腺苷发酵液中有机酸的代谢规律

腺苷发酵液中有机酸的代谢规律 腺苷发酵液中有机酸的代谢规律 Vo1.30No.2 200404223 研究简报 幸_辛_幸_辛_辛峰峰; 文章编号:1006—3080(2004)02—0223—04 腺苷发酵液中有机酸的代谢规律 王恒伟,陈长华,付水林,李友元 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237) 摘要:选取了优化过程中典型的3种含有不同碳源的培养基配方(其中配方A中含有100g/L 葡萄糖,配方B中含100g/L蔗糖,配方C中含100g/L蔗糖和10g/L谷氨酸),进行摇瓶发酵生 产腺苷(AR),以测定发酵液的生化参数.通过研究发酵液中的有机酸与腺苷的积累在时序性上的 代谢规律,在此基础上提出了通过增强TCA循环为手段以提高目的产物产量的观点,即TCA强 化论假说. 关键词:腺苷发酵;有机酸;TCA循环;TCA强化论 中图分类号:Q935.31文献标识码:A TheMetabolicCharacteristicsoftheOrganicAcids DuringAdenosineFermentation WANGHeng—wei,CHENChang—hua,FUShui—lin,LIYou—yuan (StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineeringECUST,Shanghai200237,China) Abstract:Adenosinewasproducedindividuallybyfermentationinthreedifferentmediasco ntaining 100g/Lglucose(mediumA),100g/Lsucrose(mediumB),100g/Lsucroseand10g/Lglutami cacid (mediumC).Thetime—ordermetabolicrelationsoftheaccumulationoforganicacidsandadenosinein shakeflaskcultureswerestudiedandthehypothesisofintensificationofTCAcyclefortheenh ancementof productionwassuggested. Keywords:adenosinefermentation;organicacids;TCAcycle;enhancementtheory 从上世纪60年代末至80年代初,国外相继开 展了细菌体内核苷酸的生物合成途径和调节机理研 究【】qJ,而后又开展了该合成途径的操纵子基因的 克隆和全序列测定_4j,推动了核苷类发酵法的生产 和研究.腺苷(AR)是一种多用途的原料药,目前国 内生产主要用酶法:即以酵母RNA为原料,经氢氧 基金项目:上海市重点学科建设项目资助 E—mail:cch0911@citiz.net 收稿日期:2003—04一O1 硕士生,研究方向为发酵过程优化与 作者简介:王恒伟(1975一).男, 代谢调控 化镧或小肠粘膜酶(含磷酸二酯酶和磷酸酯酶)水解 后以柱层析分离而得,成本较高,而有关发酵法生产 腺苷及其代谢研究报道较少.本文采用枯草杆菌进 行摇瓶发酵生产腺苷,通过研究发酵液中有机酸与 腺苷的积累在时序性上的代谢规律,探索腺苷积累 的某些机理,并在此基础上提出TCA强化论假说. 1材料与方法 1.1菌种和培养基 产腺苷的枯草芽孢杆菌102(Bacillussubtilis 224华东理工大学第3O卷 102)由华东理工大学生物工程学院袁勤生教授惠 赠,经本课题组诱变筛选得到稳定的枯草芽孢杆菌 102(Xan—GR—AGSG)菌株.斜面培养基:酵母浸 出粉,蛋白胨,葡萄糖,NaC1,琼脂等.种子培养基: 酵母浸出粉,蛋白胨,玉米浆,葡萄糖等.发酵培养 基:酵母浸出粉,玉米浆,KHPO等.发酵培养基A 中含100g/L葡萄糖,B中含100g/L蔗糖,C中含 100g/L蔗糖和10g/L谷氨酸.消毒前pH为7.2. 1.2仪器和试剂 比色测定用UNICOWFZUV一2000紫外可 见分光光度计;有机酸,谷氨酸与核苷类物质分析用 WatersHPLC高效液相系统,数据处理器为Breeze DataProcessor,色谱柱为AgilentZORBAXSB—Aq (5m,4.6mm×150mm),流动相一0.001 H3PO4(pH2.05),流速为0.6mL/min,柱温35.C, 检测波长210nm.所有试剂为分析纯或色谱纯. 1.3培养方法 摇瓶种子培养时,从32.C培养36h后的饱满 斜面上挑取菌落接种于50mL种子培养基中,250 r/min,32.C培养16h.500mL摇瓶发酵,装量为25 mL,接种量为0.8mL,250r/min,34.C培养96h. 1.4分析方法 菌浓测定:取发酵液500g离心5rain以去除 发酵液中的固体物,取上层浑浊液稀释适当浓度后 于660nm测定其OD值.pH测定时用精密pH试 纸.葡萄糖浓度采用葡萄糖试剂盒测定(上海生物制 品研究所卫生部临床诊断试剂实验中心生产).蔗糖 测定时先将蔗糖于37.C,2mol/LHC1中水解30 rain后,测其总葡萄糖浓度,减去水解前葡萄糖浓度 后等摩尔转换成蔗糖的浓度.铵离子浓度测定时采 用尿素氮试剂盒(Berthelot法).乙酸,丙酮酸,柠檬 酸,a一酮戊二酸,谷氨酸与AR含量分析用高效液相 系统. 2实验结果与讨论 2.1底物消耗,菌体生长(OD),pH变化与AR 生成的时序相关性 底物消耗,菌体生长(OD.),pH变化与AR生 成的时序相关性如图1所示.由图1(a)可见葡萄糖 从12h至60h的消耗呈线性下降,消耗速率约为 0.56g/(L?h),60h后糖耗减慢.这可能是此时 pH值过低(<pH6.0)所致.在图1(b)中,蔗糖在 36h内几乎完全被水解,而葡萄糖则由6.0g/L上 升至46.5g/L,此后以约0.17g(L?h)的速率被缓 慢利用,至72h,pH5.7时停止.在图1(c)中,蔗糖 的水解情况同图1(b)中的相似,而葡萄糖在36h后 以约0.39g/(L?h)的速率被利用,到84h,pH5.7 时消耗停止,谷氨酸在24h之前的消耗速率约为 0.76mmol/(L?h),在24,60h消耗速率增加,平 均约为1.81mmol/(L?h),60h后发酵液中的浓 度就降低到5.1mmol/L以下,其消耗逐渐停止. AR在3种培养基中开始大量积累均在第24h,与 菌体开始进入生长静止期同步,这可能与菌体旺盛 的生长消耗了合成AR所需的大量能量和前体有 关;而AR积累减缓的时刻则不同:在培养基A中 是第36h,在培养基B中是第48h,在培养基C中 是第72h.AR积累减缓的时刻与pH值降到6.3的 时刻是同步的,这种现象的出现很可能与pH值过 低有关.保持pH值高于6.3很可能是AR积累的 必要条件.对比3种培养基的配方可以看出,高浓度 的葡萄糖导致发酵液的pH降低,而谷氨酸的消耗 40 2O 00 8O 60 40 20 岛 t/h 图1培养基A,B和c中底物消耗,菌体生长(OD.),pH 变化与AR生成的时序相关性 Fig.1Time—orderrelationsbetweensubstrateconsump— tion,growth(OD66o),pHandARproductionin mediumA,BandC. ?--Glucoce;~--Sucrose;A--Glutamicacid;?一66o;o—pHf ×一AR .了Os)/..nl ?加?舳?柏加 o990O 呈 一)9_110U重一翟售量 一.,ml 第2期王恒伟等:腺苷发酵液中有机酸的代谢规律225 使得培养基C的发酵液在72h之前的pH保持在 较高水平.谷氨酸降解产物为a一酮戊二酸和NH, 前者是TCA循环的中间物.由此推测AR积累的 原因可能为:发酵液pH大于6.3时,糖酵解和 TCA循环保持活性,菌体生长缓慢,从而使其产生 的能量和中间体可以较多地应用到AR的合成中. 因此测定了发酵液中几处有代性的有机酸的含 量,以期对以上的推测进一步确证. 2.2丙酮酸,柠檬酸,c|-酮戊二酸积累与AR生成 的时序相关性 图2为丙酮酸,柠檬酸,a一酮戊二酸积累与AR 生成的时序相关性.由图可见,在培养基A(图2 (a)),B(图2(b))和C(图2(C))中丙酮酸均在24h 时开始积累,而此后的变化情形则不同:在培养基 A,B中分别在第48h和第60h时开始下降,在培 养基C中则呈不断上升的趋势.丙酮酸在发酵液中 的积累停滞可能与pH的过低有关:在培养基A中 发酵至第48h,B中第60h与C中第84h时,pH 值均降至5.7,6.0.丙酮酸为糖酵解的最终产物, 过低的pH可能影响糖酵解的顺利进行,从而导致 丙酮酸在发酵液中的积累停滞.柠檬酸在3种培养 基中的变化总体趋势均是缓慢上升的,但在第12, 60h内发酵液中其平均积累速率不同:在培养基B 中为0.50mmol/(L?h),C中为0.27mmol/(L? h),A中最低,为0.19mmol/(L?h).实验发现,培 养基A,B和C中a一酮戊二酸的积累均有两个较为 突出的峰:其中第一个峰出现在第12h,a一酮戊二酸 的积累浓度较低;而第二个峰的出现时刻和a一酮戊 二酸的积累最高浓度则各不相同:培养基A中是在 第48h为5.0mmol/L,B中是在第60h为4.9 mmol/L,C中是在第60h为14.2mmol/L,分别是 A,B中的2.8和2.9倍.第24h后a一酮戊二酸在发 酵液中的积累停滞时期与pH值降低至pH6.0, 6.2是同步的. 综上所述,培养基A中无论是作为糖酵解终产 物的丙酮酸,还是TCA循环的中间体柠檬酸和a一 酮戊二酸,都是最低的,这可能与发酵液过早地变酸 有关.在pH>6.3的情况下,AR的积累趋势同这3 种物质的积累趋势均是相同的.结合底物消耗,菌体 生长(ODss.)与AR生成的时序相关性,进一步确证 了我们的推测,即AR积累的本质原因可能为:在高 于pH6.3的情况,糖酵解和TCA循环保持活性,菌 体生长缓慢,从而使产生的能量和中间体可以较多 地应用到AR的合成中.为了进一步明确谷氨酸的 降解情况,对比了其降解产物在3种培养基中的变 化. 6O 0 耋40 自 2O 量星 -=-, E 曼 自 鲁 蓦 60 40 20 舌 h 图2培养基A,B和C中丙酮酸,柠檬酸,口_酮戊二酸积累 与AR生成的时序相关性 Fig.2Time—orderrelationsbetweentheacculmulationof pyruvate.citrate.口一ketoglutarteandARinmedi— umA,BandC. ?Pyruvate;?--Citrate;?口一Ketoglutarate;×AR 2.3谷氨酸消耗,c|-酮戊二酸和铵离子的变化时序 性 如图3示,对比3种培养基的发酵液发现,培养 基C中的铵离子在第36,72h的浓度水平是配方 A和B中的2,4倍,a一酮戊二酸最高浓度为配方A 和B中的3倍.谷氨酸的代谢去向有两种可能,一 方面可以作为合成其他氨基酸等物质的前体,如在 谷氨酰胺合成酶的作用下加氨基形成谷氨酰胺,另 一 方面还可以在谷氨酸脱氢酶的作用下形成a一酮 戊二酸,从而"回流"到TCA循环中被氧化分解. 因此推测本实验中有一部分谷氨酸很可能被当做能 源物质利用了.虽然在应用HPLC检测发酵液中的 谷氨酰胺时,在其保留时间附近并没有发现可见的 峰形,也不能排除在菌体内有部分谷氨酸形成了谷 氨酰胺的可能性. I伽目墨基善 一_二.uIuI)/尝量u,等} _1.l且墨基善 226华东理工大学第3O卷 t/h 图3培养基C中谷氨酸消耗,a一酮戊二酸和铵离子积累的 变化时序性 Fig.3Time—orderrelationsbetweenglutamicacidcon— sumptionandaccumulationof口一ketoglutarateand ammoniumioninmediumC. 一--GlutamicacidinmediumC;?一口一KetoglutarateinmediumC; ?一AmmoniumioninmediumC;C)--Ammoniumioninmedium A;?一AmmoniUmioninmediUmB 3结论 本实验应用枯草芽孢杆菌102进行摇瓶发酵生 产AR,着重研究了发酵液中部分有代表性的有机 酸和AR积累的时序性规律,发现保持pH值高于 6.3很可能是AR积累的必要条件.结合底物消耗, 菌体生长(OD.),发酵液中丙酮酸,柠檬酸和a一酮 戊二酸的变化与AR生成的时序相关性,由此推测 AR积累的本质原因可能为:在pH>6.3时,糖酵解 和TCA循环保持较高活性,菌体生长进入静止期, 从而使产生的能量和中间体可以较多地应用到AR 的合成中.AR从头合成的各个途径见文献[1,6], 由核糖一5一磷酸合成AR的总方程为: R5P+2GIn+Gly-4-2Asp-4-5ATP-4-GTP— AR+2Glu-4-Fumarate-4-AMP-4-4ADP-4-GDP-4- PPi-4-Pi 由此可知,产物AR的合成是前体和能量生成 的多途径共同协调的结果.提高AR的产量不但要 使各个前体供应途径(HMP途径,TCA循环和相关 氨基酸的合成途径)顺利进行,还应注意适当提高能 量的供应.在类似AR等物质的合成过程中,能量和 中间体的持续供应和相互协调尤为重要,TCA循环 在绝大多数微生物体内是大部分能量和中间代谢物 产生的"枢纽",保持TCA循环的顺利进行和适当 强化,为终产物合成提供了充足的"后勤保障",从而 有可能提高产量,这就是TCA强化论假说.应当指 出的是,本文监测的只是发酵液中的一些生化参数, 只是在一定程度近似反应了菌体的生理状况,有关 TCA循环强化论的更多实验证据和支持以及TCA 循环强化后对产物合成相关的代谢途径有怎样的影 响等问题有待进一步研究. 参考文献: 百澉春生.IJ-/,2-才手F合成胡饰援樽EJ3.蛋白重 核酸酵素,1968,13(9):781—797. 木下祝郎.7/酸?核酸骚酵【=挡c寸弓代澍制御EJ3.工案 化翠蘼志,1969,72(2):415-419. 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