12-阿尔兹海默病动物模型的研究进展

2012，28(1):102 ～ 104 神 经 解 剖 学 杂 志  Chinese Journal of Neuroanatomy 阿尔兹海默病动物模型的研究进展 * 通信作者:付学锋 电话:0931-8994501，E-mail:lkyyfxf@ 126． com 赵 波1，张新宇2，付学锋2* (兰州军区总医院:1． 安宁分院临床部神经内科，2． 干三科，兰州 730070) 【关键词】 阿尔兹海默病;动物模型;研究 阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD) ，是一种由神经 系统变性引发的进行性痴呆，老年者发病率较高，亦称老年 痴呆。临床现以记忆障碍、认知功能障碍、精神症状以及 人格、行为方面的异常为主。典型的三大病理特征为:神经 原纤维缠结、老年斑以及神经元的广泛缺失［1］。AD 的动物 模型按产生原因大致分为两大类:一是自发性动物模型，即 由动物本身突变所致的 AD 相关病变，包括代谢紊乱、分子 异常与特种蛋白质合成障碍等模型;二是诱发性动物模型， 由人为施加物理、化学和生物等致病因素，诱发 AD 相关征 象［2］。 1 实验动物 1． 1 目前常用的实验动物 常用以研究 AD 的实验动物有 非人灵长类动物与啮齿类动物，在选择时遵循“减少、替代、 优化”的 3Rs 原则。非人灵长类动物与人类的脑部解剖结 构、神经病变特点以及生物行为模式相似，尤其是恒河猴，在 其脑中观察到含有 β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)沉积的老 年斑和神经原纤维缠结现象，无论是自发还是诱发模型，都 能够较好的复制 AD相关的病理及生理特征［3］，但是昂贵的 费用与稀少的资源限制了非人灵长类动物的大量应用。啮 齿类动物虽然在病变模拟方面不如非人灵长类全面，但是具 有价格低廉、资源广泛、生存率高等特点，与人类的脑部解剖 结构与生理特征也较为相近，更适于诱导模型的大量制备， 成为 AD最常用的动物模型。 1． 2 有待探索的实验动物 猫和狗脑部的发达程度与人类 接近，且其具有较强的生存能力，故而更适于慢性研究，但是 其脑部的血供特点与人类相差较大;兔脑部的血供特点与人 脑相近，兔的载脂蛋白 E(ApoE)也与人类的 ApoE3 相似［4］， 但其发达程度较人脑逊色，解剖结构也不够完全。这几种哺 乳动物可以在 AD研究中发挥一定作用。禽类具有低成本、 短周期、高重复性等特点，较易制备成学习与记忆的模型，但 在 AD的研究中还有待于深入探讨［5］。此外，有实验者成功 在秀丽隐杆线虫体内实现了 Aβ 的表达，今后有望将其运用 于 AD的病理研究［6］。 2 动物模型 2． 1 老化型动物模型 2． 1． 1 自然老化型 AD 常见于 60 岁以上的老人，自然老 化的动物模型能够模拟老年病人的临床表现，18 个月以上的 老年鼠表现出学习和记忆能力的减退，其脑内隔区、基底核 及斜角带核的神经元明显萎缩;20 岁以上的短尾猴脑内出现 老年斑，随着年龄的增长，ApoE与 β-淀粉样前体蛋白的表达 增加，老年斑中相应抗体的阳性染色也增加［7］。但自然老化 的动物模型无法模拟 AD 的全部表现，且统一性较差，目前 更倾向运用水迷宫等测试手段，按照记忆力下降情况将老化 动物进行分组研究。 2． 1． 2 快速老化型 快速老化型小鼠(SAMP)是日本学者 在繁殖自然 AKP变异的小鼠时筛选出来并近交而延代培养 成的。SAMP包括 9 个亚系，其中 SAMP8 作为 AD 的衰老模 型被广泛认可［8］。与正常小鼠相比，SAMP8 小鼠寿命更短， 脑内沉积灶发生更早，发生率更高。在经过 5 个月左右的成 长期后，SAMP8 模型便可出现学习和记忆能力的减退，并产 生神经元减少、神经细胞萎缩、神经递质代谢异常等病理改 变［9］。SAMP8 模型既有自然衰老小鼠特征，又有类似老年 痴呆脑部病理改变及学习记忆功能衰退，对 AD 的病理学模 拟更好，但是价格较贵，生命周期较短，又涉及到代谢、酶学、 免疫等多种机制，不易长期研究，目前更倾向运用于增智方 面的理论与药物研究。 2． 1． 3 D-半乳糖(D-gal)致老化型 向模型动物的腹腔内 注射 D-gal致使衰老的方法是我国研究者最先提出的。细胞 内半乳糖过度堆积将影响正常的细胞代谢，并通过一系列的 氧化损伤机制造成神经细胞功能与结构的改变［10］。D-gal 致老模型表现出接近自然老化的生理特点与细胞学特性，出 现学习与记忆能力的减退、海马锥体细胞的减少、AD病理细 胞增多等现象。在与 Aβ 或氯化铝等复合元素共同作用下， AD的特征表达更加明显［11］。因为具有以上优点，加之其具 备价格低、操作方便、重复性高等特点，又便于复合研究，故 D-gal致老模型在老化型研究中最为常用，但其对氧化机制 的阐释与经典病理特征的呈现仍有不足。 2． 2 损伤型动物模型 2． 2． 1 胆碱能系统损伤型 AD 患者乙酰胆碱递质水平的 下降已被明确证实，通过物理或化学的方法造成动物脑内胆 碱能系统的损伤，可以对 AD 进行模拟。目前常用的物理方 法包括电击与手术。电击大鼠 Meynert 基底核，损坏该处胆 碱能神经元，阻滞向皮质的纤维投射，可导致动物出现学习 与记忆等多种行为缺陷，但是该模型缺乏在老化酶学方面的 验证;手术切除大鼠海马穹窿伞，可使大鼠在术后出现学习 记忆障碍，但是该模型缺乏在典型病理学方面的表现［12］。 常用的损伤胆碱能系统化学方法是向大鼠体内注射不 同类型的化学制剂。东莨菪碱等胆碱能拮抗药物，可抑制乙 酰胆碱与受体结合，引起胆碱能系统紊乱，阻滞信息的获取 能力;鹅膏蕈氨酸等毒性制剂可损害神经通路，模拟 AD 患 者行为的异常表现;亚硝酸钠或乙醇等作用于胆碱能系统， 可分别在记忆力方面模拟巩固障碍与再现障碍等［13］，但这 些模型缺乏在典型病理学方面的表现，且有些药效可逆，无 法模拟 AD不可逆的神经损害。 物理与化学方法损伤胆碱能系统对 AD 的模拟效果相 近，但是机体的基本机能尚有保留与代偿能力，起到了一定 的干扰，对与非胆碱能系统的复合研究较差。 2． 2． 2 Aβ 损伤型 Aβ 是老年斑的主要成分，即使很小的 浓度也会产生神经元的毒性作用，在 AD 的发病中起重要作 用。向大鼠的海马或脑室等部位注射不同片段的 Aβ，可以 使大鼠的神经元发生坏死，促进凋亡基因的表达，诱导胶质 细胞的炎性反应，产生血管的淀粉样变性与纤维蛋白的沉 积，模拟老年斑的病理现象，形成学习与记忆能力减退的动 物模型［14］。无论是单点还是多处注射，都能够迅速建立认 知障碍性动物模型，随着注射剂量可以适当调节病变程度， 但是 AD的脑部病变多呈弥漫性，单纯注射 Aβ 无法完全模 拟弥漫性脑部病变，且注射过程不可避免的对脑组织产生损 害，尽管目前已有使用相关微泵注射使其弥散分布的研究， 但上述缺点仍无法完全克服［15］。另外该模型尚缺乏对其他 典型 AD病理改变的模拟作用。 2． 2． 3 tau 蛋白损伤型 纤维缠结的神经元含有一种过磷 酸化的微管蛋白，即 tau 蛋白，过度磷酸化的 tau 蛋白在 AD 的神经细胞凋亡中发挥了重要作用。通过向大鼠的侧脑室 微泵注入磷脂酸酶抑制剂，如冈田酸等，特异性的抑制丝氨 酸或苏氨酸的蛋白磷酸酯酶，使磷酸化的 tau 蛋白呈现双螺 旋细丝状的病理改变，也可产生类似 Aβ 沉积的老年斑改 变［16］，制造出神经纤维缠结与老年斑并存的 AD 动物模型。 此种动物模型能够有效的研究 AD 的病理机制，研制针对丝 氨酸或苏氨酸的磷酸酯酶的相关药物。 2． 2． 4 铝中毒损伤型 铝中毒能够使神经元退化、变性甚 至死亡，AD病人的脑含铝量最高可为正常人的 30 倍，且在 铝中毒的患者脑组织中发现了神经纤维缠结现象［17］。口服 氯化铝的大鼠于 3 个月后出现认知与记忆障碍，脑组织重量 减少，皮质出现萎缩。进一步研究证实铝可诱发 tau 蛋白的 过度磷酸化与 Aβ的沉积，可制备出神经纤维缠结与老年斑 并存的 AD动物模型，但是缠结的神经纤维并不表现出双螺 旋细丝状，也不足以影响胆碱能系统，较长的试验周期也限 制了该模型的应用［18］。 2． 3 转基因动物模型 2． 3． 1 APP 转基因型 将血小板源性生长因子作为引物， 与人类含 Val717Phe突变的基因 APP结合，再注射到小鼠的 受精卵，培育的下一代携带致病的突变基因，并能够产生老 年斑的病理改变，其神经元营养不良，突触缺失，反应性的引 起星形胶质细胞增生，学习与记忆的能力减退［19］。Tg2576 模型是用朊蛋白启动因子制作的较为理想的转基因模型，能 够在时间上模拟 AD的表现，随着小鼠年龄增长而病变进行 性严重，且 Aβ 脑内的沉积也与人类的 Aβ 脑内沉积位置相 近［20］。 2． 3． 2 tau转基因型 tau的相关基因障碍将引起神经元的 退行性变，对其相关基因进行了一系列的研究。tauP301L 型 转基因鼠可表达最短 4Rtau 异构体，致使神经原纤维缠结， 胶质细胞增生，以及相关的运动障碍，但该障碍能够被脊髓 神经元的大量丢失所阐释;由 Thy-1 启动而表达的最长 4Rtau变异体的转基因鼠，可形成神经原纤维缠结前期的纤 维样物质结构，以及神经元凋亡与胶质细胞增生等改变，而 无运动障碍表现［21］。 2． 3． 3 多重转基因型 AD是多基因控制的病变，单一基因 调控的转基因动物模型还不能够全面进行 AD 的相关研究。 tauP301L及 Tg2576 双重模型可以制造出神经原纤维缠结与 淀粉样沉积并存的 AD动物模型，并能够有效地相互协同解 释;APP＆PS1＆tau的三重转基因模型更好的证实了 Aβ 沉积 所具有的年龄相关与区域相关特点，且较易杂交繁殖，在 AD 的病生领域有很广阔的研究空间［22］。 转基因动物有着重复性差、表达稳定性差、繁殖能力低、 繁殖周期长等劣势，同时培育转基因动物对实验室条件、资 金和研究者的理论水平和实践经验均有较高的要求，需要周 密设计，且制作复杂、费用昂贵。故目前转基因动物模型的 应用受到一定限制。但随着科技手段的进步，转基因动物模 型有着广阔的发展前景。 3 动物模型的前景 3． 1 复合模型的运用 D-gal 致衰老模型在老化型研究中 最为常用，具有价格低、操作方便、重复性高等特点，在此基 础上展开复合式模型研究，既能够兼顾与衰老相关的表现， 又能够模拟病理改变，多角度模拟 AD的情况。D-gal联合鹅 膏蕈氨酸损害神经通路，可模拟出老年斑、神经原纤维缠结 和 tau蛋白异常磷酸化等复合病理模型［23］。给小鼠联合腹 腔注射 D-gal和三氯化铝或 D-gal和亚硝酸钠后，小鼠脑组织 内出现 Aβ沉积，出现学习记忆力减退，脑内胆碱能系统功能 降低等类 AD 症状［24］。另外 D-gal 联合 Aβ 片段注射，可使 胆碱能神经元丧失功能，降低动物的空间分辨能力［25］。 301赵 波等:阿尔兹海默病动物模型的研究进展 迄今尚无针对上述几种复合式模型的造模效果进行比 较的研究，目前较多应用 D-gal联合 Aβ 片段注射进行造模， 但不同实验室使用的 Aβ活性片段(Aβ1-40、Aβ1-42、Aβ25- 35 及 Aβ1-28)及注射部位(海马内单点及多点注射、脑室内 注射)不同，何种造模方法效果较好，可操作性更强，尚无定 论。 3． 2 离体模型的研究 动物模型的展开与深入探索，在 AD 相关发病机制方面已颇见成效，今后应更加重视临床药物治 疗等方面的研究，这离不开细胞与分子水平方面离体动物组 织的实验研究。离体动物的细胞学与分子学的研究，也必将 推动临床检验与预防工作的开展。 综上所述，非人灵长类动物与啮齿类动物是制备 AD 模 型的最佳动物选择，而动物模型的制备包括老化型、损毁型 与转基因等多种类型，转基因型以及各项模型的联合应用将 更广泛的被用于研究之中。随着对 AD 的重视与技术手段 的更新，将会涌现出更理想的动物模型，来揭示 AD 的发病 机制与指导治疗。 参 考 文 献 ［1］ St George-Hyslop PH，Petit A． Molecular biology and genetics of Alzheimer’s disease［J］． CR Biol，2005，328:119 － 130． ［2］ Trancikova A，Ramonet D，Moore DJ． Genetic mouse models of neurodegenerative diseases［J］． Prog Mol Biol Transl Sci，2011， 100:419 － 482． ［3］Kimura N，Yanagisawa K，Terao K，et al． Age-related changes of intracellular Abeta in cynomolgus monkey brains［J］． Neuropathol Appl Neurobiol，2005，31:170 － 180． ［4］Geula C，Wu CK，Saroff D，et al． Aging renders the brain vulnera- ble to amyloid protein neurotoxicity［J］． Nature Medicine，1998， 4:827 － 831． ［5］崔勇华，朱玉华． 利用小鸡印记行为建立学习记忆模型［J］． 实 验动物科学与管理，2004，21:40 － 42． ［6］ Link CD． C． elegans models of age-associated neurodegenerative diseases:lessons from transgenic worm models of Alzheimer’s dis- ease［J］． Exp Gerontol，2006，41:1007 － 1013． ［7］Kimura N，Tanemura K，Nakamura S，et al． Age-related changes of Alzheimer’s disease-associated proteins in cynomolgus monkey brains［J］． Biochem Biophys Res Commun，2003，310:303 － 311． ［8］Díez-Vives C，Gay M，García-Matas S，et al． Proteomic study of neuron and astrocyte cultures from senescence-accelerated mouse SAMP8 reveals degenerative changes［J］． J Neurochem，2009， 111:945 － 955． ［ 9］ Takahashi R． Anti-aging studies on the senescence accelerated mouse (SAM)strains［J］． Yakugaku Zasshi，2010，130:11 － 18． ［10］Liu L，Lu Y，Kong H，et al． Aquaporin-4 deficiency exacerbates brain oxidative damage and memory deficits induced by long-term o- varian hormone deprivation and D-galactose injection［J］． Int J Neuropsychopharmacol，2011，1:1 － 14． ［11］Sun ZZ，Chen ZB，Jiang H，et al． Alteration of Aβ metabolism-re- lated molecules in predementia induced by AlCl3 and D-galactose ［J］． Age，2009，31:277 － 284． ［12］Schliebs R，Arendt T． The cholinergic system in aging and neuro- nal degeneration［J］． Behav Brain Res，2011，221:555 － 563． ［13］Rodrigues L，Dutra MF，Ilha J，et al． Treadmill training restores spatial cognitive deficits and neurochemical alterations in the hippo- campus of rats submitted to an intracerebroventricular administration of streptozotocin［J］． J Neural Transm，2010，117:1295 － 1305． ［14］Dodel R，Balakrishnan K，Keyvani K，et al． Naturally occurring autoantibodies against β-amyloid:investigating their role in trans- genic animal and in vitro models of Alzheimer’s disease［J］． J Neu- rosci，2011，31:5847 － 5854． ［15］Cuello AC，Ferretti MT，Leon WC，et al． Early-stage inflammation and experimental therapy in transgenic models of the Alzheimer-like amyloid pathology［J］． Neurodegener Dis，2010，7:96 － 98． ［16］Seino Y，Kawarabayashi T，Wakasaya Y，et al． Amyloid β accel- erates phosphorylation of tau and neurofibrillary tangle formation in an amyloid precursor protein and tau double-transgenic mouse mod- el［J］． J Neurosci Res，2010，88:3547 － 3554． ［17］Bondy SC． The neurotoxicity of environmental aluminum is still an issue［J］． Neurotoxicology，2010，31:575 － 581． ［18］ Rodella LF，Ricci F，Borsani E，et al． Aluminium exposure in- duces Alzheimer’s disease-like histopathological alterations in mouse brain［J］． Histol Histopathol，2008，23:433 － 439． ［19］Ounallah-Saad H，Beeri R，Goshen I，et al． Transcriptional regu- lation of the murine Presenilin-2 gene reveals similarities and differ- ences to its human orthologue［J］． Gene，2009，446:81 － 89． ［20］Bader Lange ML，St Clair D，Markesbery WR，et al． Age-related loss of phospholipid asymmetry in APP(NLh)/APP(NLh)x PS-1 (P264L)/PS-1(P264L)human double mutant knock-in mice:rel- evance to Alzheimer disease［J］． Neurobiol Dis，2010，38:104 － 115． ［21］Morgan D，Munireddy S，Alamed J，et al． Apparent behavioral benefits of tau overexpression in P301L tau transgenic mice［J］． J Alzheimers Dis． 2008，15:605 － 614． ［22］Sa oddo S，Caccamo A，Kita zawa M，et al． Amyloid deposition precedes tangle formation in a triple tralisgenic model of Alzheimer’s disease［J］． Neurobiol Aging，2003，24:1063 － 1070． ［23］李亚明，朱粹青，林水淼，等．老年性痴呆大鼠模型建立的研 究［J］． 老年医学与保健，2001，7:214 － 217． ［24］Perl DP． Exposure to aluminium and the subsequent development of a disorder with features of Alzheimer’s disease［J］ ． J Neurol Neu- rosurg Psychiatry，2006，77:811． ［25］李 亚，江 岩． β-AP 对衰老模型大鼠开场行为及学习记忆 能力的影响［J］．曲阜师范大学学报，2000，26:73 － 75． (收稿日期:2011 － 08 － 20) 401 神经解剖学杂志， 2012 年 1 月第 28 卷第 1 期