人血浆前白蛋白的分离和纯化

，0 一 2 二 l驰 二≮ j 专恕 J 悔 第 一 科 人 学 报 ＼eta Univ rs1ta‘ M kuiicinMis Secondae Shanghai 人血浆前 白蛋白的分离和纯化 上海第二医科大学实验桉医学教研室(200025) 墼—垦料 戴腾昌 夏宗勤 ≥ ^ 摘 要 1建立 一 种新的分离纯化』、血浆前门蛋白(PA)的 法 由酚试剂沉淀后的血浆，通过 离子交换树脂分 离所得PA．用高效液相色潜仪(HPLC)进行纯化．经SDS一聚丙烯酰胺凝胶 电淋 测定，其分子量在55 000左右．纯度达到电泳纯和免疫绝。此法步骤简单．用血量少 ．适用 于实验室 常规操作和临床人体研究 关键词 前 白蛋 白： 分离纯化： 高效液柑色谱仪 前白蛋白(prealbumin，PA)是由肝细胞 合成的一种血浆蛋白质，具有重要的生物活 性。在血浆中PA与甲状腺素结合，参与血液 中甲状腺激素的转运，也能 与视黄醇和视黄 醇结合蛋 白三者缔合成复合物 参与维生素 A的转运和代谢 ⋯。在进行维生素A 和甲状 腺素代谢、蛋白质营养不良和肝脏毒性等方 面研究时，都需要用纯化的PA 但 往所报 道的分 离纯化方法，大 多需要较大量的血 浆，步骤繁琐 操作复杂，难 以用于实验室常 规操作和临床研究。我们参 照有关方法，用 阴离子交换树脂对PA进行粗分后 。，首次运 用高效液相色谱仪纯化PA 建立了 ’种适用 于临床研究的分离纯化人血浆PA的方法。 材料与方法 材料 1．血浆 取自正常献血者。 2．试剂 DEAE Sephacel(Pharma． cia)．抗PA血清(上海生物制品研究所) 低分 子量蛋 白(MW：17 500～94 000．上海采 风试剂厂)，Tris(Sigma) 琼酯糖(Serva) 舣 丙烯酶胺(Sigma)．考马斯亮蓝R一250(Flu ka)．其它化学试剂均为国产纯试剂。 卫生部科学研究基金资助项 ]¨ ¨ f：海第二 科大学化学教研室 3．仪器 ECONO低压层析系统(BIO— RAD)，高效液相 色谱仪 (BIO—RAD)，垂直 电泳仪(BIO—RAD)。 方法 1、阴离予交换树脂分离PA 10m1人血 浆中溶解2g NaC1，加人5．5％(V／V)酚的水 溶液，混匀，离心(12 000r／min×15min)。上 清液过滤后 置4℃冰箱用蒸馏水透析48h 换缓冲液A(0、05mol／L Tris，pH 7_5) 继续 透析。待 E低压层析分 离采用DEAE—Se- phacel层析柱0．5cm×6cm，依次用缓冲液 A 缓冲液B(0、05mol／L Tris，含0．1 mol／L NaC1，pH7．5) 缓冲液c(o．05mol／L Tris，含 0．15 mol／L NaC1，pH7．5)，缓冲液D(0．05 mol／L Tris．含0．4 tool／L NaC1．pH7．5诺 脱 洗脱速度0．5ml／min，用280nm波长紫外 检测仪 自动记录，收集各蛋 白组分。 2．高效液相色谱仪(HPLC)纯化 色谱 柱：Bi0 戥l Tsk 400 f300×7．5mm)；流动 相 ：0．02mol／L NaH PO ，0．05mol／L Na SO pH6_8：检测：UV 280nm；流速：1．0 ml／min；进样量：50pl。色谱柱经流动相平衡 后 J 样。经低压层析粗分离的样品用双蒸水 透析．经浓缩后 上柱 收集 色谱 图上显示的 扦蛋 白组分。 维普资讯 http://www.cqvip.com 赵 霞等 人巾『浆前白蛋白的分离和纯化 3．SDS一聚丙烯酰胺凝胶电浊鉴定 j乏 用Klaus Weber等的方 法，凝胶浓度 为 7．5％，SDS浓度为0．1％，用0．01％考马斯亮 蓝R一250染色。样品分别为方法1中粗分离 的PA(以下简称粗分PA)和方法2中纯化的 PA(以下简称纯化PA)，并与标准分 子量对 照，即可推算其分子量，以确证PA 4．双向免疫扩散鉴定 用巴比妥缓冲液 (O．025mol／L pH8．6)配成浓度为1．5％的琼 脂铺板 ，以上述粗分和纯化的PA分 别与抗 PA血清和兔抗人全血清进行双向免疫扩散 以确证分离的蛋白为PA。 结 果 分离与纯化 血浆经酚试剂沉淀后 已去除了纤维蛋 白和球蛋白等大部分蛋白质。经DEAE Se． phacel离子交换层析得到粗分PA。层析图 谱见图1 随着梯度洗脱的进行 杂质蛋白逐 渐被洗脱下来，而前白蛋白仍保 留 层析柱 上。由图可知，只有很少量的杂蛋 白被缓冲 液B洗下，大部分则是被缓冲液C洗脱，当杂 蛋白的吸收峰回到基线后，再用缓冲液D洗 脱、可得到一个非常尖锐的吸收峰。经鉴定， 此峰主要成份为PA 图1 DEAE—Sephacel层 析紫 外榆 测 粗分 的PA用HPLC凝胶色谱柱进一步 纯化，色谱图见图2。峰l 3为杂蛋 白，峰2经鉴 定为纯PA 图2 HPLC图谱 PA的鉴定 1分 子量测定 从SDS一聚丙烯酰胺凝 胶电泳测PA分子量。以标准蛋白分子量对电 泳相对迁移率作图，由图3求得PA分子量为 55 000，与文献报道PA分子量相符 。 同3 SDS-聚丙烯酰胺凝腔电泳测PA分子量 为标准蛋白分子量，自上而下分捌为：94 000 67 000，43 000．30 000 。为PA分子量：55 000。 2．双向免疫扩散鉴定 在图4中，粗分 PA和纯化PA均与抗PA血清产生单一沉淀 D 维普资讯 http://www.cqvip.com 上 海 第 二 医 科 大 学 学 报 Acta Universitatis Medicinalis Secondae Shanghai 线，说明所得制备物是PA。 一 譬 。 鹃0 。 |曩 媛l _夸。鹫；l' i 0 图6 SDS一聚丙烯酰胺凝腔 电泳 图谱 左：纯化PA 右：粗分PA 3．纯度鉴定 用SDS一聚丙烯酰胺凝胶 电泳鉴定分离纯化的PA纯度．结果见图5．经 HPLC纯化的PA只显示一条蛋白区带。经凝 胶扫描定量，纯度达95％ 以上，而粗分PA的 纯度为83％，见 图6。 用粗分和纯化PA与兔抗人全血清进行 免疫双扩鉴定，结果：粗分PA与抗血清之间 有沉淀带出现．而纯化的PA与抗血清之间则 未见沉淀带(见图7)。达到免疫纯度。 圈6 凝胶扫描分析图谱 a：纯化PA b：粗分PA 维普资讯 http://www.cqvip.com 赵 霞等 人血浆前 白蛋 白的分离和纯化 201 0％ 图7 PA 兔抗人全血清的免疫双扩示意图 左上IL：纯化PA 右上孔：粗分PA 下孔：兔抗人全血清 讨 论 正 常 情 况 下 ，PA与 视 黄 醇 结 台 蛋 白(retinal binding protein，RB P)结合成 高亲台力的复台物而存在于血液中，所以在 纯化PA过程中首先要解决的是将此两种蛋 白质分开。研究表明，PA与RBP复台物在低 离子强度下是不稳定的 ，故用低离子强度 缓冲液可将此复合蛋 白分离，并通过凝胶过 滤得到不含PA的RB Pl 但此法难以制得不 含RBP的PA。此后有文献报道用亲台层析 法，以RBP作为特异配基纯化PA ，但需专 门制得RBP纯品，且最后还需用制备性凝胶 电泳进行纯化。我们在 比较多种方法后选择 了酚沉淀技术 ，去除了大部分血清蛋白，包 括RBP。 PA分子是由4个相同亚基结合而成，其 化学性质相对稳定，对变性作用具有不寻常 的抵抗性。在pH 3．5～12之间，分子结构几乎 无变化。强酸、强碱或0．1％ SDS不能使结合 的亚基解离 。已有文献报导用多种方法测 得 的前白蛋白分子量均在55 000左右 。当 分别用6 mol／L盐酸胍、5 mol／L尿素含 0．1％ SDS和0．1 mol／L巯基 乙醇透析后．用 SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其亚基的 分子量为14 000_‘l 在本实验条件下，结合的 亚基不会解离，所以测得的分子量应为整个 蛋白的分子量，与文献报道一致。 - 关于PA的分 离纯化国外文献中早先用 多次柱层析法，即离子交换层析和凝胶过滤 层析 。此法步骤多，耗时长，损失大，需较多 血浆量。后来较多运用制备性凝胶电泳和亲 和层析法进行纯化 ，虽较前法有改进，但实 验要求较高，操作繁琐 ，不适宜实验室常规 研 究。本 实验在采 用酚试剂沉 淀、DEAE — Sephacel离子交换层 析后 ，首次运用 HPLC纯化PA，步骤显著简化，且操作简便， 由于提高了检测灵敏度，使所需血浆量大大 减少 ，最少只要2ml血浆，完全可以用于临床 人体研究。通过鉴定，分离纯化 的前白蛋白 达到 电泳纯和免疫纯度。我们已将此法用于 人体前白蛋白台成速率的测定，研究肝硬化 病人肝内蛋白质的更新，获得了满意的效 果 。 参考文献 1 Amiram Raz．Dwitt S Goodm an．The inter- action of thyroxine with human plasma prealbumin and with th e prealbumin-reti- ha1．binding protein complex．J Biol chem， 1969；244(2 ：323O 2．PA Peter6on．Characteristics of a vitamin A．transportingprotein complex occurting in human serum．J Biol Chem．1971；246：34 3 M ark M bashor， et a1． Purification of prealbumin from human serum ．Preparative biochemistry，1987；17(3)：209 4 W i1lim T Branch．et a1．Throxine·binding prealbumin．J Biol Chem，1971；246(19)：6011 维普资讯 http://www.cqvip.com I 拇 第 ： 压 科 大 学 学 报 Acta Univer~itatis M edicinalis Secondae Shanghai Vol 15 No 3 1995 5．Gonzalez G．RE Ofrord The subunit struc． ture of prealbumin．J Biochem，1971；125：309 6．金宏．等。视黄醇结合蛋白的分 离纯化厦其抗血 清的制备 生物化学与生物物理进展．1993；20(6)： 460 7．Tom Pettersson． et al Different type of m icroheterogeneity of human thyroxine． binding prealbum in． Biochem i stry， 1987；26：4572 8．PH DE Nayer，et al A simplified method for the preparation of 曲 yr0xine．binding prealbumin． Biochim Biophys A cta， 1966；124：4]1 9 Navab M ， et a1． Rat plasma prealbumin Isolation and partial characterization J Biol Chem 1977；252：51o0 (1994—12-2O收稿) Isolation and Purification of Prealbum in from Hum an Plasm a ZhaoXia，et al Department of Nuclear Medicine，Shanghai Second Medical University，Shanghai Abstract Prealbumin was isolated and purifie~t from human plasma by means of precipitation of the contaminating proteins with dilute aqueous phenol， ion—exchange chromatography of DEAE—Sephacel and gel filtration on HPLC． The molecular weight as determined by SDS-PAGE was 55 000． Its homogeneity was verifled by two—dimensional immune diflusion and SDS—PAGE．This simple method which just needs a small quantity of blood is applicable for clinical research in most laboratories． Key words prealbumin； isolation and purification； HPLC 肿瘤坏死因子在急性胰腺炎及并发多器官衰竭中作用的研究 王建承，等 中华医学杂志 1995；75(3)：133 作者对32倒急性胰腺炎患者(水肿型l 例．坏死型17例．多器官衰竭B倒 血液中肿瘤坏死因子(TNF)、氧 自由基(OFR)以及内毒素血症在急性臃腺受病程发展中的作用进行了研究。结果表明TNF和OFR在急性胰 腺炎患者中舍量增高 (与正常对照组相 比户