PCR检测深部致病真菌感染的研究

中华皮肤科杂志2006年8月第39卷第8期ChinJDermatol，August2006，Vol39，No．8PCR检测深部致病真菌感染的研究刘军沈永年吕桂霞陈伟刘维达【摘要】目的探讨PCR在可疑深部真菌感染临床标本检测中的应用。方法对60份临床标本分别进行传统真菌培养以及真菌通用引物PCR和三重PCR检测。结果真菌培养阳性共l9份，其中白念珠菌lO份、烟曲霉2份、新生隐球菌2份、其他菌株5份(包括光滑念珠菌2份、热带念珠菌2份、克柔念珠菌l份)；真菌通用PCR检测共有2l份阳性，经三重PCR检测共有l5份阳性，分别为白念珠菌lO份、烟曲霉3份、新生隐球菌2份。PCR方法与传统培养方法相比．检出率差异无统计学意义。结论PCR检测可疑深部真菌感染临床标本快速简便，稳定性好，敏感性和特异性均较理想，适合临床实验室常规使用。【关键词】真菌病；念珠菌属；曲霉菌，烟；隐球菌，新型；聚合酶链反应Detectionofdeep-seatedpathogenicfungibypolymerasechainreactionLlUJut／,SHENYong-ni-an,LGui-xia,CHENWei,LIUWei-da．DepartmentofMycology,InstituteofDermatology,ChineseA—cademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042,China【Abstract】ObjectiveTostudytheclinicalapplicationofpolymerasechainreaction(PCR)inthedetectionspecimensfrompatientswithsuspecteddeep—seatedpathogenicfungalinfection．MethodsSix哆clinicalspecimensweredetectedwithpan—fungalPCRtriplexPCRandtraditionalfungalculture，respectively．ResultsNineteenspecimenswerepositivebyculture，consistingof10strainsofCandidaalbicans,2strainsofAspergillusfumigatus,2strainsofCryptococcusneoformansand5otherstrains(2strainsofCandidaglabrata，2strainsofCandidatropicalisandlstrainofCancb'dakmsei)：21werepositivebypan—fungalPCR；andl5werepositivebytriplexPCR，including10strainsofCandidaalbicans,3strainsofAspergillusfumigatusand2strainsofCryptococcusneoformans．TherewasnostatisticalsignificanceinthedetectionrateoffungibetweenthePCRandculturemethods．ConclusionThePCRprocedureisrapid，convenient,andreliableforthedetectionofdeep—seatedpathogenicfungiwithhigherspecificityandsensitivity，andmayberoutinelyusedinclinicallaboratory．【Keywords】Mycoses；Candida；Aspergillusfumigatus；Cryptococcusneoformans；PolymeraseChainReaction目前，真菌感染的诊断主要依据传统培养法，且对真菌菌种仍主要依据形态学和生理学等表型进行鉴定，往往周期长、阳性率低。早期诊断能提高机会性真菌感染患者的生存率。因此迫切需要发展快速准确的检测手段。我们分别选择了真菌通用引物和白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌的种特异性引物。通过PCR、三重PCR和热启动PCR。建立并优化对常见致病真菌及机会致病真菌的快速检测方法。通过对南京中大医院、江苏省肿瘤医院及其他综合性医院送检的60份可疑深部真菌感染临床标本进行真菌DNA快速检测。并与传统培养方法进行比较．证实PCR方法在临床应用的可行性。基金项目：江苏省卫生厅医学科技发展基金重大课题(H200203)作者单位：中国医学科学院、中国协和医科大学皮肤病研究所[刘军(现在南京大学医学院附属鼓楼医院皮肤科，210008)、沈永年、吕桂霞、陈伟、刘维达1通讯作者：刘维达。email：liumyco@hotmail．COm材料与方法439·论著·一、临床标本血液30份，脑脊液5份，尿液5份，痰液7份，支气管肺泡灌洗液8份，胸水5份，共计60份临床标本，分别来自南京中大医院血液科、江苏省肿瘤医院肿瘤内科以及其他综合性医院送来我科进行菌种鉴定的临床标本。除血液外。所有标本均离心后取沉渣用于DNA制备。二、主要试剂和仪器GPT试剂按文献[‘]配制；Tris一酚(pH8．0)；TaqDNA聚合酶(Promega、TaKaRaTaqTMHotStartVersion)；dNTPs(Promega、TaKaRa公司)；PCR仪(GeneAmpPCRSystem2400，Perkin—Elmer公司)：一次性真空采血器(BD公司)。三、菌种DNA的制备真菌基因组DNA制备方法参照文献[1]。维普资讯http://www.cqvip.com阴、P(n反应故jI腰控ih41．真坷川_JrjI物列：5一(A【。r【：(r(；G1((：t(FI‘一3：5一c，r【；A、Arr(，【’r{；AAA((，(A^一3，IIJ扩增fI1260I1ll的】)N^”段新隐球莆种特异引物：5A1“：A{(。。Ir¨：(：M-JAAf^：^11_3：5’一(A^c(；GCAFGCC_rf，|rmA(；Aq，一3．1IJ增⋯135lF·曲I)NA片段：婀f11_霉科-特蚌fl-rI物：51_lrr【：(A^l：I’((I：I’c_：(^c：3：5一’rA(-CTI，‘；AAA(：(f：t，一JlACG一3．nf∞tit545，et'JDNA片段：『【念球菌种特异-Pl：·jI物：5一：I1^：(，’rfA，。l一3；5’一九A(：f^f(’f；AAA一3’．可扩增⋯257bll的I)N^"段2热F{功l】(=f{『『麓体系墁臣盥祭：通JI1r；f物千¨重1{厦城件系总体均5()I．：r1i⋯×缓f】液{M’)51，I【】tJ．nm[／I堪J¨-jI物lLl晰)辛午lI，2．5lU．t111'I／I-lNTI、4l，hKaRl热动{硝l51]／~1)0．25l，板I，N^5I．尤陌舣蒸水Il5()1『互也条件：94i撷变r4nlhl：94：变30，5()：j丝火linin，71：I砸fI】l『_⋯，J35个衙爿：72{髓．延fitI7rllill3．增产物揄技历艟临控：取5la,I增产物做琼{】；彳精凝胶电泳．：凝胶战像系统下察J191~相每次砒骑均没一刘照flIr{：对蹦结果扛1{缝1q4I——n【)『；f_I性2I例ll～3)，经I{检测．ili仃15份性．51"圳为n念殊蔺⋯份．Bllttl霉3份、新隐球2份(罔4)传统培养泼fD-71iJrJI9例，其一fr白念球菌1o份、州Illl霉2份、新1瞰球2份、他菌株5份(包括j匕滑念球菌!份．热I念球2份、克柔念球菌l扮1一、lI{0统l~+b"4-养珐的比较埘J}】-jl物PCR检洲川21⋯性，榆率为35啦．：而传统的培养珐⋯搭定⋯I9株川-．俭率为3I．7％r，经统计处娜．ISmif~l,h法榆⋯率差异尤统汁：意义f表I)一、临睐标本巾行种敛病陌的分布：m液标本巾共榆⋯6林陌．均’工J念珠离桶．巾4份为念珠茼．"外!份分圳为热带i念球菌千『l光杆念球筒：存5IS]-喃脊液书i1i自3IS"。Pl-．·fi新生隐球菌2株．11念球J辅1株：痰液手¨之管,rblsf~灌洗液if符圳检⋯I徘I2株蜩『111霉一、畸“禾标水的掩!llf／7~讨论狂6()份l瞄床标水．真通J14引物I{榆删rl1】。椿部蒲感染的常桃牦时K，敏感r{图i-止I：J1J将ii刊¨杯巾的删一芹llT扩增。l5260hpfi训i1441．I—I2进圳勺lIll201M)DN^錾州物．澉21【【【5．被[rit1I，fill液I4．1ilt瀚1H，If0_淑I9．髓22．2．秆4．f2(IIip2641III图2I岢通r¨jll蜘l．J{州一舒l翻车0髓i鲭整扦1增{260t,ll均llfH胜1～10l亘‘，驯【¨_21H】0I^h、磐柳．心横．渡：，壤3，山液s．Jl[【瀚27．毒i，蔓L骨池泳先赦I。符剐．池海洗2il图3豇174．¨一I枷l-《_I{刈舟临韧、聩m站1fl：Tlj。增。l1260h1f】1I¨片段，l～12J苎廿J1II2flO1)Il～^h排壑删l枷．职液5．蠼2．渣诎47王t管怖泡灌讹蔽1．直t骨．似≠毛泄．盘’L舒帅},9c液，^皂管池沈7．0求1．悃啦4．}耐图4I。I孟球隋摩球~cI1：t7,1啦。R‘』秆临％,+xf+7~il!iJPi+叮计圳‘增257IllI35I,iIai520I,I。女小∞段．j～12道廿州：l}llO0tlI)NA怀譬J!『i斗却．祧2m5IftlI8．救2帅忤澉乏’苻泡灌洗蚀I(蒋池胜祧6．笠气箭种泡灌洗础7．惰水1．脚水4；川埘。维普资讯http://www.cqvip.com肤科杂志2006年8月第39卷第8期ChinJDermatol，A差，往往会错过最佳的治疗时机，且深部真菌感染有较高的死亡率。侵袭性曲霉病和念珠菌血症患者的血培养『21，]以及肺曲霉病患者的支气管肺泡灌洗液培养『4_的阳性率均较低。1990年代以来，PCR技术已开始用于真菌的检测研究，因其良好的特异性和敏感性，被认为是检测真菌的最佳方法之一，并且得到飞速发展。本试验采用先前建立的真菌通用引物PCR和三重PCR方法，对收集到的60份临床标本(包括血液、脑脊液、尿液、痰液、支气管肺泡灌洗液和胸水等)进行检测，并与传统培养法比较。结果显示，通用引物PCR检测阳性21例，阳性率为35％，传统培养法检测阳性19例，阳性率为31．7％，培养阳性的19例，通用引物PCR方法检测也阳性；培养阴性中的2例，单重PCR方法检测阳性；而其余培养阴性的39例，单重PCR方法检测也是阴性。可见传统培养法与PCR方法检测结果基本一致，而PCR方法似乎比传统培养法更敏感一些。但由于三重PCR只能检测白念珠菌、烟曲霉和新生隐球菌3种致病真菌，因此只鉴定出2O例阳性标本中的15例。通常，常规培养耗时长，鉴定酵母菌最快需要3d．丝状真菌则要2～4周以上，而本试验从DNA提取到通用引物PCR和三重PCR结束，在一个工作日内即可完成，加之该通用引物可扩增大多数常见深部致病真菌[．可见真菌通用引物PCR为临床上及时诊断深部真菌感染提供了可能。由于深部真菌感染的标本多为无菌体液(如血液、脑脊液、胸水、肺泡灌洗液、尿液等)，这样也大大减少了由于污染菌而导致假阳性的可能。本试验提供的DNA提取方法、单重和三重PCR方法简便，稳定性好，敏感性和特异性均较理想，适合临床实验室常规使用。但该三重PCR方法只能检测出白念珠菌、新生隐球菌和烟曲霉这三种常见致病真菌，对一些对氟康唑和两性霉素B耐药的真菌如克柔念珠菌、热带念珠菌、季也蒙念珠菌及尖端赛多孢等还不能做出快速诊断，而后者对指导临床用药很有意义，若要对非常见真菌做出菌种鉴定，尚需作进一步验证(如全真菌基因芯片扫描)。由于PCR技术检测真菌只能判断标本中是否有真菌存在，不能确定是致病真菌，还是条件致病真菌(污染菌)或有无致病性(是活菌还是死菌)，也不能判断是否为耐药菌株，因此既不能作为判定疗效的指标，也不能完全替代传统培养法。本实验收集的临床标本未遇到混合感染的情况，但有报道[]发生深部真菌混合感染的比例大约为3．3％，若出现非白念珠菌、新生隐球菌或烟曲霉混合感染，三重PCR就不能作出或全部作出正确诊断，只能通过真菌培养或者全真菌基因芯片扫描才能解决。深部真菌感染的诊断比较复杂．由于宿主多为免疫受损个体，一些以往被认为是污染菌的真菌也可发生机会感染．而每种诊断方法都有发生污染的可能，故可疑深部真菌感染的送检标本最好同时作真菌培养和PCR检测，若两者结果一致，可明确诊断；若不一致则要综合分析，必要时重复取材检测，因为PCR过程可以出现假阳性和假阴性，在DNA提取和真菌培养过程中都可引起假阳性，尤其是像曲霉属、青霉属、毛霉属等可释放大量气生孢子在空气中的真菌，联合应用真菌镜检、培养和PCR方法可提高诊断的准确性_7-lo-。到目前为止，PCR的最大优势在于真菌培养阴性时对临床标本进行菌种种属的判定，而对致病真菌鉴定至种是选择最有效抗真菌药物的重要依据_11]。参考文献lSandhuGS'K1ineBCStockmanLetaLMolecularprobesfordiag．nosisoffungalinfections．JClinMicrobiol，l995．33：29l3．29l9．2WaldA，LeisenringW，vanBurikJA，eta1．EpidemiologyofAs·pergillusinfectionsinalargecohortofpatientsundergoingbonemarrowtransplantation．JInfectDis。l997．175：l459．1466．3111alerM．PastakiaB．ShawkerTH，eta1．Hepaticcandidiasisincancerpatients：theevolvingpictureofthesyndrome．AnnIntemMed．1988．108：88．1OO．4KahnFW．JonesJM．EnglandDM．Theroleofbronchoalveolarlavageinthediagnosisofinvasivepulmonaryaspergillosis．AmJClinPathol。l986，86：5l8．523．5刘军，刘维达．聚合酶链反应检测深部致病真菌的实验研究．中华皮肤科杂志，2005，38：503．505．6NguyenMH，PeacockJEJr。MorrisAJ，eta1．111echangIngfaceofcandidemia：emergenceofnon．CandidaMbicansspeciesandanti．fungalresistance．AmJMed．1996．1OO：6l7．623．7Lass—FlorlC，GunsiliusE，GastlG，eta1．Diagnosinginvasiveas·pergillosisduringantifungaltherapybyPCRanalysisofbloodsamples．JClinMicrobio1．2004，42：4154-4l57．8YamakamiY，HashimotoA．YamagataE，eta1．EvaluationofPCRfordetectionofDNAspecificforAspergillusspeciesInseraofpatients、vithvariousformsofpulmonaryaspergillosis．JClinMi—crobiol，l998。36：36l9．3623．9SkladnyH，BuchheidtD，BaustC，eta1．SpecificdetectionofAs．pergillusspeciesinbloodandbronchoalveolarlavagesamplesofimmunocompromisedpatientsbytwo．stepPCR．JClinMicrobio1．1999．37：3865．3871．1OBuchheidtD，BaustC．SkladnyH。eta1．ClinicalevaluationofapolymerasechainreactionassaytodetectAspergillusspeciesinbronchoalveolarlavagesamplesofneutropenicpatients．BrJHaematol，2002，ll6：803．8l1．1lRuhnkeM．BohmeA，BuchheidtD，eta1．Diagnosisofinvasivefungalinfectionsinhematologyandoncology--guidelinesoftheInfectiousDiseasesWorkingParty(AGIHO)oftheGerlnanSo．cietyofHematologyandOncology(DGH0)．AnnHematol，2003．82：Sl4l-S148．(收稿日期：2005．12．05)维普资讯http://www.cqvip.com