具有重大 的应用意义。业已发现，在微生物细胞中，核黄素 的产生与 HMP途径(磷酸戊糖途径)密切相关。 惠明等(2ooo)r20]创造性地提出，适当调整菌体代 谢中HMP途径、EMP途径(三羧酸循环)碳架物 15 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2oo3 NO．4 质流的比例，即适当减少 EMP途径的碳架物质流 而增加 HMP途径的碳架物质与能量的代谢流，将 有利于核黄素的过量合成。实验显示，在核黄素发 酵培养基中添加碘乙酸、NaF等 EMP途径的代谢 抑制剂，对核黄素的发酵确有明显的增产效应[20 J。 该试验初步验证了上述假说。目前，这方面研究尚 待进一步深入。 4．2 核黄素的补料发酵 陆文清等(2O0o)_2l_对核黄素的补料发酵进行 了研究。摇瓶(500mL)和小发酵罐(20L)试验证 明，先采用低浓度原料培养菌体，后根据发酵液 DH 变化进行多次适量补料，不仅可以控制菌体的过度 增殖，缓解通风供氧不足问题 ，而且还可以保持菌 体活力，使核黄素的发酵单位提高到 56 L，大约 比普通发酵增产 20％强。目前 ，补料发酵尚处于 实验室或小试阶段 ，在实际生产中的应用未见报 道。 4．3 D一核糖的发酵工艺条件 D一核糖是半微生物发酵半化学合成法生产 核黄素的重要中间产物。为了提高 D一核糖的发 酵产量和经济效益，国内外学者对 D一核糖发酵培 养基 的配方[22]、pH值【 、发 酵液 的组 成成 分[24,25]和接种时间[24]等进行了大量研究，不少研 究成果 已经应用于 D一核糖和核黄素的工业生产 实践。 5 核黄素的分离提取与纯化 据 BASF公司估计 ，对 于微生物发酵法来说， 核黄素的分离提取与纯化成本约占整个生产成本 的40％以上；而化学合成法的相应成本则比前者 低一些。 核黄素的分离提取方法主要有：重金属盐沉淀 法[26]、Morehouse法[27]、酸溶法和碱溶法。目前工 业生产中多采用后两种方法。由于酸溶法能耗较 大，总收率较低，因此，许多生产商开始把注意力投 向碱溶法。章克昌等(1998)[28]对碱溶法进行了详 细研究，发现：1)当 DH11．3～l2．2时，溶解度可达 到5，000—20，000mg／L，该质量浓度范围覆盖了 目前发酵生产核黄素的最高质量浓度，而且溶解时 间极短(不超过 5min)；2)避光条件、溶解温度、pH、 核黄素在溶液中的作用时间以及核黄素的浓度均 能影响碱性条件下核黄素的稳定性。基于上述结 16 论，该实验组出了碱溶法的优化工艺流程。采 用该工艺流程可使核黄素的总收率达到 79．8％。 核黄素的分离提取与纯化是一项技术性极强 的工序。各国的生产商对之都很重视 ，并通过申请 专利来保护自己的独特技术[29，3 0l。 6 核黄素颗粒剂的制造 作为饲料添加剂是核黄素最重要的用途之一。 要将核黄素发酵液制成饲料添加剂，应该首先对发 酵液进行干燥处理。常用的干燥方法主要有两种： 喷雾干燥法和普通气流干燥法_3 。但是两者制备 的核黄素颗粒剂都很难与大宗饲料均匀混合。为 此，陆文清等(1998)[ ]探索和研究了浓缩核黄素 发酵液制备饲料添加剂的新工艺。该工艺简便有 效、成本低廉，制备的核黄素颗粒剂易与大宗饲料 均匀混合。但是目前该工艺尚处于实验室研究阶 段。 BASF公司也 申请了制备喷雾干燥颗粒剂或 微颗粒剂的方法的专利【32 J。 7 发酵废料的处理与核黄素的固态发酵 相对于化学合成法或半微生物发酵半化学合 成法而言，微生物发酵法很少使用有毒的化学试 剂，因此其发酵废料的处理也相对容易。微生物发 酵法的废料主要包括菌体残渣、发酵残余培养基以 及分离提取工序产生的酸性或碱性废水【33 J。前两 者均可直接用作动物饲料，也可被普通的废物处理 厂净化，后者的处理则略有困难_3 3l，这也正是核黄 素的固态发酵方法得以保留的重要原因之一。 事实上 ，前文涉及的微生物发酵法主要是指液 体深层发酵方法。该方法是目前大规模工业生产 最广泛采用的方法。除了该方法之外，微生物发酵 法还包括固态发酵方法。日本早期的核黄素工业 生产就主要采用以脱脂胚芽为原料的固态发酵方 法【33]。但是近年来，固态发酵方法几乎已经完全 被大规模的核黄素工业生产所淘汰。惠明等 (1999)[33]研究认为在 90％豆渣 +10％麸皮的培 养基上，采用固态发酵方法生产核黄素粗品(核黄 素含量约为 1％)制备饲料添加剂，具有较高的可 行性。 8 结语 我国约有 l0家核黄素生产商。核黄素产品是 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 20o3 No．4 我国重要的医药工业产品。由于各国生产商都在 不断地扩大生产规模，改进和优化生产工艺，因而 使得全球整个核黄素的生产量大幅度提高，各国生 产商之间的竞争也日趋剧烈。在这种形势下，随着 我国人世的逐步深入，我国的核黄素生产将面临严 峻的考验。对此，我国的核黄素生产商必须采取积 极对策，不断加强研发力度，提高核黄素产量与质 量，降低生产成本，增强自身产品在世界市场中的 竞争力，应对人世挑战。笔者认为，今后在核黄素 生产技术领域，应当特别注重以下几点： 8．1 利用基因工程技术构建核黄素高产工程菌种 高产菌种 获得是高水平发酵的前提，国外较 早就开始利用先进的分子生物学技术构建优良的 工程菌株[9,13]，有的已用于生产实践L13]；而我国在 此领域则较落后，至今没有适合我国生产实践的工 程菌株问世并用于生产实践的报道。大量的研究 和实践，工程菌株的核黄素产量和综合性状明 显优于普通菌株[ 。但是由于国外生产商对菌种 的知识产权十分重视[4-6]，直接引进其工程菌株 需要耗费巨资，并且国外生产商所使用的生产原料 与我国大不相同，即使引进进来也不适合我国的生 产原料国情。这些就迫切要求我们尽快加大自主 研究和开发工程菌株的步伐和力度。 8．2 采用计算机技术系统优化核黄素发酵工艺 优化核黄素发酵工艺，是提高核黄素产量和质 量的重要途径[2,20-21,34]。我国学者在青霉素等发 酵产品的工业化生产中运用计算机对发酵过程进 行多变量模拟和优化，取得了良好的效果。这些成 果的技术思想和技术方法具有相当的普遍性，可以 借鉴应用到核黄素生产过程的优化之中。 参考文献 1．王林静．核黄素与健康．广东药学院学报，2000，16(3)：223 — 228 2．李嵘 ，余俊红，吴佩琮 ，等 ．发酵法制核黄素 ．无锡轻工大 学学报，1997，16(1)：14—18 3．Ullmen ns eacydopodia of industrial chemistry，VCH．Verlags- gese]]scha：ftmbH，1996 4．Roche公司．高产核黄素的细菌菌株 ．中国专利，90104934， 1990 5．BASF公 司．真 菌 中的 核 黄 素 生 物 合 成 ．中 国 专 利， 95192767。1995 6．Roche公司．改进的核黄素生产方法 ．中国专利，97117163， 1997 7．方尚玲 ，李世杰，张迎庆，等 ．核黄素产生菌的原生质体诱变 选育 ．湖北工学院学报，1999，14(4)：76—79 8．楮志文．生物合成药物学 ．上海：上海医科大学出版社，1991 9．Roche公司．High-output vitamin 132 Production using tailor- ulsde strains of bacteria．Internet，2002 10．BASF公司．利用异柠檬酸裂合酶活性被改变的微生物制 备核黄素．中国专利 ，96195479，1996 l1．张星元 ，王琴．阿舒假囊酵母过量合成核黄索性能的改良． 无锡轻工大学学报 ，1997，16(3)：14—19 12．Matthias Mack， Adolphus PGM vau loon， Hens-Peter Hohmen n．Regulation of riboflavin biosynthesis in Bacillus subtilis is affected by the activity of the fla voklnse~e．／fla v- inadenine dinucleofide syntheteee encoded by ribC．J．0f bacteriology，1998，180(4)：950—955 13．Perkins JB，Pero JG，Sloma A．Riboflavin 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