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葡萄籽提取物中原花青素的测定

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葡萄籽提取物中原花青素的测定 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2o03 NO.6 葡萄籽提取物中原花青素的测定 冯建光 陈利琼 (深圳邦乐生物技术有限公司,深圳 518057) 摘 要 :用高效液相和 Folin—Ciocaheau相结合的方法分析 了葡萄籽提取物 中原花青素 的百分含量。此方 法能够弥补 Bate—Smith法和 Porter法只能测定原花青素相对含量的缺陷。分析结果显示 :葡萄籽提取物 中原 花青素的含量为77.4%。 关键词:原花青素,高效液相 ,Folin.Ciocaheau法...
葡萄籽提取物中原花青素的测定
《中国食品添加剂》 China Food Additives 2o03 NO.6 葡萄籽提取物中原花青素的测定 冯建光 陈利琼 (深圳邦乐生物技术有限公司,深圳 518057) 摘 要 :用高效液相和 Folin—Ciocaheau相结合的方法 了葡萄籽提取物 中原花青素 的百分含量。此方 法能够弥补 Bate—Smith法和 Porter法只能测定原花青素相对含量的缺陷。分析结果显示 :葡萄籽提取物 中原 花青素的含量为77.4%。 关键词:原花青素,高效液相 ,Folin.Ciocaheau法 ,多酚,单体 Determination of Procyanidin in Grape Seed Extracts (Shen Zhen Bannerbio International Limited 5 1 8057) AbI :The content of procyanidin in grape seed extracts was analyzed by HPLC and Folin。Ciocaheau method.The result shows the content of procyan idin in grape seed extracts is 77.4% . 1(ey words..Procyanidin,HPLC,Folin—Ciocaheau method,Polyphenol,Monomers 葡萄籽提取物是从葡萄籽 中提取分离得到的 一 类多酚类物质 ,主要由原花青素 ,儿茶素,儿茶 素,没食子酸,表儿茶素没食子酸酯等多酚类物质 组成。由于葡萄籽提取物显著的生物活性 ,如抗氧 化性和清除氧 自由基等⋯I。这些引起 了人们研究 和开发葡萄籽提取物的兴趣。目前 ,对葡萄籽提取 物中原花青 素 的测定 大多 采用 Bate—Smith和 Porter法[2,3]。但 由于原花青素成分的极其复 杂 性 ,还不能提供原花青素的品。因此 Bate— Smith和 Porter法 只能测定葡萄籽提取物中原花 青素 的相对含 量,其结 果一 般用 原花青素指 数 (procyanidolie index)和 PV U值(porter value unit) 来表 示 ,原 花 青 素 指 数一 般 在 80—100之 间。 PVU值一般在 250—350之间。 目前有些生产厂 家就用原花青素指数来表示葡萄籽提取物中原花 青素的百分含量 ,这其实是一种错误的表示方法。 由于葡萄籽提取物是 由原花青素和几种单体 组成的。因此葡萄籽提取物 中原花青素的含量可 由葡萄籽提取物 中总多酚的含量减出其中单体的 含量求得。葡萄籽提取物中总多酚的含量可以采 用 Fohn—Ciocalteau法测定 ,单体的含量采用高效 液相(HPLC)测定 。所 以作者用 Fohn—Ciocalteau 法和 HPLC相结合的方法来测定葡萄籽提取物 中 原花青素的含量。 1 实验部分 1.1 材料 葡萄籽提取物 :由深圳邦乐生物技术有限公司 提供。 1.2 仪器和试剂 瑞士 BUCHI R一200真空旋转蒸发仪。Wa. ter公 司 1525 HPLC。色 谱 柱 :Hypersil ODS 150mm X 4mm,5ttm。 Fohn—Ciocalteau试 剂:美 国 Sigma公 司,批 号 :P/N F一9252 没食子酸,儿茶素 ,表儿茶素标准品:中国药品 生物制品检定所。表儿茶素没食子酸酯:美 国 Sig. ma公司。乙睛:美国 Fisher公司。 1.3 色谱条件 波 长 :280nm;柱 温 :30oC;流速 :1mL/ 103 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 NO.6 min。流动相:A,20.0% 乙酸 ;B,80% 乙腈;采用 梯度洗脱 :0rain一85rain,100% 一20%A;6min一 85min.4% 一80% B。 进样量 :10ptL 1.4 葡萄籽提取物中总多酚的测定 :Folin—Cio. calteau法[ ] 1.4.1 原理 葡萄籽提取物中总多酚的测定一般采用 Folin — Ciocalteau法进行测定。在碱性 溶液 中,酚类化 合物可以将钨钼酸还原 (w6 变为 W5 ),生成蓝 色的化合物 ,颜色的深浅与多酚含量呈正相关,蓝 色化合物在 760nm处有最大吸收。Folin—Cioca1. teau法测定总多酚一般用没食子酸作为对照品。 100 舌 80 0 60 詈 40 2O 蠖 0 提取物中总多酚的含量以等同于没食子酸(gallic acid equivalent)表示。 1.4.2 标准曲线的制定 准确称取真空干燥至恒重 的没食子酸对照品 44.3mg,用水溶解并定容至 100ml。以此溶液配成 浓度 为 8.86,17.72,35.44 ,53.16,70.88,88.60 g/ml的溶液。分别取上述不同浓度溶液 1ml加 到 10ml比色管中,然后依次加入 1ml去离子水 , 0.5ml Folin— Ciocalteau试 剂 ,1.5ml 26.7% Na2CO 溶液,最后用水定容至 10ml,室温下反应 2 小时,在 760nm下测定其吸光度 。由吸光度对浓 度进行回归 ,求得标准曲线。 0 0.5 l 1.5 A760n∞ 1.4.3 葡萄籽提取物中总多酚含量的测定 准确称取适量的葡萄籽提取物 ,用水溶解,浓 度在 0.08mg/ml左右。取 1ml样品液加 到 10ml 比色管 中,然后 依次加 入 lml去离 子水 ,0.5ml Folin—Ciocalteau试剂 ,1.5ml 26.7% Na2CO3溶 液 ,最后用水定容至 10ml,室温下反应 2小时,在 760nm下测定其吸光度。测得 的吸光度代入标准 曲线 ,求得葡萄籽提取物中总多酚的含量。 1.5 葡萄籽提取物中单体含量的分析 葡萄籽提取物 中单体主要为以下 四种 :儿茶 素,表儿茶素 ,没食子酸 ,表儿茶素没食子酸酯。这 四种单体的含量 占到了葡萄籽提取物中单体含量 的 90.0%以上。美国葡萄籽方法评定委员会(The grape seed method evaluation of committee)建议用 上述四种单体的含量来标定葡萄籽提取物中单体 的含量。因此作者仅测定葡萄籽提取物中这四种 单体的含量。 精密称取 80~C减压干燥至恒重的上述 四种对 照品适量,用甲醇分别配制标准溶液 ,浓度在 8.0 ~ 90.0ptg/mL之间。分别精密取 10 注入色谱 仪。以峰面积积分值对进样量进行回归,求得标准 104 曲线。结果表明:进样量在 0.09~0.9ttg范围内线 性关系良好。 1.6 单体反应系数的测定 由于按 Folin—Ciocalteau法测定的总多酚是 以相当于没食子酸表示的。所以,葡萄籽提取物中 儿茶素等单体按 Folin—Ciocalteau法测定 ,并以没 食子酸的量表示时,不能反应其真实含量。这样造 成了按 Folin—Ciocalteau法测定总多酚时反应 出 的葡萄籽提取物中的单体含量与 HPLC法测定的 单体含量是存在差异的。因此葡萄籽提取物中原 花青素的含量用总多酚的含量减出其中单体的含 量必须有一个校正系数。这样才能使 Folin—Cio. calteau法和 HPLC测定单体含量等同起来。 准确配制含量为 100.0itg/ml的儿茶素 ,表儿 茶素,表儿茶素没食子酸酯 甲醇溶液 ,按 Folin— Ciocalteau法进行反应,反应后 的溶液在 760nm读 取吸光值,吸光值代入以没食子酸为对照品的标准 曲线计算其多酚的含量(即相当于没食子酸的量表 示(GAE))。由按 Folin—Ciocalteau法测得的每种 单体的多酚含量除以其真实含量即为反应系数,单 位为:g GAE/g。 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 2003 NO.6 1.7 葡萄籽提取物中原花青素的计算 葡萄籽提取物中原花青素的含量按下列公式 计算 : CPc=CGsE一((CM1×RFM1)+(CM2×RFM2)+ (CM3×RFM3)+(CM4×RFM4)) 其中:CPc:原花青素的含量,以每克葡萄籽提 取物相当于多少克没食子酸表示 。 CGsE:按 Folin—Ciocalteau法测定的总多酚含 量 。 CⅢ,CM2,CM3,CM4:分别表示 HPLC法测定的 2.3 葡萄籽提取物中没食子酸 ,儿茶素 ,表儿茶素,表儿 茶素没食子酸酯的含量。 RFM1,RF ,RFhI3,RFM4:分别表示没食子酸,儿 茶素,表儿茶素,表儿茶素没食子酸酯的反应系数。 2 结果 2.1 葡萄籽提取物中多酚的含量 测定深圳邦乐生物技术有限公司生产的葡萄 籽提取物多酚含量为 91.2%(按绝对干重计算 ) 2.2 葡萄籽提取物中单体的含量 图 1 葡萄籽提取物中单体分离色谱图 2.4 葡萄籽提取物中原花青素的含量 CPc=CGsE一((CM1×RFM1)+(CM2×RFM2)+ (CM3×RFM3)+(CM4×RFM4)) = 91.2—0.84×6.35—6.02× 1.08— 1.23— 0.58× 1.20=77.4% 3 讨论 3.1 由于葡萄籽提取物 中成分非常复杂。当用 HPLC直接分离单体效果不佳时,可用 60—80目 的聚酰胺柱层析对提取物进行进一步的分离纯化。 此时,由于单体的极性要比原花青素的极性要小, 当用低浓度 的丙酮 (一般为 30~40%)洗脱时 ,可 使单体洗脱下来,而原花青素由于极性较大不被洗 脱,从而达到分离的效果。此时单体的回收率可达 到 90.0%。 3.2 用 Folin—Ciocalteau法测定葡萄籽提取物中 总多酚时 ,蛋白质,氨基酸的存在会对测定 的结果 产生影响。因此 ,当葡萄籽提取物中蛋 白质含量较 高时 ,应消除蛋 白质对总多酚的影响。 参考文献 1.Toshiaki Ariga. Radical Scavenging Action and its Mode in Proeyan idins B-1 an d B-3 from Azuki Beans to Peroxyl Radi- cats.Agric Biol Chem,1990,54(1O):2499—2504. 2.Bate-Smith,E,C.Phytochemistry of proanthocyanidins. Phytochemistry 1975,14:1107—1113 3.Porter,L.iJ;Hrstich,J.N;Chan,B.G.The conversion of proanthocyanldins and prodelphenidins to cyanidins and ddphemdins.Phytochemistry,1986,25:223—230 4.V.Singleton,J.Rossi.Colorimetry of total phenolic substan ces with phosphomolibdie-phosphotungstic acid reagents.Am.J End.Vitic.1965,16:144— 158 105 维普资讯 http://www.cqvip.com
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