血管平滑肌细胞原代培养经验
兔血管平滑肌细胞原代培养
我是某医学院的硕士研究生,课题涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养,实验开始非常
不顺利,进行了几次实验均一无所获。后来我在丁香园上发帖提问
(http://cell.dxy.cn/bbs/topic/16215850?tpg=1&ppg=1&age=0#0),得到了丁香园网友
的热情帮助,在网友的帮助下,经过不断尝试改进,最后我终于得到了想要的血管平滑肌细
胞,完成了实验并顺利毕业。鉴于网上还有很多网友在提有关血管平滑肌细胞原代培养的问
题,我现在将自己的毕业论文中细胞培养的部分共...
兔血管平滑肌细胞原代培养
我是某医学院的硕士研究生,课
涉及到兔血管平滑肌细胞的原代培养,实验开始非常
不顺利,进行了几次实验均一无所获。后来我在丁香园上发帖提问
(http://cell.dxy.cn/bbs/topic/16215850?tpg=1&ppg=1&age=0#0),得到了丁香园网友
的热情帮助,在网友的帮助下,经过不断尝试改进,最后我终于得到了想要的血管平滑肌细
胞,完成了实验并顺利毕业。鉴于网上还有很多网友在提有关血管平滑肌细胞原代培养的问
题,我现在将自己的毕业论文中细胞培养的部分共享,由于论文还没发表,部分图片不能公
开,请见谅!欢迎转载。
①DMEM培养基的配制:
在新购进的 500ml DMEM/F12培养基内加入 5ml双抗及适当比例的 FBS(原代 20%,3
代后 5%),配制成完全培养基,4℃保存备用。
②兔 SVMCs的原代培养:
体重 2kg~3kg的雄性日本大耳白兔,耳缘静脉注射空气栓塞处死后,置于操作台。从
腹部切开,分离腹部血管,暴露腹主动脉,无菌条件下切下约 5cm长的动脉,装入含双抗的
PBS中备用。在超净台内将取材的血管在DMEM中漂洗数次,小心将外膜剥去,用双抗浸
泡数分钟后,直接加入胰酶,在胰酶双抗混合液中用眼科剪将组织块剪碎,将双抗和胰酶混
合后用 1ml移液枪吸去,加入 3ml培养基,用吸管吹打后将组织块和培养液吸入 25cm2细胞培
养瓶中,直接用移液器将液体大部分吸出,盖紧瓶口后瓶口向上竖立放入培养箱,约 1.5h后
加入DMEM/F12培养基(含 20%FBS, 1%双抗),每个培养瓶约 2.0ml,缓慢将瓶身翻转,使
培养基覆盖组织块,将瓶口拧松,放入 CO2养箱,静置 3d~4d观察。
这是手术中的图片,上面灰白的那根是腹主动脉。
这是超净台里剥开了一半的血管,要的是上面这部分,下面的是血管外膜及筋膜等,丢
弃
这是剪碎了的组织块,泡胰酶和泡双抗都是这么泡,后期我做的时侯比这个剪得还要碎:
这是剪好后放到培养箱里的图片,瓶口向上立着的两瓶是我的。
③细胞分散(这步也比较重要,一瓶里面几十个组织块,只有几个甚至一个组织块有细胞游
出,不分散的话,传代细胞很少,养不活,不传代的话细胞老在一个地方长,挤得要命,也
难养活的):
原代组织块一般 5d~7d有细胞游出,当游出的细胞在部分组织块周围密集成层后即可
进行细胞分散。弃原培养基,0.25%胰酶-EDTA 1ml消化细胞,40s后弃大部份胰酶,继续
在显微镜下观察消化情况并拍打培养瓶,当有细胞浮起游动时,加入 6mlDMEM/F12培养基,
终止消化。继续晃动培养瓶,观察到细胞大部份浮起,放入培养箱中。3d换液一次,待细
胞长满后按 1:3比例传代或者冻存。
(以下几步恕无法提供图片)
④HE染色观察兔VSMCs:
将生长良好的第 3代细胞消化后接种于放有载玻片并经高压消毒的玻璃平皿中,待 4h
细胞贴壁后,向玻璃平皿中补足培养液,继续培养。细胞爬满后,取出爬片,用 PBS冲洗,
乙醚酒精固定,用电吹风吹干。进行HE染色,步骤如下:蒸馏水洗 2mins->苏木精染色
10mins->自来水洗 1min->1%盐酸酒精分化 20s->自来水洗 1min->稀氨水蓝化 1min->70%酒精
2mins->伊红染色 1min->80%酒精脱水 30s->95%酒精 30s->无水酒精 I2mins->无水酒精
II2mins->无水酒精 III2mins->二甲苯 I5mins->二甲苯 II5mins。中性树胶封片,显微镜下观察,
拍照。
⑤兔VSMCs的免疫组化鉴定:
将生长良好的第 3代细胞消化后接种于放有载玻片并高压消毒的玻璃平皿中,待 4h细
胞贴壁后,向玻璃平皿中补足培养液,继续培养。细胞爬满后,取出爬片,用 PBS冲洗 2次,
甩干后加入乙醚酒精,数秒后用吹风机吹干。用 PBS冲洗 3次,每次冲洗后等待 3min,再
冲洗下一次。加入曲拉通X-100,等待 10min,再用 PBS冲洗 3次。加入双氧水,
10min,PBS冲洗 3次后加入一抗。4℃下过夜。次日早晨取出载玻片,PBS冲洗 3次,加入
二抗,室温下 15min,PBS冲洗 3次。加入新配的DAB显色剂(0.85ml蒸馏水,再加DAB
缓冲液,DAB底物,DAB染色液各一滴,混匀),7min后,用自来水冲洗,复染苏木素
(过程:DAB染色后蒸馏水泡 2min->苏木素复染 1.5min->自来水洗 30s->盐酸酒精分化 20s-
>温水返蓝 1min->80%酒精 2min->95%酒精 2min->无水酒精 I2min->无水酒精 II2min->二甲苯
I5min->二甲苯 II5min)。然后滴加中性树胶,放上盖玻片,显微镜下观察,拍照。
⑥兔VSMCs的透射电镜观察:
取出两瓶生长良好的细胞,PBS冲洗两次后加入胰酶,消化约 30s后待细胞变圆时弃胰
酶,加入 5ml培养基,吹打后将两瓶细胞悬液合并后放入 15ml离心管,1000rpm离心 5ml
后小心弃上清,用移液器缓缓加入固定液约 1ml,送电镜室进行透射电镜观察。
相关讨论
本实验主要采用组织贴块法,进行了以下改进:1.在将血管中膜组织块剪碎至 1mm3大
小后,移入培养瓶前,用 0.25%胰酶消化组织块 1min,然后用含 FBS的DMEM培养基终止
消化,再将组织块移入培养瓶中。可以使细胞基质的主要物质胶原纤维得以减少,组织块变
得疏松,有利于VSMCs从组织块中游离出,加快了细胞的生长速度,缩短了细胞融合时间。
2.组织块移入培养瓶后,文献报道多为将培养瓶翻转,有组织块的培养瓶底面朝上放置 3h~
4h后再小心翻转培养瓶,使组织块与培养基接触。在实验中我们发现这样 3h~4h后组织块
周围仍很潮湿,使其不能很好贴于瓶底,翻瓶后仍有很多组织块漂起。我们在实验中将翻瓶
改进为将培养瓶口朝上竖立放入培养箱,利用液体的重力作用使瓶底(尤其是组织块周围)
的液体流至瓶底部,这样减少了翻瓶的等待时间,2h后翻瓶,飘起的组织块很少。这样使
组织块能够尽早接触培养液,有利于细胞更早游出。3.采用含 20%FBS的DMEM培养基比
含 10%FBS的培养基实验更有利于细胞游出。4.当游出的细胞在少数组织块周围爬出较多并
已生长分层后,应当及时进行细胞分散,即用胰酶消化至细胞变圆后加入含血清培养基终止
消化,使细胞漂浮至培养瓶各处,在培养瓶中均匀分布,减少细胞长满的时间。尽管进行了
上述改进,实验结果显示组织贴块法原代培养VSMCs的成功率仍很低。
本实验一共进行了 22次原代取材,最后统计结果有细胞游出的共有 6次,成功率约
27%。其余未见细胞游出的情况中,组织块污染的有 8次,占 36%,还有 8次是长时间(1
个月)无细胞游出,占 36%。因此污染和无细胞游出是组织贴块法原代培养VSMCs失败的主
要原因。在有细胞游出的 6次中,游出最早的为取材后第 6d,最迟的为取材后 20d,平均细
胞游出时间为 11.3d。
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