溶菌酶及其应用前景

中国食品添加剂 China Food Additives 1999 No ． 4 功能 、性 质等 的进一步深 人研究 ，茶 多酚可 望在将来 为人类带 来更大 的福利 。 参 考 文 献 川上 正 于 ．食 品工 业， 1996，39f6]：75 佐野满昭，佐木清隆 ．食品 卫生， 1996，37(1)：38 黄桂宽，陈闻文 ．食品科学．1996，l7fI1：12 杜晓，何春雷 ．中国茶叶加工，l996，(1)：38—4() 安田英之 ．食品工业．1992，35(1 81：28 尤新辉 ．食品工业 (台)．1997．29(31：10一l8 唐裕芳 ．茶叶通迅，1998，(3)：26—26 蒋作明，童华荣 ．茶的综合利用 ．重庆：西南师范大学出版社 ，1995．179—2l8 王洪 新 ．粮食 与食 品 工业 ， 1994．(1)：6—9 尤新辉 ．食品工业 (台)，1992，24(12)：16—27 严 鸿德 ．茶 叶深 加 工技 术 ．北 京 ：轻 工 业出 版社 ， 1998 无锡轻工大学科学园有限公司编 ．无锡：科技成果编，1999 深井克彦 ．食品工业，1996，39(21：79 原征彦 ．食品工业，1996，39(1o)：78 佐野满昭 ．食品卫生学杂志，1996，37(1)：38 々 芒 ．食 品 T业 ， 1995．38(10)：79 蔼I 牵 ，两 I 碇 溶 茵 酶 及 其 应 用 前 景 一 尹宁 丁 f ／ (天津轻工业学院食工系 天津，300222) 溶菌酶 (Lysozyme，EC3．2 1．17)，又称 胞壁质酶 ，是 由 l29个 氨基酸构成 的单纯碱 性球蛋 白，化学性质非 常稳定， 当 pH 值在 l_2～ll_3范 围 内剧 烈 变 化 时 ，其 结 构 几乎 不变 ；在酸性环境中，溶菌酶对热的稳定性 很强，pH4～7，l00℃ 处理 lmin仍能保 持原 酶 活 性 ； pH3时 能 耐 lO0 ℃ 加 热 处 理 45min“ 。在干燥条件 下 ，溶 菌 酶可 以长期 在室温下存 放。其纯 品为 白色或微 黄、黄色 的结晶体 或无定形粉末 ，无臭、味甜 ，易溶 于水、遇碱易破坏、不溶于丙酮和乙醚等。 细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是 由N一 乙酰氢 (N—acetylglucosamine) 及 N一 乙酰胞壁酸 (N—acetylmuramic acid) 交替 组成 的多聚物 ，胞壁 酸残 基上可 以连接 多 肽，称 为 肽 聚糖 (Peptidoglycan)。 多 糖 以直链 形式存在 ，彼此邻 近的多糖链 之间可 以通 过肽链部分 相互 连接 ，从 而形成 三维结 构 。溶菌 酶 专 一性 地 作 用于 肽 聚糖 分 子 的 N一 乙酰 胞 壁 酸 (NAM ) 与 乙酰葡 萄糖 氨 (NAG)之 间的 一l，4糖 苷 键 ，结 果 使 细 菌 细胞 壁变 得 松 驰 ，失 去对 细胞 的 保 护 作 用 ，最后 细胞溶 解死 亡 “’2 。表 l为 细菌 细 胞壁 对溶 菌酶 的敏感性 。 由于溶菌酶 的这种 作用，因而在食品、医学、基因工程等领域 获得 了广泛 的应用 。 1 溶菌酶之来源 人、 动物、植物 、微生物和鸟类蛋清 中 都具有此酶 。 1．1 人和 哺乳 动物 中的溶菌 酶 一 39 一 桫 ／ 松 ，J ● 2 3 4 5 6 7 8 9 m ¨ B H 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 1999 No．4 表 1 细菌细胞壁对溶菌酶的敏感性 细菌细胞壁 敏感性 细菌细胞壁 敏感性 B．cel~us 52 M ．1ysodeikticus 98 B．cereus．mysoides 5l M IOSeUS 75 B megaerium 95 M ．tetragenus 85 B．punmilis 95 M ．uI’ca 96 Bacillus sp． 84 M ．yarians 93 B stearothermophilus 80 S．1utea 98 B．SUbtilis 69 Spomsarcina ul'eae 98 B．thuringiemis 40 Stap albus l3 Corynebacterium SP． 92 Stapn．aul~us 9 L．arabinosus 22 Stapn dtreus 32 M ．dtreus 72 Stapn．sapmphyticus 9l 注：对溶菌酶的敏感性以浊度减少表不 (％)(3 7 c ， 24h) 在 人和许 多 哺乳动物 的组 织和分泌液 中 均发现 有该酶存 在 。已知在人的眼泪 、鼻粘 液 、唾液 、乳 汁等分 泌液中及肝 、肾、淋巴 组织 中含有此 酶 。人 体之溶菌酶 由 130个氨 基酸组成 。含 4个二硫 键，一级结构 的氨基 酸的组成 和排列顺 序 与鸡蛋 清溶 菌酶有较大 差异 ，但 与鸡蛋 清溶菌酶 的多级结构却 十分 相似，但人溶菌酶之活性 比鸡蛋清溶菌酶活 性高 3倍 。 目前 ，从 牛、 马等 的乳 汁中 已分 离出了溶菌酶，其理化性质与人溶菌酶基本 相似，但结构尚不清楚 。 1．2 植物之溶菌 酶 目前 已从木瓜 、芜菁 、大 麦、无花果 和 卷心菜等 植物 体中分离 出该酶。此种酶 对溶 壁小球菌活性较鸡蛋清溶菌酶低，但对胶体 状 甲壳 质的分解 活性则 为鸡蛋清的 10倍 左右。 1_3 微 生物 之溶菌酶 微生物产生的溶菌酶可分为 7类：a，蛋 白酶与 内肽酶 ，可分解 细胞壁缩 氨酸 聚糖的 缩氨酸键；b，酰胺酶，能切断连接聚糖和缩 氨酸 的 N一 乙酰胞壁 酰 一L一 丙氨酸 键；C， 内 一N一 乙酰己糖胺酶 ，可分解构 成细胞 壁 骨架的肽聚糖 ；d， 一1，3、 一1,6一 葡聚糖 酶、甘露糖酶，可分解酵母菌细胞壁；e，壳 聚糖酶，与葡聚糖酸酶共同作用，可分解霉 — — 40 —— 菌和酵母； 磷酸甘露糖酶，与葡 七f‘露糖酶 共同作用．可分解原生质；g，脱 乙酰壳多糖 酶 ，主要 分解 毛霉 和根霉 。 1．4 鸡蛋清 中的溶菌酶 鸡 蛋清 中约含有 O_3％ 的 溶 菌酶 ， 可分 解溶壁小球菌 、黄色八迭球菌 和巨大芽孢杆 菌等 革 兰 氏 阳性菌 ，但 对 革 兰 氏 阴性 菌 无 效 。 当有 EDTA存 在 时，某 些 革 兰 氏 阴性 菌也可 为该酶分解 。鸡蛋 清 中的溶菌 酶是动 植物 中溶菌酶 的典型代 表，是溶菌 酶群 中重 要研究 者，也是 目前 了解最清楚 的溶菌酶之 一 。 该种酶分 子 量 为 14，000，等 电点 为 l1．1， r 最适温度为 50℃ ，最适 pH7，其化学性质 非常稳定 ，pH在 1．2～l1-3范围内剧 烈 变化 时 ．结构 仍 稳 定不 变 ，遇 热 也 很 稳 定 ，在 pH4--7范围内， 100℃ 处理 lmin，仍保 持 原酶活性 在碱性环 境 中对热 稳 定性 较 差 。 ， 其一级结构由 129个氨基酸组成，维持其结 构的主要作 用力为二硫键 、氢键和疏水 键。 1．5 鸟蛋清中之溶菌酶 已从其它鸟类如鹌鹑、珍珠鸡、火鸡等 的蛋清 中分 离纯化 出溶菌酶 ． 与鸡蛋 清之溶 菌 酶 活性 非 常相 似 ，也 由 129个 氨 基 酸组 成，虽排列顺序有所不同，但活性部位的氨 基酸排列则大体相同。 1．6 噬菌体产生 的溶菌酶 该 酶是 一 种 特异 性 的 酶 。 由 噬 菌 体 感 染 、诱 导产生 ，但未被感 染的宿 主细胞上不 ／ 存 在该酶 。 2 溶菌酶之提取 2．1 鸡蛋清中溶菌酶之提取 2．1．1 吸附法 蛋清一 过滤 (90目) 一 吸 附 (每 kg 蛋 清 加 150g 724型树 脂)一 倾 去 蛋 清、 冲洗并控干树脂一 10％(NH ) o 洗脱一 洗 脱 液中加入晶体 (NH ) o (30g／100m1)沉 淀溶菌酶一 沉 淀干燥一 粗制品 2．1。2 结 晶法 蛋 清一 添 加 NaC1使 其 浓 度 为 5％、 维普资讯 http://www.cqvip.com 中国食品添加剂》 China Food AdditiveS pill0．0左 右一 加入少许溶菌 酶作 晶 种一一 玲 却 (4℃ ， l～ 2周 ) 结 晶品 该法 所制溶菌酶 纯度高，收率好 ，具 有 广阔的应用前景。 2．2 蛋壳中溶菌酶之提取 蛋壳 中溶菌酶提取工 艺 为：蛋壳 一 1％NaC1抽提一 滤液加热去 除 杂蛋 白一 加聚丙烯酸凝 聚一 溶解凝 聚物，加氯化钙 沉 淀一 上 清液结晶一 粗制 品 2．2．1 抽提 新 鲜或冷 冻 保存 的蛋 壳 (1 ) 经洗 净、破碎后 ，加 1％ NaCI 750ml(事先用 10％ HC1调 pH 值 6．0)．加 热 至 40℃ ，在 连续 搅 拌下 抽 提 30--40min， 然后 用 纱布 过滤 ． 滤液 再加 l％ NaC1液 500ml抽 提 一 次， 合 并两次 滤液。 2．2．2 除杂 滤液 用 20％ 乙酸 调 pH4．6，迅 速 升 温 至 75～ 85℃ ，保持 3mm，速 冷至 室 温 ，静 置 5～ 6h，用 350目尼龙绢布过滤或 3000r／min离 心 20min，去 除沉 淀 中的 杂蛋 白，滤 液 或 上 清液 备用。 2．2．3 凝 聚 滤 液 (或上清液)用 20％ NaOH调 pH， 边搅拌边滴加 10％ 聚丙烯酸 (Mw60 000～ 80，000)，量 约 310ml，静 置 15--30min．去 除 上清 液。 2．2．4 解 聚 沉 淀 中加入少 量蒸 馏 水 (约 20m1)，并 加入少量 15％ Na，CO ，使沉淀溶解 ，此时 pH 约 6．0，再 滴加 50％ 氯化钙 25ml，形 成 聚丙烯 酸钙沉淀 ，使溶 菌 酶解 离 下来 ，过 滤 (350 目尼龙绢布)，滤液备用。 聚丙烯 酸可通过硫 酸处理沉 淀而加 以回 收。 2．2．5 结 晶 滤 液 用 20％ NaOH 调 pH9．5，加 NaC1 至终 浓度 5％，静 置 3--4h，产 生结 晶 即为 粗 制品 。如在结晶时加入少许 晶种 可加速结晶 l999 NO．4 过程的进行 。制得 的溶菌酶 粗制品可经纤维 素柱层 析或 Sephanose琼 脂糖柱 层析精制。 3 酶活力的测定 溶菌酶酶活性的测定方法通常有两种 ：⋯ 以细胞壁作 为底物，用 作用前后浊度 的变化 表示酶活力大 小；(2)以溶 壁小球菌培养 液为 底物 ，用作 用前后浊度 的变化表示酶 活力大 小 由于 两种方法都是 用固液两相反应 ，难 以准确测定反 应速度，故有 人用水溶性 多糖 乙二醇 甲壳质制 备成均匀态 底物，用来测定 酶活力 。 。 4 溶菌酶的应用 4．1 溶菌酶在食 品工业上 的应用 溶菌酶本 身是 一种无毒 、无害、安全 性 很高的高盐基 蛋 白质，且具有 一定 的保健作 用，它仅能选择性地 分 解 微 生物 的细 胞 壁， 而不能作用于其它物 质。 该酶对革 兰 氏阳性 菌 中的枯草杆菌 、耐 辐射微球菌有 强力分解 作 用。对人肠杆菌 、普 通变形菌 和副溶血性 弧菌等 革 兰 氏 阴性 菌 也有 一 定 程度 溶 解 作 用，其最 有效浓度 为 0．05％。与植酸 、聚 合 磷 酸盐 、甘氨酸等配 合使用 ，可人人提高其 防腐效果 。 4．1．1 海产品及水产 品的保鲜 虾、鱼、蛤蜊等在含 氨酸 (0．1mol／L)、 溶 菌酶 (0．05％) 和 食 盐 (3％) 的溶 液 中 浸渍 5min后，沥干，5℃ 保存 9天后无异 味、无 色泽变化 。 4．1．2 低度 酒的 防腐 日本 用溶菌酶代替 水杨 酸用于 清酒的 防 腐 。清酒酒 精含量为 15％～ 17％(V／V)，大部 分 微生物不能生存 ，但 有一 种叫做 火落菌的 乳 酸菌 则能生长 ，并 引起产 酸及 产生不愉快 臭味。过去常加 入水 杨酸作 防腐 剂，但 由于 水杨酸有 一定毒性 ， 目前 日本 已成 功用鸡蛋 清溶菌 酶代替水杨 酸作防腐剂 。其 加入量为 l 5mg／kg。此外 ，还可用于料 酒的 防腐 。 4．1．3 乳 制品保鲜 新 鲜 牛乳 中含 有 13mg／100ml的 溶 菌 一 41 — 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additives 1999 No ． 4 酶，人乳中含量为 40rag／m1。在鲜乳或奶粉 中加入一定量溶菌酶，不但可起 到 防腐 作 用，而且有强化作用，增进婴儿健康。 4．1．4 干酪的髁 鲜 干酪在 发酵过程 中，常 因酪 酸菌作用 产 生酪酸和气 体，易造成 干酪膨胀 。溶 菌酶对 乳酸菌的生长很有利，对污染菌所造成的酪 酸发酵有抑制作 用，这种 特性是一般 的防腐 剂所 不能达到 的。在干 酪生产 中添加一 定量 的溶菌酶，可防止微生物污染而引起的酪酸 发酵，保证干酪品质。 4．1．5 水产熟制品及肉类熟制品的保鲜防腐 水 产熟 制 品如鱼 丸，香肠 、红肠等 肉类 熟制品用含 1％ 明胶、0．05％ 的溶菌酶液浸 渍后再保存，可延长保质期。 4．1．6 糕 点及饮料 的防腐 奶油蛋糕是容易腐败变质的食品，加人 溶菌酶具有一定的保健作用。此外，溶菌酶 还可应用于 pH6．0～7．5的饮料 的防腐 ㈨。 4．1．7 保健食 品添加 剂 溶菌酶 是高 盐基 蛋 白质 ，具有 一定的保 健作用：有抗感染及抗生素效力增强作用； 有血液凝 固和止血作 用；有组织再 生和瘢痕 形成促进作 用等 。 4．1．8 婴儿 食品添加剂 溶菌酶 在婴 儿体 内可 以直接或 间接促进 婴 儿肠 道细 菌 双歧 乳 酸 杆 菌 (Lactobacillus bifuts)的增殖；促进婴儿 胃肠 内乳酪蛋 白 形成微细 凝乳 ，有利于 婴儿 消化 吸收；可以 促进 人工 喂养婴儿肠道 细菌 的正 常化：能够 加 强血 清 灭 菌 蛋 白 (Properdin)， 一球 蛋 白 (y—globutin)等体 内防御 因子 对感 染 的 抵抗力 。特别对早产 婴 儿 有 防止体 重 减 轻、 预防消化器官疾病、增进体重等功效。所以 溶菌酶是婴儿食 品、婴儿配方奶粉 、饮料等 的 良好添加剂 。 4．2 酶工程上 的应 用 近年来，溶菌酶已成为基因工程及细胞 工程必不可 少的工具 酶 ，用 以制造 和提 取菌 一 42 一 体内的活性物质如核酸、酶及活性多肽等。 4．3 在 医学上 的应用 溶菌 酶 对预 防 龋 齿 有 一 定 效 果 。据 统 计 ，龋 齿在 儿 童 中 的 发 病 率 达 90％ 以 上 。 龋齿是在齿质、糖和病原菌 3种因子相互作 用 时发生的， 防止其 中一个环节便 可产生预 防效果 。 口含含有溶菌 酶的 口腔药片或 用漱 口液漱 口，经 电子显微镜 观察发现 ， 口腔中 细菌 明显溶 解，大多数细 菌变成带状无 定形 物质，只有少数仍呈球形。如与抗菌素合用， 则具有 良好 的协 同作用 。在临床应用上 ，溶 菌酶多用于 副鼻窦炎 、 口腔溃疡、扁平苔藓 和渗 出性 中耳 炎等疾病 的治疗 。此 外，溶菌 酶作 内服剂 时，可抑制流行性 感冒和腺病毒 的生长、抗感 染及抗炎症 ，还具有 多种药理 作用 。 ’ 溶菌酶 杀菌防腐， 由于不经 过加热 ，属 于 冷杀菌 ，因而避免 了高温 杀菌对食 品风味 的破 坏作用 ，尤其 对热敏感 的物质 更具 有重 要 意义。如茶饮料 经加热杀菌处理后 ，不仅 会产 生 杀菌不 良气 味 (Retort smel1)，而且 使 汤色变深变 暗。虽然 当前很多学者 已对超 高温杀菌、高压杀菌、辐射杀菌等新兴杀菌 方法 进行 了大量研 究，但都不是最理 想的杀 菌方法 ，采用冷杀菌，由于无需加热，因而不 仅保持了茶汤原有的风味，而且保证了食品 安 全性 和 贮藏 性 。此 外，溶 菌 酶 对 人 体 安 全、无毒、无害，且具有一定的保健作用，因 而加入食品中进行防腐保鲜不仅起到防腐作 用 ，而且 强化 了营养 价值 。溶菌酶在 医学和 酶工程上的应用正方兴未艾。当前，溶菌酶 的研究和应用尚处于起步阶段，开发新的溶 菌酶资源，降低生产成本，才能促进溶菌酶 在实践中的应用：可喜的是，酶工程的发展 进步，使人类可以合成酶，开发合成杀菌谱 广 、成本低 、安全性 高的溶菌酶是将来 的一 大课题。可以预见，溶菌酶在 21世纪将 发 挥越来越 大的作用 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 《中国食品添加剂》 China Food Additiv 1999 No ． 4 参 考 文 献 潭斌 ．食品科技，1998，(51：32—33 阎隆飞，李明启 ．基础生物化学 ．北京：农业出版社，1992，149—195 刘仲敏，何伯安 ，食品与发酵工业，1995，(5) 80—82 章银良 ．食品工业科技 ，1999，2 1)：32-33 张宗岩 ．食品科学，1995，1 6(9)：59—61 林亲录，王德安 ．食品科学，1994，(11)：37～40 赵哲勋 ．食 品科学，1993，(1)：l1—14 尹 林 ．中 国人 民大 学 资料 中心 ，1991，5—25 郑士民 ．中国乳 品工业，1986，(5)：133—135 Frank，H Food Technology，1998，(1 5)：1—3 裔争料 ，壶 ．两 割． 己 厂 复合香辛料在食 品中的应用 吕心泉 王 蕊 + 安辛欣 王春霞 (南京农业大学食品科技学院 南京，210095) 香辛料是 一类既具有 香、辛气 味，又 具 有麻 、辣 、苦 、甜等滋 味的天然植物性调味 品，广泛应用 于食 品加 工业。香辛料 除对食 品起 调 色、 调 香、增 味作 用外 ， 还 具 有 抗 菌、防腐 以及较强 的抗 氧化作用 ，许 多香辛 料 还是重要 的中药 材， 如迷 迭 香 的油 树脂 ， 其抗 氧化 能力 比人工 合 成抗 氧 化剂 强 10多 倍 ； 白芷 能消肿排脓 ，生肌止痛 国内外调 味料发展很快，国际市场上新型复合调味料 琳 琅满 目，有 中式 、西式，形成 了系列 ，如 瑞 士的 “康 粒 鸡 精”， 荷兰 的 “牛 肉精” 等 但 目前 国 内市场 香辛料品种较单一 ，如 生姜粉、五香粉、火蒜粉等，易受潮，使用 也不甚方便。因此我们将多种香辛料科学复 配，并使其具有专门功能，如用于鱼 肉汤、 羊肉、烧鸡中，使之风昧独特，香味柔和。 另外 ，我们将大块 原料经净化 、粉碎 ，并以 棉纸袋包装作为最终处理，不仅使用方便， +江苏食品工业学校食品工程系 弋 le{ 不碜牙，而且可多次使用，适应了厨房消费 社 会 化 的趋 势。 现 已成 功 研 制 了 五 香茶 叶 蛋、烧鸡、鱼肉汤、红烧羊肉4种复合香辛 料，取得 了较好 的效果 “ 。 1 材料 与方法 1．1 材料 八 角 、生 姜、黑 胡椒 、 白胡 椒 、 肉桂 、 红茶粉、葱粉、芫荽、咖喱粉、小茴香、大 蒜 、香 菜、 豆蔻 、 胡萝 卜、 肉豆 蔻 、辣 椒 等 (市售)。 白芷 、丁香、桂皮 、砂 仁、 山奈 (购于 中药 店中)。 鲜鸡 蛋 (市 售)、 鲢 鱼 (市 售 )、羊 肉 (市售 )、鸡翅 (购于超市 )。 1．2 方法 先是对原料称重，再按 3g调味料／10O0g 原料，换算出所需复合香辛料量，然后进行 烹调。制作出的样品进行感官评定，一切均 按规定的条件和要求进行 。 。 ． 一 43 一 ● ，一 3 4 5 6 7 8 9 加 ¨ 维普资讯 http://www.cqvip.com