儿童EB病毒感染相关IM和HLH的临床分析和病毒感染特征.pdf.doc

儿童EB病毒感染相关IM和HLH的临床分析和病毒感染特征.pdf.doc 广州医学院 硕士学位论文 儿童 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床分析和 病毒感染特征 Clinical research and Virological Features of Epstein-Barr Virus Associated Infectious Mononucleosis and Hemophagocytic Lymphohistiocytosis 专业名称:儿科学 硕士研究生:陶佳 导 师:赖永洪教授 陈福雄教授 广州医学院?广州 2012年5月 目录 主要英文缩略词表„„„„„„„„„„„„„„„„„ 1 „„ 中文摘要„„„„„„„„„„„„„„ „„„„„„„„ „ 2 英文摘要„„„„„„„„„ „„„„„„„„„„„„„8 „ 前言„„„„ „„„„„„„„„„„„ „„„„„„„„ 14 第一部分 EBV感染患儿临床及实验室检查特点分析„„„„18 1.研究对象和方法„18 „„„„„„„„„„„„„„„„ „20 2.结果 „21 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 25 „ 第二部分 EBV感染患儿血清学抗体检测与临床关系分析„„ 3.讨论26 1.材料和方法„„„27 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 2.结果„„„„„„„„„„„„„„„„ 29 „ „„„„„„ 3.讨论31 4.结论„„„„„„„„„„ „„„„„„ 32 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 4.结论第三部分EBV感染患儿血清EBV-DNA负载量检测分析„„„„ „„ „„„„„„„„„„33 „„„„„„ 1.材料与方法33 „„„„„„ „„„„„„„„„„„„„„„„„„ „„36 „ 2.结果„„„„„„„„„ „„„„„„„„„„„ 39 3.讨论„„„„„„„ „„„„„„„„„„„„„„ „ 4.结论„„„„„„ „„„„„„„„„„„„„„„„ 41 42 全文结论 „„„„„„„„„„„„„„„„„„ „„„„ 附表附图43 „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ „„ 46 参考文献综 述51 „„„„„„„„„„„„„„„„ „„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„„ 攻读学位期间公开发表的论文64 „„„„„„„„„„„„„ „„ 致 谢„„„„„„„„65 „„„„„„„„„„ „„„„ 学位论文原创性声明66 „„„„„„„„„„„„„„„ 66 学文论文知识产权权属声明 „„ „„„„„„ 关于学位论文使用授权的说明„„„„„„„ „„„„„„„„„„„„ 66 „„ EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 主要英文缩略词表 Abbreviation 缩略词英文全称 中文 ALT Alanine aminotransferase 丙氨酸氨基转移酶 Aspartate aminotransferase AST 天门冬氨酸氨基转移酶 早期抗原 Early antigen EA EBV Epstein-Barr Virus EB病毒 EBV-AHS Epstein-Barr virus-associated Hemophagocytic EB病毒相关性噬血淋 lymphohistiocytosis 巴组织细胞增生症 EBNA EBV核抗原 Epstein barr virus nuclear antigen FQ-PCR Fluorescence quantitative polumerase chain reaction 荧光定量聚合酶链反应 FHLH Familial hemophagocytic lymphohistiocytosis 家族性噬血淋巴组织细 胞增生症 HLH Hemophagocytic lymphohistiocytosis 噬血性淋巴组织细胞增 生症 Virus-associated hemophagocytic syndrome IAHS 病毒相关性噬血细胞综 合征 IM Infectious mononuucleosis 传染性单核细胞增多症 MA Membrane antigen 膜抗原 PCR Polumerase chain reaction 聚合酶链反应 PTLD Posttransplant lymphoproliferative disords 移植后淋巴细胞增殖性 疾病 SLAM Signal lymphocyte activation molecule 信号淋巴细胞活化分子 SAP Signal lymphocyte activation molecule(SLAM)- 信号淋巴细胞活化分子 相关蛋白 -associated protein VCA Viral capsid antige 病毒衣壳抗原 1 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 儿童 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病毒感染特征 硕士研究生:陶佳 导 师:赖永洪教授 陈福雄教授 广州医学院第一附属医院儿科 中文摘要 研究背景: EB病毒(Epstein-Barr，EBV)为双链 DNA病毒，是一种嗜人 B淋 巴细胞 病毒，属于疱疹病毒γ亚科家族中的一员。该病毒在人群中普遍易感，国外报道， 成人血清 EBV抗体阳性率达 95%以上[1]，我国 3~5岁儿童 EBV抗体阳性率达 80.7~100%，10岁时 100%的儿童血清 EBV抗体阳性转化[2]。EBV是儿童感染性 疾病常见的病原体，感染时症状轻重不一，部分仅表现无症状的血清学转换，其 中 50%发展为传染性单核细胞增多症(Infection mononucleosis，IM)[2]。IM被 认为是一种免疫病理性疾病(Immunopathological disease)[13]，EBV原发感染后 引起大量 CD8+T淋巴细胞增殖，一方面杀伤 EBV感染的 B细胞，一为轻症或不典型病变。IM是自限性疾病，一般预后良好，病死率仅为 1,2%[14] 。 方面侵犯淋 在少数患儿可发生多个系统并发症，发展为重症 IM。在极少数个体可发生 EBV 巴组织器官、释放炎症因子，主要是 Th1型细胞因子，引起一系列的临床症状。 相关性噬血细胞淋巴组织细胞增生症 婴幼儿免疫发育尚不成熟，因此大部分感染 EBV后表现为血清学转化或仅表现 ( 及时诊断和治疗，患者迅速死亡，病死率可达 Epstein-Barr virus-asso ciated30, 40%[15] 。 hemophagocytic lymphphistiocytosis，EBV-AHS)本病在临床上呈暴发性，如不 2 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 噬血细胞性淋巴组织细胞增生症( Hemophagocytic lymphohistiocytosis， HLH)是多种原因造成自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和 T细胞功能缺 陷，引起大量炎症细胞因子释放，造成机体巨噬细胞活化，机体脏器、组织损伤 的一组临床综合征。其临床表现具有特征性但缺乏特异性。主要临床表现为持续 发热，肝、脾大，全血细胞减少，骨髓、淋巴结等组织可见吞噬血细胞现象。多 种原因可引起 HLH:遗传因素、感染、肿瘤、自身免疫系统疾病。EBV-AHS是 感染所致 HLH中的常见类型。无论是先天性还是后天性 HLH，EBV都是最常 随原发病的治愈而缓解，而未经治疗的 EBV-AHS常，特别是 常是见的触发因素。不同病因所致致命的 HLH[46]预后不同，非 EBV感染所致 EBV-DNA定量分析持续增高者。目前对于极少数 EBV感染后发展为 HLH，60-70% EBV-AHS 的患儿特别是无明确基因缺陷者，其体内病毒与机体免疫力相互作用的研究尚不 十分清楚。 EBV原发感染后产生病毒特异的体液免疫反应和细胞免疫反应，通过检测 血清中 EBV特异性抗体滴度可以反映病毒感染后机体的体液免疫反应情况。间 接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence assay，IFA)是检测 EBV特异性抗 体的经典方法，但该方法耗时耗力且敏感性低于酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，ELISA具有高效、快速、敏感 性高等特点，现已广泛用于 EBV感染血清学检查。实时荧光定量 PCR技术 (Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction，Real-time PCR)是在定性 PCR 技术基础上发展起来的核酸定量检测技术，是目前确定样本中 DNA拷贝数最敏 感、最准确的方法，现已替代了其它定量 PCR的方法广泛用于测定 EBV负载量。 通过 FQ-PCR检测患者外周血中 EBV-DNA拷贝数，能够很好的反映体内病毒的 负荷量。因此我们采用 ELISA和 FQ-PCR的方法检测 EBV感染患儿外周血抗体 3 谱表现和 EBV-DNA负载量，分析普通 EBV感染和 EBV-AHS患儿机体免疫反 应和机体内病毒活动的特点。 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 目的: 了解 EB病毒感染所致 IM和 EBV-AHS的临床特点以及血清 学 EBV抗体谱 和外周血病毒负载量的特点。 方法: 1 EBV感染患儿临床特点和实验室检查分析 将 EBV感染患儿分为 IM组和 EBV-AHS组，分析两组病例的 临床特点和实 验室检查特点。 2 EBV特异性抗体检测 2.1标本收集:所有患儿标本在入院时采集，用促凝管收集外周静脉血 2ml。 2.2分离血清:收集的血标本离心，2500rpm/min×15min，吸取上层血清，将血 清等分装于 ep管中，放于-80?冰箱保存。 2.3检测血清中 EBV抗体:待收集一定数量标本后用 ELISA法检测患儿血清中 EBV四项抗体，包括:抗 EBV衣壳抗原(capsid antigen，CA)IgM(EBV-CA-IgM) /IgG(EBV-CA-IgG)抗体、抗 EBV早期抗原(early antigen，EA)IgG(EBV-EA-IgG) 抗体、抗 EBV核抗原(nucler antigen，NA)IgG(EBV-NA-IgG)抗体。 2.4根据抗体检测结果将 EBV感染分为原发感染组和亚急性感染组，比3 EBV-DNA拷贝数检测 较两组 3.1标本收集:所有患儿标本在入院时采集，用促凝管收集外周静脉血 2ml。 的临床特点和实验室检查。 3.2分离血清:收集的血标本离心，2500rpm/min×15min，吸取上层血清，将血 清等分装于 ep管中，储存于-80?冰箱。 3.3提取 DNA:使用 QIAampDNA Mini kit(QIAGEN)提取血清中 DNA，将提 取的 DNA等分储存于-80?冰箱。 3.4检测 EBV-DNA负载量:待收集一定数量标本后用 FQ-PCR检测血清中 EBV-DNA负载量。 4 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 4统计学方法 采用 SPSS17.0统计软件进行数据分析。计量资料用 Kolmogorov- Smirnov正 — 态性检验，正态分布资料用均数?标准差( x?s)表示，采用两独立样本的 t 检验(Independent-samples T text);偏态分布资料用中位数(范围)表示，采用 Mann-Whitney秩和检验。计数资料以构成比(%)表示，采用两独立样本率的 卡方检验;两变量间的相关分析用 Peason相关分析，当 P,0.05时，认为有统 计学意义。 结果: 1.本研究中 IM组患儿男女比例 1.8:1;发病年龄 13个月,13岁，平均 4.6岁; 其中以学龄前儿童多见(60.5%)。 2.本研究 IM发热、咽峡炎发生率(97.7%)，颈部淋巴结肿大(95.3%)，眼睑 浮肿(48.8%)，肝肿大(65.1%)，脾肿大(46.5%)，皮疹(20.9%)，热程 中位数为 5d，热峰 39.2?，眼睑浮肿发生率高于脾肿大和皮疹。EBV-HLH热程 中位数为 27d，热峰 40.4?，EBV-AHS热程显著长于 IM组(P=0.002)，热峰 显著高于 IM组(P=0.001)。 3.EBV-AHS临床特点为持续高热、肝脾肿大，实验室检查主要特点:白细胞计 数、中性粒细胞计数、血红蛋白、血小板计数减低，肝功能异常，以酶学改变为 主，尤以 LDH升高明显(1690?759U/L)，甘油三脂(TG)升高、血清铁蛋白 (SF)明显升高(均,2000ug/L)，纤维蛋白原(Fb)均降低。 4.原发感染(抗 VCA-IgM阳性，抗 EBNA-IgG阴性，抗 VCA-IgG、EA-IgG 阳性或阴性)是 IM抗体谱的主要类型(65.1%)，入院时抗 EBV-CA-IgM阳性 率(97.6%)，其中 1例患儿入院时抗 EBV-CA-IgM阴性 1周5.比较 EBV原发感染和亚急性感染临床表现和主要实验室数据显示，EBV原发 后复查转阳性。感染眼睑浮肿率(5 P=0.033)和肝脏肿大率(P=0.011)显著高于 EBV亚急性感染组; 例 EBV-AHS患儿抗体谱均表现为既往感染。5 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 LDH前者较后者明显升高(P=0.005)。比较两组合并肝功能损害发生率显示: EBV原发感染显著高于亚急性感染(P=0.005)。 6.IM组入院时均行血清 EBV-DNA负载量检测，其中阳性者 24例(56%)，均 数为 5.88×104copies/ml，最大值 2.88×105copies/ml，最小值 8.24×103copies/ml。 其中有 10例于住院治疗 7天后复查血清中 EBV-DNA负载量，结果均转阴。5 例 EBV-AHS血清中 EBV-DNA拷贝数均阳性，均数为 7.IM组根据血清 EBV-DNA检测结果分为 EBV-DNA定量阳性组和1.86×108copies/ml，最大 阴性组，比 较入院时主要实验室数据，结果显示值 9.25×108copies/ml，最小值 2.88EBV×-10DNA5copies/ml阳性组肝功明显异常，以酶学改。EBV-AHS组中 EBV-变为主(ALT、AST、LDH)，ALT、LDH较 EBV-DNA阴性组相比明显升高， DNA负 差异有统计学意义(载量显著高于 IMALT:组(PP=0.013=0.001;)。LDH: P=0.003)。EBV-DNA负载量与 AST(r=0.567， P=0.004)、LDH(r=0.885，P=0.004)呈正相关。 结论: 1(本研究中 IM以男性多见，好发于学龄前儿童。发热、咽峡炎、颈部淋巴结 肿大、肝脾肿大是 IM常见临床表现，眼睑浮肿与其它典型临床表现一样对 IM 具有诊断价值。热程、热峰有助于判断 IM是否发生 EBV-AHS。 2(儿童 EBV-AHS血液系统和肝脏损害严重，酶学中以 LDH升高更为显著。血 清铁蛋白、甘油三脂和纤维蛋白原在 EBV-AHS的早期阶段即有改变，一旦临床 上怀疑 EBV-AHS应尽快完善以上检查，便于早期诊断和治疗。 3(本研究中 IM入院诊断时血清抗体谱以原发感染为主(65.1%)，EBV原发感 染较 EBV亚急性感染临床症状更典型，病情更重。临床怀疑 4(血清抗体检测在诊断 EBV-AHS的敏感性不及 FQ-PCR，在诊断 EBV-AHS时 IM入院时抗 血清 EBV抗体阴性是不能除外 EBV感染，需完善外周血 EBV-VCA-IgM阴性患儿应予以复查，可提高阳性率。 DNA荧光定量检 6 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 测以明确。 5(IM血清中 EBV-DNA负载量与临床严重程度呈正相关;检测外周血 EBV-DNA 拷贝数能更好反映体内 EBV的活动情况。EBV-AHS血清中 EBV-DNA负载量显 著高于 IM患儿，对于 EBV感染特别是血清 EBV-DNA呈高拷贝数的患儿，应 关键词:儿童;EB病毒;传染性单核细胞增多症;噬血淋巴组织细胞增生症; 动态观察外周血中 EBV-DNA负载量变化，以了解病情的变化和治疗效果。 荧光定量 PCR;抗体。 7 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 Clinical investigations and Virological Features of Epstein-Barr Virus Associated Infectious Mononucleosis and Hemophagocytic Lymphohistiocytosis M.D.Candidate:Tao Jia Supervisor: Prof.Lai Yong-hong，Prof.Chen Fu-xiong Department of Pediatrics, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College ABSTRACT Background Epstein-Barr virus (EBV) belongs to the genus B Lymphocryptovirus, subfamily Gammaherpesvirinae, family Herpesviridae, EBV virions have a dobule-stranded. Sero-epidmiologic surveys indicate that over 95% of adults worldwide are infected with EBV[1]. Previous investigations revealed that in our countries, 80-100% of children were serpopositive of EBV-specific antibodied by 3 to 5 of age, and the alternate with 100% of seropositive by 10 of age. EBV is one of the most common pathogens of the infectious diseases in childhood, primary EBV infection are often manifested as nonspecific illnesses, about 50% of primary infection may result in IM[2]. IM is believed to be an immunopathological disease, and it is characterized by dramatic antigen-driven clonal expansions of CD8 T lymphocytes in response to primary EBV infection, the activated CD8 T lymphocytes killer EBV infection B cell and infringe upon lymphoid tissue organ , release cytokines that are predominantly of a Th1 type[13]. Because of relative immature of immune system in infants and young 8 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 children, primary EBV infections usually occurs more common in these age groups. IM is usually self-limiting and resolves spontaneously after the emergence of EBV-specific immuno-responses, the mortality rate observed in only 1 to 2% of cases of IM[14]. Severe acute complications may be seen in a few IM cases, fulminant infectious mononucleosis(FIM)may occur. In a limited number of individuals, IM may develop into a lifethreatening disease, EBV-associated hemophagocytic syndrome(EBV-AHS). EBV-AHS is an extremely dangerous state with high mortality, the mortality rate rangs from 30 to 40%[15] . Hemophagocytic lymphohistiocytosis is a rare and often fatal disorder, this life- threatlening condition is a type of immune dysregulation characterized by an impaired or absent function of natural killer(NK)cells and cytotoxic T cells, and the release of proinflammatory cytokines. HLH is a distict clinical entity characterized by a high fever, splenomegaly, pancytopenia, and the pathological finding of hemophagocytosis in bone marrow, lymph nodes and other tissues. HLH has since been associated with a variety of genetic defects, infection, tumor, autoimmune system disease. Although many viruses can trigger HLH, EBV is the most common triggering agent for HLH. For patients with reactive HLH associated with pathogens other than EBV, supportive care and treatment of the underlying infection is associated with recovery in 60-70%. EBV-AHS in most is universally fatal if untreated[46]. Patients with sporadic HLH, however, usually have no gene mutations, the relationship between EBV infection and the function of immune system deserves to be futher investigation in the future. In an effective humoral and celluar response during primary EBV infection, historically, the humoral response to EBV infection was determined by a set of immunofluorescence assays measuring EBV-specific serological antibody titers. Indirect immunofluorescence assay (IFA) is the classical technique, but the enzyme immunoassay technique is often used in routine determination of EBV infection because of its reliability in high-throughput analyses and high sensitivity. Real-time 9 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 quantitative polymerase chain reaction(Real-time PCR) , which is developed from qualitative PCR assays to be the most sensitive and technique for the determination of EBV-DNA. It has replaced the other PCR assays and widely used in EBV detection. Measuring the cell-free EBV-DNA copy number in peripheral blood by real-time PCR may reflect virus activitese. So we examined EBV anyibody and EBV-DNA copy numbers in sera by ELISA and real-time PCR respectively, to explore virological features of Epstein-Barr virus associated infectious mononecleosis and hemophagocytic lymphohistiocytosis in Childhood. Objectives:To observe clinical manifestations and virological features of Epstein-Barr virus associated infectious mononecleosis and hemophagocytic lymphohistiocytosis in Childhood. Methods: 1. Clinical characteristics and laboratory analysis of Epstein-Barr Virus Infection in Childhood Patients with EBV infectious were separated into IM and EBV-AHS， clinical and laboratory characteristics were analysed. 2. EBV antibody tests 2.1 Peripheral blood(2ml)was collected from each subject into an serum tube. 2.2 Blood samples were centrifuged at 2500rpm×15min, and serum was carefully removed from the serum tube and transferred into plain polypropylene tubes. The sample were stored at -80? in aliquots until further processing. 2.3 Four antibodys, incuding EBV-IgM/IgG anti-VCA, EBV-IgG anti-EA, EBV-IgG anti-NA, were detected in sera of all of cases by ELISA with a commercial kit. 2.4 Patients were divided into primary EBV infection group and subacute EBV infection group according to the sero-EBV antibody result, to investigate clinical characteristics and laboratory analysis of two groups. 3. EBV-DNA assays 10 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 3.1 Peripheral blood(2ml)was collected from each subject into an serum tube. 3.2 Blood samples were centrifuged at 2500rpm×15min, and serum was carefully removed from the serum tube and transferred into plain polypropylene tubes. The sample were stored at -80? in aliquots until further processing. 3.3 DNA from serum samples was extracted using a QIAamp DNA Mini kit(QIAGEN Germany) . Serum samples(200ul/column)were used for DNA extraction. DNA extr- action from serum samples were stored at 80? in aliquots until further processing. 3.4 ALL were run in a Bio-Rad IQ5 instrument(Bio-Rad，America). 4. Statistical analysis Date were analysed using the SPSS 17.0 for windows (SPSS Inc. , Chicago IL, USA). The Kolmogorov-Smirnov test was used to verify the normality of distribution of continuous variables. Nomal distribution date are presented as mean(Standard Deviation;SD). Skewness distribution date are presented as median(range).Two independent-samples T text and Mann-Whitney U test was used to test for differences of quantitative variables. Two sample rate compared with a chi-square test. Peason correlation test was used to examine associations between 2 quantitative variables. P vaule less than 0.05 were considered significant. Results: 1.In our investigatious of all IM cases, the ratio of boys versus girls was 1.8:1; the age of onset ranged from 13 months to 13 years , 60.5% of the patients were preschoolers. 2.The main symptoms and signs of the IM included fever(97.7%), tonsillopharyngitis (97.7%), cervical lymphadebopathy(95.3%), eyelid edema(48.8%) , hepatomegaly (65.1%), splenomegaly (46.5%) and rash(20.9%); the percentage of eyelid edema was higher than splenomegaly and rash in IM group. Longer febrille duration (P=0.002)and higher peak temperature(P=0.001)were found in EBV-AHS. 3. EBV-AHS is a distinct clinical entity characterized by persistent high fever, hepat- 11 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 osplenomegaly, significantly reduced WBC, ANC, Hb and PLT, live dysfunction and the increased level of LDH was the most obvious, elevated levels of triglyceride(TG) and serum ferritin(SF), reduced levels of fibrinogen(Fb)could be observed. 4. Primary EBV infection[viral capsid antige immunoglobulin M(IgM)-(+),viral nucle antige IgG-(-), viral capsid antigen IgG and viral early antigen IgG-(+)/(-)]was the most common sero-antibody type in IM(65.1%). At the initial visit , the VCA-IgM positive ELA was seen in 42 of 43 patients with IM (97.6%), and that in 1 case the VCA-IgM turned positive one week later from the first assay. 5 serum samples from EBV-AHS with previously acquired EBV infections. 5. Comparison of clinical manifestation and laboratory findings between primary EBV infection and subacute EBV infection, the percent of eyelid edema and enlaged liver was significantly higher in primary EBV infection than those of subacute EBV infection(P1=0.003; P2=0.011); LDH were higher in primary EBV infection group than in subacute EBV infection, the differences were statistically significant between the two groups(P=0.005). The incidence of liver dysfunction in primary EBV infection was significantly higher than subacute EBV infection group(P=0.005). 6. The serum EBV-DNA level in 24 of 43 patients with IM was in the range of 8.24× 103,2.88×105 copies/ml with a mean value of 5.88×104 copies/ml. Five HLH cases with positive of EBV-DNA loads in sere were diagnosed EBV-AHS, the EBV-DNA loads were in the range of 2.88×105,9.25×108copies/ml with a mean value of 1.86 ×108copies/ml. There were significant differences of EBV-DNA loads in sere of patients betwween IM and EBV-AHS(P=0.001). 7.43 pediatric patients with IM were seperated into EBV-DNA loads positive group and negative group, ALT、LDH were statistically significant higher in EBV-DNA positive group than negative group(PALT=0.013; PLDH=0.003), EBV-DNA loads were significantly correlated with levels of AST and LDH(r=0.567, PAST=0.004; r=0.885, 12 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 P LDH=0.004). Conclusion: 1. In our study EBV-associated IM is more common in preschool male children, the majority of presentations were fever, tonsullopharyngitis, cervical lymphadebopathy、 hepatomegaly and splenpmegaly, enlarged eyelid edema had the same diagnositic value as the other typical manifectious in IM. The total febrile duration and peak temperature may be hepful for the decision of EBV-AHS. 2. Impairments of hemotopoietic system and liver were more serious in EBV-AHS. SF, TG and Fg were noticeable abnormal in EBV-AHS. Therefore, SF、TG and Fg should be examined when a child was suspected a diagnosis of EBV-AHS. 3. In Our study primary EBV infection was the most common type in IM, the clinical manifestations of primary EBV infection were more severe than subacute EBV infection. 4. The test of qEBV was more sensitive than sera EBV antibody, so if EBV sero-antibody assays are negative, EBV infection can not be excluded and qPCR should be perfromed. 5.EBV-DNA load in the serum correlates with diesase severity in IM; quantitative analysis for sero-EBV-DNA may be a useful research tool in EBV infection.There were significant differences of EBV-DNA loads in serum of patients between IM and EBV-AHS, Monitor of EBV-DNA loads in serum maybe useful for determinations of progression, therapeutic response or prognosis of the primary EBV infection and EBV-AHS, and possibly for predicting the progression to EBV-AHS and evaluating the therapeutic response. Key words:child;Epstein-Barr virus;Infection mononucleosis;Hemophagocytic lymphohistiocytosis;FQ-PCR;Antibody. 13 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 前言 EB病毒(Epstein-barr virus，EBV)在人群中普遍易感。国外报道，成人 血清 EBV抗体阳性率达 95%[1]，我国 3~5岁儿童 EBV抗体阳性率达 80.7~100%， 10岁时 100%的儿童血清 EBV抗体阳性转化[2]。原发 EBV感染后大部分仅表现 无症状的血清学转化，其中 50%可发展为传染性单核细胞增多症 (Infectious mononuucleosis，IM)[3]。我国 IM的好发年龄是学龄前儿童，发病高峰年龄是 4-6岁，欧美国家好发年龄是青春期和成人，多见于 10-30岁[4]，我国与西方国 家的这种差异可能与生活习惯、人口密度以及经济卫生条件有关[5]。 EBV原发感染时，唾液中的 EBV在口咽部上皮细胞内发生裂解感染， 上 皮细胞死亡后病毒进入血循环，通过病毒衣壳糖蛋白 gp350/220与 B淋巴细胞表 EBV原发感染后可以产生病毒特异的体液免疫反应和细胞免疫反应，虽能 面受体 CD21结合，感染 B细胞，在 B细胞内建立潜伏感控制感染但不能完全消除病毒。临床上常通过免疫荧光的方法检测血清 EBV抗 染原特异性的抗体滴度反映[6]。B淋巴细胞是 EBV感染后机体的体液免疫反应情况。病毒衣壳抗原 EBV原发感染的靶细胞，也是病毒在体内建立持续感染的终身潜伏产所。潜伏 (viral capsid antigen，VCA)、膜抗原(membrane antigen， MA)和早期抗原 于 B细胞内的 EBV不能进行自我复制，随宿主细胞周期复制而复制，只表达(early antigen， EA)是 EBV裂解感染所表达的抗原，EBV核抗原(epstein barr 与 virus nuclear antigen，EBNA)为潜伏感染所表达抗原。一般来说，抗 EBV-CA-IgM 于原发感染后的潜伏感染有关的免疫原性低的抗原。在某些因素的刺激下，潜伏于 4,7天出现，3,4周达到峰值，之后迅速减少， 12周基本消失，B细胞内的 是新近感染的标志EBV可重新活化，进行裂解复制释放病毒入血，感染新的[8]，然而在少数患者感染 6个月后仍可存在 [9]，并有报道少数B细胞和上皮细胞 [7] (见图 1)。 个体可能不产生[10]。抗 EBV-CA-IgG与 IgM同时出现，达到峰值后缓慢减少， 并持续存在。抗 EBV-NA-IgG在感染后 4,6周出现并持续终生。 14 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 EA抗原分两种成分，其中 EA-D是病毒增殖初期形成的抗原，抗 EA-IgG阳性 提示近期感染，EA-R是感染恢复期抗原，其相应抗体提示处于恢复期。EBV原 发感染后特异性抗体滴度动态变化(见图 2)[11] 。 图1:健康的病毒携带者中EBV感染过程[7]。 检测血清中 EBV抗体仅能反映状况，而非感染病毒本身的反映，因此常通 过荧光定量 PCR(Fluorescence quantitative PCR，FQ-PCR)的方法检测患者体内 EBV-DNA拷贝数，来反映体内病毒的活动情况。临床上用于检测的标本多样， 有血清、血浆、外周血单个核细胞(PBMCs)以及口腔灌洗液等。不同 EBV感 染相关疾病，其生物学特性有所不同。例如:鼻咽癌患者，癌细胞在组织中增生， 几乎很少进入外周循环，因此外周血中大部分 EBV基因组为游离病毒;相反， 在移植后淋巴细胞增殖性疾病(Posttransplant lymphoproliferative disords，PTLD)中， EBV感染的 B细胞可以移行至外周血，因此外周血中 EBV基因组大部分位于细 胞内[6]。因此应根据疾病以及检测的目的选用合适的标本。EBV原发感染时如: IM，外周血中同时存在细胞内 EBV和游离 EBV。在疾病早期，几乎所有患者体 内均可检测到 EBV，当出现 EBV特异性免疫功能时，PBMCs中的 EBV-DNA 15 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 逐渐减少，但血浆/血清中的 EBV-DNA迅速减少，因此血清抗体阳性的健康病 毒携带者的血清或血浆中很难检测出游离 EBV基因组。研究表明[12]，IM患儿血 清中 EBV-DNA负载量与疾病的严重程度相关。因此 IM患儿检测血清/血浆 EBV- DNA负载量对于诊断和了解病情有帮助。 图 2:EBV原发感染后抗体滴度的动态变化过程[11] 。 婴儿期 EBV感染大多呈无症状的血清学转化，但在儿童期和青少年期可表 现为 IM。IM被认为是一种免疫病理性疾病(Immunopathological disease)[13] ， EBV原发感染后引起大量 CD8+T淋巴细胞增殖，一方面杀伤 EBV感染的 B细 胞，一方面侵犯淋巴组织器官、释放炎症因子，主要是 Th1型细胞因子，引起 一系列的临床症状。婴幼儿免疫发育尚不成熟，因此大部分感染 EBV后表现为 血清学转化或仅表现为轻症或不典型。IM是自限性疾病，一般预后良好，病死 率仅为 1,2%[14]。在少数患儿可发生多个系统并发症，发展为重症 IM。在极少 数个体可发生 EBV相关性噬血细胞淋巴组织细胞增生症(Epstein-Barr virus- associated hemophagocytic lymphohistiocytosis, EBV-AHS)，本病在临床上呈暴发 16 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 性，如不及时诊断和治疗，患者迅速死亡，病死率可达 30,40%[15] 。 噬血细胞性淋巴组织细胞增生症( Hemophagocytic lymphohistiocytosis， HLH)是多种原因造成自然杀伤细胞(natutal killer cell，NK)和 T细胞功能缺 陷，引起大量炎症细胞因子释放，造成机体巨噬细胞活化，机体脏器、组织损伤 的一组临床综合征。其临床表现具有特征性但缺乏特异性。主要临床表现为持续 发热，肝、脾大，全血细胞减少，骨髓、淋巴结等组织可见吞噬血细胞现象。多 种原因可引起 HLH:遗传因素、感染、肿瘤、自身免疫系统疾病。EBV-AHS是 感染所致 HLH中的常见类型。无论是先天性还是后天性 HLH，EBV都是最常 随原发病的治愈而缓解，而未经治疗的 EBV-AHS常常是致命的[16] 。早期明确 见的触发因素。不同病因所致 HLH预后不同，非 EBV感染所致 HLH的病因对病人的治疗及评估预后至关重要。而目前对于少数由 IMHLH，60-70% 发展为 EBV-AHS的临床危险因素的研究并不是十分清楚。随着 HLH新诊断标准的出 现以及人们对 EBV-AHS认识水平的提高，EBV-AHS的病例报道呈逐年增加趋 势，EBV-AHS也逐渐成为目前国内外研究的热点。因此本研究通过回顾性研究 分析 43例 IM患儿和 5例 EBV-AHS患儿的临床特点和实验室检查特点，通过酶 联免疫法检测 48例 EBV感染患儿血清 EBV相关抗体了解病毒感染后机体的免 疫反应同时通过荧光定量 PCR检测血清中 EBV-DNA负载量了解病毒感染后的 活动状况及其与病情程度的关系。 17 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 第一部分 EBV感染患儿临床及实验室检查特点分析 EBV感染广泛存在于世界各地，在人群中普遍易感，国外报道，成人血清 EBV抗体阳性率达 95%[1]，我国 3~5岁儿童 EBV抗体阳性率达 80.7~100%，10 岁时 100%的儿童血清 EBV抗体阳性转化[2]。发达国家 EBV原发感染多发生于 10~30岁，发展中国家 EBV感染多发生于 3~6岁之前，发达国家与原发 EBV感染后大部分仅表现无症状的血清学转化，其中 50%可发展为 发展中国家 [3]。婴幼儿免疫发育尚不成熟，因此大部分感染 EBV后仅表现为血清学转化 IM 的这种差异可能与生活习惯、人口密度以及经济卫生条件有关[5]。 或仅表现为轻症或不典型。我国 IM的好发年龄是学龄前儿童，发病高峰年龄是 4-6岁，欧美国家好发年龄是青春期和成人，多见于 10-30岁[4]。IM本质是一种 自限性的淋巴细胞增殖性疾病，一般预后良好，病死率仅为 1,2%[14] 。在少数 患儿可发生多个系统并发症，发展为重症 IM。在极少数个体可发生 EBV-AHS， 本病在临床上呈暴发性，如不及时诊断和治疗，患者迅速死亡，病死率可达 30, 40%[15] 随着 HLH新诊断标准的出现以及人们对 EBV-AHS认识水平的提高， EBV-AHS的病例报道呈逐年增加趋势，EBV-AHS也逐渐成为目前国内外研究 的热点。EBV-AHS的临床特点具有特征性但缺乏特异性，了解 EBV-AHS相关 临床表现和实验室指标变化特点，提高对本病的认识，为早期诊断和治疗提供临 床依据。 1(研究对象和方法 1.1 纳入标准:?年龄 16岁以下;?符合 EBV感染 IM和 HLH的诊断标准 (见参考标准 1.2);?不具有慢性疾病和有免疫缺陷病或正在接受免疫抑 制治疗的患者;?征得患儿家长或监护人同意。 1.2 参考标准 1.2.1 IM[17] : 18 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 ?.临床表现:发热、咽峡炎、淋巴结肿大、皮疹、肝脏肿大(4岁以下:2cm 以上;4岁以上:可触及)、脾脏肿大(可触及) ?.外周血白细胞分类以淋巴细胞为主，异形淋巴细胞百分比,10%; ?. EBV感染证据:抗 EBV-CA-IgM阳性。 具备诊断标准?中任意 3条，并同时具备?，有或无?，可诊断 IM。 1.2.1 EBV-AHS:符合 HLH-2004诊断标准[18](见表 1-1)，并且同时具有 EBV 感染证据，除外其他原因继发 HLH者。 表 1-1:HLH-2004诊断标 准 以下 8条中符合 5条，诊断 HLH成立: (1).持续发热(超过 7天，峰值, 38.5?) (2).脾大 (3).全血细胞减少，累及?2个细胞系(Hb,90g/L，PLT,100×10/L,ANC,1×10/L) 9 9 (4).高甘油三脂血症(TG?2mmol/L)和(或)低纤维蛋白原血症(Fg,1.5g/L) (5).骨髓、脾、淋巴结内组织细胞良性增生并有吞噬血细胞现象 (6).自然杀伤细胞(NK细胞)活性降低或消失 (7).高铁蛋白血症(SF?500ug/L) (8).高可溶性白细胞介素-2受体(sCD25?2400IU/ml)水平 1(4实验分组 根据 1.2的诊断标准，将 48例 EBV感染患儿分为 IM组和 EBV-AHS组， 其中 IM组 43例，EBV-AHS组 5例。 1(5统计方法 — 所有数据采用 SPSS17.0统计软件分析，正态分布资料用均数?标准差 ( x? s)表示，采用两独立样本的 t检验(Independent-samples T text);偏态分布资 19 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 料用中位数(范围)表示，采用 Mann-Whitney秩和检验。计数资料以构成比(%) 表示，采用两独立样本率的卡方检验;两变量间的相关分析用 Peason相关分析， 当 P,0.05时，认为有统计学意义。 2(结果 2(1 EBV感染患儿一般临床资料 2.1.1性别、年龄:IM组 43例，男 34人，女 19人，男女比例 1.8:1;发病年 龄 13个月,13岁，平均 4.6岁;EBV-AHS组 5例，男 2人，女 3人;发病年龄 10个月,6岁。IM组男性患儿多于女性患儿，以学龄前儿童多见(60.5%)。 2.1.2临床表现:IM组发热、咽峡炎各 42例(97.7%)，其中热程中位数 5d， 热峰 39.2?，颈部淋巴结肿大 41例(95.3%)，眼睑浮肿 21例(48.8%)，肝 脏肿大 28例(65.1%)、脾脏肿大 20例(46.5%)，皮疹 9例(20.9%)。发热、 咽峡炎和淋巴结肿大是 IM典型临床表现。眼睑浮肿发生率高于脾肿大和皮疹。 2.1.3一般实验室检查(见表 EBV-AHS组均表现为持续高热(热程中位数 27d，热峰 40.4?)，颈部1-3) 本研究中 EBV-AHS组 WBC、ANC、Hb、PLT明显低于 IM淋巴结 组，AST、ALT、 肿大，肝脏明LDH明显高于显增大(均为肋缘下 IM组，提示 7cmEBV及以上)，脾脏中度肿大(均为肋缘下-AHS组血液系统、肝脏系统损害重。两 3cm及以上)。IM组与 EBV-AHS组主要临床表现(见表 1-2)。两组中外 组间的热峰、周血涂片异形淋巴细胞、外周血淋巴细胞比例、单核细胞比例差异无统计学意义。 Table1-3.The laboratory finging of IM and EBV-AHS 热程有显著差异;肝、脾肿大的大小无显著差异。表 1-3:IM和 EBV- AHS的实验室结果比较 实验室指标 IM组 EBV-AHS组 P值 x?s/中位数(范围) x?s/中位数(范围) .176** 异形淋巴细胞(%) 2(0-63) 10(0-44) 20 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 9 -1 .017* 白细胞(WBC)/×10 L 11.45?5.51 4.82?7.07 9 -1 .011* 3.14?2.06 0.28?0.21 中性粒细胞计数/×10 L .000* 123?11 69?18 血红蛋白(Hb)/g/L .000* 9 -1 血小板(PLT)/×10 L 215?55 55?17 .876* 淋巴细胞比例(%) 62.12?14.71 65.08?34.78 .589* 单核细胞比例(%) 1.31?0.99 0.15?0.13 .008** -1 38(12-640) 249(52-572) 谷丙转氨酶(ALT)/U?L .008** -1 谷草转氨酶(AST)/U?L 47(1-769) 300(41-1577) .000* -1 乳酸脱氢酶(LDH)/U?L 379?128 1690?759 .009* IgG(g/L) 6.85?1.95 13.29?4.19 .004* 1.89?0.63 0.69?0.60 IgM(g/L) *:两独立样本 T检验;**:Mann-Whitney秩和检验 2.1.4 EBV-AHS特殊实验室检查 EBV-AHS患儿检测了血清铁蛋白(SF)、甘油三脂(TG)和纤维蛋白原(Fb)。 5例 EBV-AHS患儿 SF均明显增高，超过 2000ug/L;甘油三脂均升高，均数为 5.5?2.3mmol/L;纤维蛋白原均降低，均数为 1.4?0.8g/L。 3(讨论 EBV属于疱疹病毒γ亚科的一种嗜淋巴细胞 DNA病毒，在人群中普遍易感。 EBV主要通过唾液的密切接触传播，也可通过输血和粪便传播。在发展中国家 EBV感染多发生于 3,6岁以前，而在发达国家多见于 10,30岁[19]。EBV原发 感染通常是无症状的血清学转换，部分可以发展为具有典型临床表现的 IM，我 国 IM的发病高峰年龄为4,6岁，而欧美国家好发于青春期和成人[4]。本研究中 IM病例男性患儿多于女性患儿，特别是学龄前儿童多见(60.5%)，与国内报道 的IM高发年龄一致[20]。 EBV在体内有两种感染形式:裂解复制和潜伏感染。裂解期表达即刻早期基 因(IE)BZLF1、BRLF1,早期基因(E)BNLF2α和晚期基因(L)BCRF1[21] 。即刻 早期基因产物是病毒进入裂解复制的转化活化因子，在病毒由潜伏阶段进入裂解 21 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 复制或再活化以及病毒的传播中起着重要作用;早期基因产物在病毒复制、代谢 及阻止抗原提呈方面起作用，晚期基因产物主要起免疫逃逸作用。潜伏感染时表 达 6种核蛋白(EBNA1、2、3A、3B、3C和 LP)、3种膜蛋白(LMP1、2A和 2B)、两种小的非聚腺苷酰化 RNA(EBERs)和 Bamh1A。EBV潜伏感染与许 多系统的恶性肿瘤有关，研究最多的有鼻咽癌、Bukitt淋巴瘤(BL)、移植后淋 巴细胞增殖性疾病等。有研究通过流行病学调查发现，EBV-IgM阳性的母亲， 其子女罹患急性淋巴细胞白血病(ALL)危险性增加，表明母亲妊娠期感染 EBV 可能与儿童 ALL的发生有关[22]。在儿童期及青少年期 EBV感染多为裂解感染， 主要见于 IM。IM本质上是一种自限性的淋巴细胞增殖性疾病，一般预后良好， EBV可以感染 B淋巴细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、T细胞、NK细胞以及 少数可合并严重并发症如:肺炎、肝衰竭、脾破裂、上呼吸道梗阻以及中枢神经 浆细胞[23]。目前认为 EBV主要感染 B细胞，原发感染时唾液中游离 系统疾病。极少数可发展为 EBV-AHS，临床过程凶险，不及时诊断治疗迅速死 EBV通过 亡。本研究中有 43例符合 IM的诊断标准，5例符合 HLH-2004病毒包膜糖蛋白 gp350/220与 B细胞表面分子受体 CD21结合，内吞诊断标准，并确 进入 B淋巴 诊为 EBV-AHS。 细胞，并建立潜伏感染，只表达免疫原性低的 EBNA、LMP。而在少数 B细胞 内合成 EA等病毒早期基因产物，MA和 VCA，进行裂解复制。EA、MA和 VCA 是具有高度免疫原性的抗原分子，刺激机体产生特异性病毒抗体，并且诱导 NK 细胞、巨噬细胞产生非特异性免疫反应以及细胞毒 T淋巴细胞(CTL)产生特异 性免疫应答[24]。T、B细胞的克隆增殖和免疫细胞分泌的炎症细胞因子从而产生 了 IM的典型临床症状。EBV特异的 CTL细胞可清除 EBV感染的 B细胞，降解 EBV-DNA，阻止其感染邻近正常细胞，IM临床表现可逐渐消退。与 IM不同的 是 EBV-AHS主要感染 T/NK细胞，使 CTL和 NK细胞失去了清除被 EBV感染 细胞的能力，导致淋巴细胞大量增殖、活化，分泌大量细胞因子及级联放大反应， 诱发其吞噬血细胞，产生噬血现象，造成组织细胞及器官的免疫损伤，引起 EBV-AHS的各种临床症状，如:IFN-γ可引起胆汁淤积和低蛋白血症;IL-1β 22 HLH是一种以持续发热、全血细胞减少、肝脾肿大和骨髓、淋巴结和肝脏 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病等组织中吞噬血细胞现象为临床特征。多种原因可引起 HLH其中包括遗传因素、 毒感染特征 感染、肿瘤、自身免疫系统疾病等。HLH可分为先天性和后天性，先天性 HLH 可激活纤溶酶原及Х因子，引起高甘油三脂血症等[25]。因此 EBV-AHS多呈暴发 分为两类:一类为家族性 HLH(familial hemophagocytic 性过程，一旦诊治不及时可迅速死于DIC和多器官功能衰竭[15] 。 lymphohistiocytosis， FHLH)，常有穿孔素基因 PRF、UNC13D、STX11等基因突变;一类为免疫缺陷 疾病如先天性白细胞颗粒异常综合征(CHS)、格里塞利综合症(GS)、X性联 淋巴增殖综合征(X-linked lymphoproliferative disease，XLP)分别有 RAB27A、 LYST、SH2D1A基因缺陷。后天性 HLH以感染多见，包括病毒、细菌、真菌、 寄生虫等都可以诱发，感染中以 EBV感染最为常见，为 EBV-AHS。无论是先天 还是后天 HLH，EBV都是最常见的触发因素。EBV-AHS的发病机制仍未完全阐 明。目前主要认为与细胞免疫功能失调有关，大量免疫细胞被激活，增殖、活化， 产生大量细胞因子，形成细胞因子风暴。这些细胞因子主要是 Th1型，使 Th1/Th2 比例失衡，感染与免疫的平衡被打破[30]。Chuangdeng[31]研究发现，EBV感染后 EBV潜伏膜蛋白-1(EBV-LMP1)可以在转录的水平上抑制信号淋巴细胞活化分 子相关蛋白[signal lymphocyte activation molecule(SLAM)-associated protein(SAP)] 的表达，活化下游细胞外信号调节激酶(ERK)和 IFN-γ，上调 Th1细胞因子。 LMP1通过 TNF受体相关因子(TRAF)2,5/NF-кB途径介导了 SAP/ERK/IFN- γ信号通路，通过 TRAF2,5/NF-кB抑制剂可以增加 SAP表达并且下调 IFN-γ。 因此，EBV感染后 LMP1可抑制 SAP表达，使 T细胞显著活化，分泌大量 Th1 细胞因子，从而导致 EBV-AHS的发生。XLP正是由于 SH2D1A基因突变，SAP 表达缺陷，EBV感染后不能产生有效的免疫应答，多表现为致死的结果。 SAP SLAM等受体竞争性结合，阻止磷酸化酶 2(SHP-2)活化，下调下游信号传导。 是维持 T细胞依赖的体液免疫反应、NK/CTL细胞毒作用、iNKT细胞发育及 23 T/B 细胞相互作用以确保生发中心形成所必须的[32,33]。SLAM能上调 T/B细胞活化的 受体蛋白，在 T/B淋巴细胞的增生中发挥重要作用。SAP通过 SH2结构域与 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 缺乏 SAP影响 T/B细胞间作用，从而导致 EBV感染后机体不能控制 B淋巴细 胞的增殖[34,35]。SAP通过与 NK、CD8+T细胞受体分子 2B4、NTB-A相互作用， 染细胞的能力，导致 EBV感染 B淋巴细胞堆集、T淋巴细胞过度活化增殖[36] 。 抑制 SHP-2与 2B4及 NTB-A的结合，而 SAP缺陷则LMP1还可以介导 TNF-α的上调，而大量 TNF-α可以诱导肝细胞凋亡和坏消弱 NK细胞识别病毒感 死， 。 从而引起肝功能损害甚至衰竭[37] IM主要临床表现包括发热、咽峡炎、颈部淋巴结肿大、肝脾肿大，其中发 热、咽峡炎和颈部淋巴结肿大为 IM三联症。本研究病例中，IM组眼睑浮肿发 生率较高(48.8%)，仅次于三联征，高于皮疹和脾脏肿大发生率。有人认为眼 睑浮肿对 IM的诊断与上述其它典型表现有着同样重要的临床意义[2]。本组病例 可以看到，IM发病初期，眼睑浮肿比较常见，因此，患儿存在发热、咽峡炎等 临床表现同时具有眼睑浮肿的体征时，应考虑到 IM的可能。EBV-AHS较 IM组 相比热程更长(P=0.006)，热峰更高(P=0.001)，有研究表明热程,10d是 IM 并发 EBV-AHS的危险因素之一。因此 IM患儿如反复高热不退者要注意 本研究中 EBV-AHS的血液系统、肝脏系统损害严重， EBV-AHS组 WBC、 EBV-AHS可能。 ANC、Hb、PLT明显低于 IM组，AST、ALT、LDH明显高于 IM组。AST和 LDH在体内广泛分布，虽然缺乏特异性，但其升高往往提示肝脏和心肌等多种 器官组织损伤，其中尤以 LDH改变更明显(P=0.000)，均数为 1690?759U/L。 有研究指出:LDH进行性升高,1000U/L是 IM患儿发生 EBV- EBV-AHS组血清铁蛋白明显增高(超过 2000ug/L)，纤维蛋白原明显降低， AHS的临床危险 甘油三脂均升高，符合 EBV-AHS的典型特点，其变化主要与高细胞因子血症和 因素之一[42]。因此 LDH在 EBV感染患儿中与病程进展的相互关系值得进一步严重肝功能损害有关。血清铁蛋白,500ug/L是 2004年新增的诊断指标之的 一， 研究。 引起铁蛋白升高的因素有很多，如导致铁蛋白异常的疾病会出现铁蛋白升高，有 研究报道，330例铁蛋白,500ug/L的患者中仅 10例确诊为 HLH，而当铁蛋白 24 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 ,10000ug/L时对确诊 HLH的敏感性达 90%，特异性。因此铁蛋白在 为 96%[43] HLH中的诊断价值需要进一步研究。 4(结论 1(本研究中 IM以男性多见，好发于学龄前儿童。发热、咽峡炎、颈部淋 巴结肿大、肝脾肿大是 IM常见临床表现，眼睑浮肿与其它典型表现一样对 IM 具有诊断价值。热程、热峰有助于判断 IM是否发生 EBV-AHS。 2(儿童 EBV-AHS血液系统和肝脏损害严重，酶学中以 LDH升高更为显 著。 血清铁蛋白、甘油三脂和纤维蛋白原在 EBV-AHS的早期阶段即有改变，一旦临 床上怀疑 EBV-AHS应尽快完善以上检查，便于早期诊断和治疗。 25 EBV原发感染后可以产生病毒特异的体液免疫反应和细胞免疫反应，虽能 控制感染但不能完全消除病毒。临床上常通过免疫荧光的方法检测血清 EBV抗 原特异性的抗体滴度反映 EBV感染后机体的体液免疫反应情况。VCA、MA和 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病EA是 EBV裂解感染所表达的抗原， EBNA为潜伏感染所表达抗原。一 毒感染特征 般来说， 抗 EBV-CA-IgM于原发感染后的 4,7天出现，3,4周达到峰值，之后迅速减第二部分 少， EBV感染患儿血清学抗体检测与临床关系分析 12周基本消失，是新近感染的标志[8]，然而在少数患者感染 6个月后仍可存在[9]， 并有报道少数个体可能不产生[10]。抗 EBV-CA-IgG与 IgM同时出现，达到峰值 后缓慢减少，并持续存在。抗 EBV-NA-IgG在感染后 4,6周出现并持续终生。 EA抗原分两种成分，其中 EA-D是病毒增殖初期形成的抗原，抗 EA-IgG阳性 提示近期感染，EA-R是感染恢复期抗原，其相应抗体提示处于恢复期。 EBV抗体检测是诊断 IM的主要指标，根据血清中 EBV抗体谱可将 EBV分 为原发感染(抗 VCA-IgM阳性，抗 EBNA-IgG抗体阴性，抗 VCA-IgG、EA-IgG 阳性或阴性)，亚急性感染(抗 VCA-IgM、VCA-IgG、EBNA-IgG阳性，抗 EA-IgG 阳性或阴性)和既往感染(仅抗 VCA-IgG和抗 EBNA-IgG阳性，余阴性)。EBV 抗体也是诊断慢性活动性 EBV感染(chronic active epstein-barr virus infection， CAEBV)的主要指标之一，CAEBA的患儿在 EBV感染后可出现慢性或复发性 IM样症状伴随 EBV抗体的异常改变。在健康携带者，EBV感染后随着病毒特 异的免疫监视功能的建立，病毒基因由线状环化成附加体，仅表达与潜伏感染有 关的免疫原性低的蛋白以利于免疫逃逸，如:EBNA、潜伏膜蛋白(LMP)等， 病毒不再进行自我复制，随宿主细胞周期复制而复制。与急性感染相关抗体 VCA-IgM，EA-IgG水平逐渐下降，与潜伏感染相关抗体 EBNA-IgG开始出现， 并与 VCA-IgG抗体维持在低水平。而在 CAEBV时 VCA-IgG和 EA-IgG抗体滴 度异常增高，而与病毒基因环化相关 EBNA-IgG滴度较低或测不到，推测 CAEBV 发病可能与 EBV不能进入潜伏感染有关[44]。Imashuku[39]等人回顾性分析了 94 26 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 例 EBV-AHS血清抗体谱指出:62%EBV-AHS病例抗 EBNA-IgG阴性，他认为 具有正常免疫力的个体 EBV感染几个月后可产生抗 EBNA-IgG抗体，而那些不 能对 EBV感染产生正常免疫力的个体易发展成 EBV-AHS。因此，本研究通过检 1(材料和方法 测 EBV感染患儿血清中特异性抗体谱以了解病毒感染后机体的体液免疫情况。 1(1主要试剂 EB病毒壳抗原 IgM定量检测试剂德国维润赛润公司 盒 德国维润赛润公司 EB病毒壳抗原 IgG定量检测试剂德国维润赛润公司 盒 德国维润赛润公司 EB病毒早期抗原 IgG定量检测试德国维润赛润公司 剂盒 1(2主要仪器与设备 EB病毒核抗原 IgG定量检测试剂 超低温冰箱 New Brunswick Scientific公司 盒 上海实验仪器总厂 101A-1干燥箱 类风湿因子 Rf-吸附剂 Muti Temp?恒温循环水浴箱 美国 Pharmacia公 司 SW-CJ-IFD洁净工作台 苏净集团案太空其技术有限公司 上海安亭科学仪器厂 TDL-5C低速台式大容量离心机 BIOFUGE PRIMO.R低速离心机 美国 Thermo Scientific公 司 Thermo MULTISKAN MK3酶标仪 美国 Thermo Scientific公Thermo洗板机 司 康氏振荡器 美国 Thermo Scientific公1.3方法 司 1.3.1标本采集: 富华电器有限公司 所有患儿标本在入院时采集，用促凝管收集外周静脉血 2ml，部分病例于 1 周后复查，EBV-AHS患儿均于 1周后复 查。 27 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 1.3.2分离血清: 收集的血标本离心，2500rpm/min×15min，吸取上层血清，将血清等分装 于ep管中，放于-80?冰箱。 1.3.3酶联免疫法检测血清中 EBV特异性抗体: 1.3.3.1准备工作及注意事项 实验前将所有试剂置于室温;充分混匀试剂，使用前振荡装有对照血清的 小管和所有稀释过的溶液。 1.3.3.2检测血清中抗EBV-CA-IgG、EBV-EA-IgG、EBV-NA-IgG 本实验用抗原包被好的微量板孔制成的固相载体，加患者的血清到板孔中， 其所含的抗体特异性地与固相载体中的抗原结合，形成免疫复合物。除去多余物 质后，加入碱性磷酸酶标记的 IgG或 IgM抗体，使之与上述免疫复合物反应。 洗去多余物质后，加入底物(对硝基磷酸盐)，其与酶结合的免疫复合物反应， 产生有颜色的产物，颜色强度与特异性抗体含量成正比。选用德国维润赛润公司 的 EB病毒抗原检测试剂盒，按说明书进行。 ?.加 10ul待测血清于 1ml稀释缓冲液中，充分振荡混匀。 ?.稀释样本、阴性对照血清、标准血清设三个平行孔，各 100ul加入微量孔内。 ?. 37?孵育 60min。 ?.每孔各加入 300ul洗液，共洗 4次，最后 1次，将微孔板翻转过来在纸巾上 拍打，使微孔中不再含有液体。 ?.每孔各加入酶标记的抗体 100ul(空白孔除 外)。 ?. 37?孵育 30min。 ?.每孔各加入 300ul洗液，共洗 4次，最后 1次，将微孔板翻转过来在纸巾上 拍打，使微孔中不再含有液体。 ?.每孔各加入 100ul底物。 ?. 37?孵育 30min。 ?.每空各加入 100ul终止液，轻微振荡微孔板。 ?. 405纳米读取消光系数，以底物空白作为空白对照液 28 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 1.3.3(3检测血清中抗 EBV- CA-IgM ?(先加 200ulRf-吸附剂于 800ul稀释缓冲液中，充分振荡混匀。 ?(之后按 1.3.3.2中的步骤进行。 1.4统计学分析 — 所有数据采用 SPSS17.0统计软件分析，正态分布资料用均数?标准差 ( x? s)表示，采用两独立样本的 t检验;偏态分布资料用中位数(范围)表示，采 用 Mann-Whitney秩和检验。计数资料以构成比(%)表示，采用卡方检验;两 变量间的相关分析用 Peason相关分析，当 P,0.05时，认为有统计学意义。 2.结果 2(1 EBV感染后特异性抗体谱表现 EBV感染后根据抗体谱可分为原发感染(抗 VCA-IgM阳性，抗 EBNA-IgG 阴性，抗 VCA-IgG、EA-IgG阳性或阴性);亚急性感染包括 EBV持续感染、再 活化以及再感(抗 VCA-IgM、VCA-IgG、EBNA-IgG阳性，抗 EA-IgG阳性或阴 性;既往感染(仅抗 VCA-IgG和抗 EBNA-IgG阳性，余阴性)。 IM中 43例患 儿抗 VCA-IgM均阳性，其中有 1例入院时 EBV四项抗体均阴性，1周后复查抗 表 2-1:IM组 EBV四 VCA-IgM/IgG和抗 EA-IgG转阳性。IM组抗体谱(见表 2-1)，根项抗体谱 Table 2-1:The serological patterns of the EBV-related antibodies in IM 据抗体谱表现， VCA-IgM VCAIgG EA-IgG EBNAIgG 合计(例) 本组 IM病例中，65.1%为原发感染， 5例 EBV-AHS患儿 ，/, ，/, 28 原发感染 ， , 抗体谱均表现为既往 ， ， ， 15 亚急性感染 ，/, 感染(仅抗 VCA-IgG和抗 EBNA-IgG阳性，余阴性(见表 表 2-2:EBV-AHS组 EBV四 2-2)，一周后复查 项抗体谱 Table 2-2:The serological patterns of the EBV-related antibodies in EBV-AHS 抗 VCA-IgM，抗 EA-IgG仍为阴性。 29 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 Cases VCA-IgM VCAIgG EA-IgG EBNAIgG , 1 , ， ， , ， ， 2 , , ， ， 3 , , ， ， 4 , , ， ， 5 , 2.2原发 EBV感染和亚急性 EBV感染临床表现和实验室检查比较 2.2.1症状与体征原发 EBV感染和亚急性 EBV感染在入院诊断时的临床症状 和体征比较(见表 2-3)，原发 EBV感染眼睑浮肿和肝脏肿大发生率高于亚急性 表 2-3:EBV原发感染和亚急性患儿症状和体征的发生率比较 EBV感染患儿。 EBV原发感染* EBV亚急性感染** 症状 卡方检验 2 (n)(%) (n) (%) χ 值 P值 96.4% 发热 27 15 100% 1.000 27 96.4% 15 咽峡炎 100% 1.000 7 25.0% 2 .615 皮疹 13.3% .253 60.7% 26.7% 4.532 .033 眼睑浮肿 17 4 肝脏肿大 22 78.6% 40.0% 6.397 .011 6 淋巴结肿大 27 96.4% 93.3% 1.000 14 脾脏肿大 16 57.1% 4 26.7% .056 3.647 注:*:EBV原发感染组28例，**:EBV亚急性感染组15例。 2.2.2实验室检查 EBV原发感染组和亚急性感染组主要实验室检查结果比较 (见表 2-4)。两组肝功能以酶学改变为主，且 EBV原发感染较亚急性感染 LDH 升高更为明显。原发感染组有肝功能损害的 16例(59.3%)，亚急性感染 表 2-4:EBV原发感染和亚急性感染组主要实验室检查均数的比较 3例 30 (20%)，两组比较差异有统计学意义(χ2 =8.046，P=0.005)。 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 实验室指标 原发EBV感染 亚急性EBV感染 T检验 P值 t值 异形淋巴细胞/% 14.39?11.04 13.73?14.70 0.166 .869 淋巴细胞比例/% 64.36?11.04 57.93?19.64 1.174 .255 单核细胞比例/% 10.05?4.80 10.41?3.55 -.248 .805 9 -1 淋巴细胞计数/×10 8.18?3.70 5.37?3.88 2.235 .025 L 9 -1 单核细胞计数/×10 L 1.49?1.07 1.05?0.81 1.360 .182 -1 1.501 .140 谷丙转氨酶(ALT)/U?L 113.86?158.29 48.73?72.46 -1 谷草转氨酶(AST)/U?L 104.96?154.97 51.57?55.95 1.193 .241 本研究中原发感染是 IM抗体谱的主要类型(65.1%)，43例 -1 乳酸脱氢酶(LDH)/U?L 422.22?120.63 301.92?105.48 3.001 .005 IM患儿入院 时 42例 VCA-IgM阳性，有 1例入院时四项抗体均阴性，1周后复查表现为原发 3.讨论 感染。抗 VCA-IgM抗体阳性一直是 EBV感染所致 IM的诊断依据，但有研究显 示，在某些患者抗 VCA-IgM产生可能延迟，12,17%大于 16岁儿童原发 EBV 感染后不能检测到抗 VCA-IgM抗体[10]。因此对于临床可疑的 IM入院时 EBV抗 体检测阴性者，可予复查以提高阳性率。Henry等人研究认为[12]:非原发 EBV 感染较原发感染临床症状缓解较慢。本研究比较了 EBV原发感染和亚急性感染 组入院时的临床表现和主要实验室检查显示前者较后者肝脏肿大、眼睑浮肿、肝 损发生率高(P=0.033、P=0.011、P=0.005)，且以 LDH(P=0.005)升高尤为显 著，显示 EBV原发感染较亚急性感染在诊断时症状更典型，病情更重。 本研究中 5例 EBV-AHS患儿抗 VCA-IgM及抗 EA-IgG均为阴性，抗 EBNAIgG、抗 VCAIgG均为阳性，EBV抗体四项表现为既往感染。提示 为既往感染，其中 70.5%的患儿抗 EBNA-IgG抗体阳性，提示 EBV-AHS多发生 31 EBV-HLH 病例均可能存在对 EBV感染的免疫功能的异常，不能产生相应的特异性抗体或 抗体延迟出现。我国研究显示，78例 EBV-AHS患儿仅 39.5%为原发感染，21.8% EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 于EBV再活化[45]，这与日本报道94例其中62%患者抗EBNA-IgG阴性有差异[39] 。 这种差异可能与个体的免疫差异、EBV不同亚型以及潜在的免疫缺陷等有关。 多种原因可引起 HLH其中包括遗传因素、感染、肿瘤、自身免疫系统疾病， EBV-AHS是感染所致 HLH中的常见类型。无论是先天性还是后天性 HLH，EBV 60都是最常见的触发因素。不同病因所致-70%随原发病的治愈而缓解，而未经治疗的 HLH 预后不同，非EBV-AHS 常常是致命的EBV感染所致[16] 。早 HLH， 期明确 HLH的病因对病人的治疗及评估预后至关重要。EBV-AHS诊断标准必 须符合 HLH诊断标准并且有 EBV感染证据，因 EBV-AHS患儿可继发免疫功能 异常，血清 EBV抗体可呈阴性，故血清 EBV抗体阴性不能除外 EBV感染，需 做进一步病原学检查，如:EBV-DNA PCR以明确。 4.结论 1.本研究中 IM入院诊断时血清抗体谱以原发感染为主 (65.1%)，EBV 原发感染较 EBV亚急性感染临床症状更典型，病情更重。临床怀疑 IM 入院时抗 VCA-IgM阴性患儿予以复查，可提高阳性率。 2.在诊断 EBV-AHS时血清 EBV抗体阴性是不能除外 EBV感染，需做进 一步病原学检查。 32 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 第三部分 EBV感染患儿血清中EBV-DNA负载量检测分析 检测血清中 EBV抗体仅能反映病毒感染后机体的免疫情况，并不能反映病 毒本身，因此常通过 FQ-PCR的方法检测患者体内 EBV-DNA拷贝数，来反映体 内病毒的活动情况。临床上用于检测的标本多样，有血清、血浆、外周血单个核 细胞以及口腔灌洗液等。 不同 EBV感染相关疾病，其生物学特性有所不同。例如:鼻咽癌患者，癌 细胞在组织中增生，几乎很少进入外周循环，因此外周血中大部分 EBV基因组 为游离病毒;相反， PTLD中，EBV感染的 B细胞可以移行至外周血，因此， 外周血中 EBV基因组大部分位于细胞内[6]。所以应根据疾病以及检测的目的选 用合适的标本。EBV原发感染时，外周血中同时存在细胞内 EBV和游离 EBV。 在疾病早期，几乎所有患者体内均可检测到 EBV，当机体出现 EBV特异性免疫 基因组。研究表明，反应时，PBMCs中的IM 患儿血清中EBV- DNA逐渐减少，但血浆EBV-DNA负载量与疾病的严重程度相关/血清中的 EBV-[12]DNA 。 迅速减 因此检测患儿血清/血浆 EBV-DNA负载量对于疾病的诊断和了解病情有帮助。 少，因此，血清抗体阳性的健康病毒携带者的血清或血浆中很难检测出游离本研究通过检测 EBV感染患儿血清中 EBV-DNA负载量了解不同疾病状态下 EBV 病 毒的活动情况。 1.材料和方法 1.1主要试剂 QIAamp MinElute Virus Spin Kit 德国 QIAGEN公 司 EB病毒荧光定量 PCR试 中山大学达安公司 剂盒 安徽双鹤药业公司 生理盐水 无水乙醇 广州化学试剂厂 33 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 1.2主要仪器和设备 超低温冰箱 New Brunswick Scientific公司 上海实验仪器总厂 101A-1干燥箱 Muti Temp?恒温循环水浴箱 美国 Pharmacia公 司 SW-CJ-IFD洁净工作台 苏净集团案太空其技术有限公司 上海安亭科学仪器厂 TDL-5C低速台式大容量离心机 BIOFUGE PRIMO.R低温离心机 美国 Thermo Scientific公 司 Bio-rad荧光定量 PCR仪 美国伯乐公司 康氏振荡器 富华电器有限公司 1.3方法 1.3.1标本采集: 所有患儿标本在入院时采集，用促凝管收集外周静脉血 2ml，1例患儿于 住院后的第 8天、第 16天、第 22天再次抽取血标本。 1.3.2分离血清: 收集的血标本离心，2500rpm/min×15min，吸取上层血清，将血清等分装 于ep管中，放于-80?冰箱保存。 1.3.3提取DNA(提取柱法): 待收集一定数量标本后，使用QIAamp DNA Mini kit(Qiagen)提取血清中 DNA，将提取DNA等分储存于-80?冰箱。 1.3.3.1准备工作 带滤芯吸头使用进口灭酶处理的一次性用品，ep管使用前高压灭菌 20min 烘干后备用。 1.3.3.2实验前准备:将离心机温度设置为 20?;Buffer AVE恢复至室温;干燥 箱温度设置为 56?。 ?.向 1.5mlep管中加入 25ul已用 Buffer AVE重悬的 protease。 ?.加入 200ul患儿血清。 ?.加入 200ulBuffer AL-Carrier AVE，盖上 ep管盖，振荡 15s。 34 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 ?.干燥箱 56?孵育 15min。 ?.短暂离心以移去附着于 ep管盖上的溶 液。 ?.加入 250ul无水乙醇，盖上管盖振荡 15s，充分混匀，室温孵育 15min。 ?.短暂离心以移去附着于 ep管盖上的溶液。 ?.将提取柱置于 2ml ep管内，小心吸取步骤?中的液体加于提取柱中， 不要将溶液洒于提取住边缘。 ?.离心 6000g/min×1min。 ?.弃 2ml ep管中滤液，小心打开提取住盖，加 500ulBuffer AW1。 ?.离心 6000g/min×1min。 ?.将提取柱置于新 2ml ep管中，小心打开管盖，加 500ul Buffer AW2， 不要洒于提取柱边缘。 ?.离心 6000g/min×1min。 ?.将提取柱置于新 2ml ep管中，20000g/min×3min。 ?.将提取柱置于新 1.5ml ep管，小心打开提取柱的盖子，加 50ulBuffer AVE于提取柱，盖上管盖室温孵育 5min. ?.离心 20000g/min×1min。 ?.将提取的 DNA等分，放于-80?冰箱保存。 1.3.4荧光定量 PCR(FQ-PCR)检测 EBV-DNA负载量 本实验用一对 EBV特异性引物和一条 EBV特异性荧光探针，利用荧光信 号累积实时监测整个 PCR进程，最后对未知进行定量分析。选用中山大学 达安基因股份有限公司的 EB病毒核酸扩增(PCR)试剂盒，按照说明书，以血 清中提取的 DNA为模板进行 PCR反应。 ?(每个样本设有三个平行反应管，定量结果取其均值。每次反应设置三个无模 板的阴性对照。EBV阳性定量参考品、EBV临界阳性质控品设有三个平行 管，定量结果取其均值。 ?(取 PCR反应管若干，分别加入处理后的样品(标本、阴性质控品、临界阳 35 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 性质控品)以及阳性定量参考品 2ul，8000rpm离心数秒，放入一起样品槽。 ?(反应程序 93? 2min 1cycle 93? 45s 10cycle 55? 1min 30s 93? 30cycle 55? 45s 1.4统计学分析 — 所有数据采用 SPSS17.0统计软件分析，正态分布资料用均数?标准差 ( x? s)表示，采用两独立样本的 t检验;偏态分布资料用中位数(范围)表示，采 用 Mann-Whitney秩和检验。计数资料以构成比(%)表示，采用卡方检验;两 变量间的相关分析用 Peason相关分析，当 P,0.05时，认为有统计学意义。 2.结果 2.1荧光定量 PCR检测 EBV感染患儿血清中 EBV-DNA负载量情况 2.1.1 EBV-DNA扩增标准曲线 利用 EBV阳性定量参考品作 PCR反应后，得到标准曲线线性方程显示 相关 系数为 1.000，斜率为-3.413，扩增效率为 96.3%(Fig1)，试验中阴性质控品阳 IM组 43例其中 EBV-DNA阳性者 24例，均数为 性质控品均在质控范围内。本实验使用试剂盒的灵敏度为 5×103copies/ml。 5.88×104copies/ml，最大 2.1.2 EBV感染患儿血清中 EBV-DNA负载量情况 值 2.88×105copies/ml，最小值 8.24×103copies/ml。其中有 10例于住院治疗 7天 后复查血清中 EBV-DNA负载量，均转阴(IM组扩增曲线见 Fig2)。EBV-AHS 组 5例中 EBV-DNA均阳性，均数为 1.86×108copies/ml，最大值 9.25× 108copies/ml，最小值 2.88×105copies/ml，(EBV-AHS组扩增曲线见 Fig3)，IM 组和 EBV-AHS组入院诊断时血清中 EBV-DNA负载量结果(见表 3-1)。 36 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病毒感 染特征 表 3-1:IM组和 EBV-AHS组入院时血清中 IM组* EBV-AHS组** EBV-DNA负载量 24(56%) 5(100%) 阳性(例) EBV-DNA负载量 2.88×105 9.25×108 最大值(copies/ml) 8.24×103 最小值(copies/ml) 2.88×105 5.88×104 均数(copies/ml) 1.86×108 *:IM组 43例行血清 EBV-DNA-PCR检 测;**:EBV-AHS组 5例行 EBV-DNA-PCR检测。 EBV-AHS组中有 2例复查了 EBV-DNA负载量，其中 1 例于治疗后 9天复 查血清中 EBV-DNA负载量，由入院时的 1.10×106copies/ml下降为 2.56× 104copies/ml(患儿住院后经 04-HLH化疗治疗后病情好转，后死于化疗后 肺部感染);1例在住院期间动态观察了其血清中 EBV-DNA负载量变化，由入 院时 3.02×106 copies/ml—6.62×105copies/ml—1.20×104copies/ml—5.74× 103copies/ml—阴性(好转出院)，见(Fig4、5)。EBV-AHS组中 EBV-DNA 负载量明显高于 IM组(P=0.001)，IM组血清中 EBV-DNA负载量经住院治疗 后可迅速减少转阴，EBV-AHS血清中 EBV-DNA负载量随病情变化而变化。 Fig5:1例 EBV-AHS患儿血清中 EBV-DNA动态变化 37 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 Fig5:1例 EBV-AHS血清中 EBV-DNA拷贝数动态 变化情况(3.02×106 copies/ml—6.62×105copies/ml—1.20×104copies/ml—5.74×103copies/ml—阴 性)。 2.1.3.血清中 EBV-DNA负载量与病情程度 的关系 IM患儿根据血清中 EBV-DNA检测结果分为 EBV-DNA定量 阳性组和阴性 组(其中阳性组 24例，阴性组 19例)，比较两组主要实验室检查结果。 IM中 EBV-DNA阳性组男 19人，女 5人，平均年龄 4.3岁;EBV-DNA阴性组男 15 人，女 4人，平均年龄 4.75岁。两组性别、年龄差异无统计学意义(性别比χ2 表 3-2:IM中 EBV-DNA阳性组和阴性组主要实验室检查结果检验:P,1.000;年龄均数 T检验 P,0.536)。两组主要实验室检查结果比比较 实验室指标 EBV-DNA阳性组 EBV-DNA阴性组 T/Mann-whitney 较(见 秩和检验 — — x?s或中位数范围 x?s或中位数范围 表 3-2)。两组肝功能均有改变，且以酶学改变为主，EBV-DNA阳性组较阴性 P值 组升高更为明显，尤以 LDH升高明显(P=0.003)。 .088** 异形淋巴细胞/% 17.00?12.04 10.58?11.89 淋巴细胞比例/% 67.79?10.97 54.95?15.94 .003** 单核细胞比例/% 10.88?4.71 9.34?3.69 .276** 9 -1 8.90?3.66 淋巴细胞计数/×10 ** .0015.06?3.30 L 9 -1 单核细胞计数/×10 L ** .0451.60?1.02 0.96?0.85 谷丙转氨酶(ALT)/U?L .013* 52(14-640) 21(12-161) -1 .068** 122.00?171.24 45.08?23.32 谷草转氨酶(AST)/U?L 435.89?126.20 314.94?98.73 .003** -1 注:*:为Mann-Whitney秩和检验， **:为两独立样本T检验 乳酸脱氢酶(LDH)/U?L 2.1.4(EBV-DNA负载量与常见实验室检查相关性分析 -1 38 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 将 29例 EBV-DNA负载量与主要实验室数据进行相关性分析，结果见表 3- 3。 EBV-DNA负载量与异形淋巴细胞比例、 ALT均无显著相关性( P,0.05); 表 3-3:血清中 EBV-DNA负载量与实验室数据相关性分EBV-DNA与 AST(r=0.567，P=0.004)、LDH(r=0.885，P=0.004)呈正相关。 析。 EBV-DNA负载量 WBC ALT AST LDH 异形淋巴细胞 L比例 M比例 -.189 -.229 .567 .855 -.168 相关系数 -.188 .195 .368 .362 .005 .393 .004 .004 P值 .327 2.1.5(EBV-AHS患儿血清中 EBV抗体谱、EBV-DNA拷贝数和主要实验室数据 (见表 3-4) 本研究中 5例 EBV-AHS患儿抗 VCA-IgM均阴性，血清 EBV-DNA负载量 均阳性，且在 105数量级及以上;肝功能明显损害，且 AST、LDH有随 EBV-DNA 负载量增高而升高的趋势;血清中 EBV-DNA负载量明显升高者 表 3-4:EBV-AHS血清中 EBV抗体谱和对应的 ( 9.25×108 EBV-DNA拷贝数 VCAIgM VCAIgG EAIgG EBNAIgG EBV-DNA AST LDH 预后 copies?ml-1)，临床上呈暴发性经过，迅速死亡。 (copies/ml) (U/L) (U/L) 2.88×105 - + - + 286 2358 好转 1.10×106 - + - + 300 2350 死亡 1.11×106 - + - + 356 2456 死亡 3.02×106 - + - + 994 2346 好转 9.25×108 - + - + 1577 19220 死亡 3.讨论 IM组于入院时均行血清中 EBV-DNA检测，其中阳性者 24例 (56%)，均 39 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 数为 5.88×104copies/ml，最大值 2.88×105copies/ml，最小值 8.24×103copies/ml。 其中有 10例于住院治疗 7天后复查血清中 EBV-DNA负载量，结果均转阴。有 研究表明，原发 EBV感染的早期阶段(12d以内)，均可检测到病毒核酸，病 检测外周血标本中 EBV-DNA阳性率可达 ，本研究低于国外研究可能与 程 22d以后，血清均检测不到 EBV-DNA拷贝数[26]。国外研究显示采用 94.9%[27] 部分患儿住院前已在外院接受了抗病毒治疗、试剂盒的灵敏度以及留取标本的时 FQ-PCR 间有关(IM组有 5例于病程 3周后抽血)。EBV-AHS患儿于病程 3周后有的 超过 1个月血清中仍可检测到 EBV-DNA，且呈高数量级复制，提示这些患儿机 本研究比较了 IM中 EBV-DNA阳性组与阴性组主要 实验室检查显示， 体免疫力受损，不能有效控制病毒复制。 EBV-DNA阳性组肝功明显异常，以酶学改变为主(ALT、AST、LDH)，其值 较 EBV-DNA阴性组升高更加明显，差异有统计学意义(ALT: P=0.013;LDH: P=0.003)。同时将 EBV-DNA负载量与主要实验室数据进行相关性分析显示: EBV-DNA负载量与异形淋巴细胞比例、ALT无显著相关性(P,0.05);EBV-DNA 与 AST(r=0.567，P=0.004)、LDH(r=0.885，P=0.004)呈正相关。Raymondd[28] 等 本研究 5例 EBV-AHS血清中 EBV-人研究认为 IM患儿外周血中 EBV-DNA拷贝数与临床表现严重程度成正相 DNA拷贝数均阳性，均数为 1.86× 关， 108copies/ml，最大值 9.25×108copies/ml，最小值 2.88×105copies/ml。研究指出 也有人指出重症 EBV感染患者血清中存在 EBV-DNA高负载HLH可能[29] 。 HLH的预后与潜在病因密切相关，非 EBV感染所致 HLH，60-量，要注意并发 70%随原发病治 愈而缓解，而未经治疗的 EBV-AHS常常是致命的，尤其 EBV-DNA定量持续增 高者[38]。因此明确 HLH病因很重要。本组 5例 EBV-AHS仅靠血清学抗体检测 不能确诊。因此血清学抗体检测在诊断 EBV-AHS的价值有限。对于临床可疑 EBV-AHS而血清 EBV抗体阴性患儿因加做 EBV-DNA拷贝数，以明确诊断。 本研究中 IM患儿血清中 EBV-DNA负载量均值为 5.88×104copies/ml， EBV-AHS患儿血清中 EBV-DNA负载量均值为 1.86×108copies/ml，EBV-AHS 40 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 患儿血清 EBV-DNA拷贝数显著高于 IM组(P=0.001)。由于本组 EBV-AHS 例数不多，EBV-AHS体内 EBV高水平复制与临床严重程度的相关性还有待进 一步研究。Kimura[40]等也报道血浆和外周血单个核细胞中 EBV-DNA拷贝数显 著高于 IM患者。有研究指出[41]，暴发性 IM患儿血清中 EBV-DNA负载量, 106copies/ml(比普通 IM高 2个数量级)提示病情恶化或出现严重并发症如 HLH 等，并且指出动态监测患儿血清中 EBV-DNA负载量对于了解暴发性 IM患儿， 特别是发展为 EBV-AHS患儿的病情以及对治疗的反应很有价值。本研究中监测 1例 EBV-AHS患儿血清中 EBV-DNA拷贝数的变化，显示随着给予抗病毒和 4.结论 HLH-2004化疗方案治疗后，该患儿血清中 EBV-DNA负载量是逐步下降，最后 1(IM血清中 EBV-DNA负载量与临床严重程度呈正相关;转阴，该患儿临床症状缓解，病情好转出院。因此对于可疑 EBV-AHS病例，血 检测外周血 清学检查阴性者应行外周血 EBV-DNA定量检测，动态观察血中 EBV-DNAEBV-DNA拷贝数能更好反映体内 EBV的活动情况。 2(血清抗体检测在诊断 EBV-AHS中的敏感性不及荧光定量 PCR，血清负载 抗 量变化，帮助了解病情的变化和治疗效果。 体阴性时不能排除 EBV感染，需完善外周血中 EBV-DNA定量检测以明确。 3(EBV-AHS血清中 EBV-DNA负载量显著高于 IM患儿，对 于 EBV感染 特别是血清中 EBV-DNA呈高拷贝数的患儿，应动态观察外周血中 EBV-DNA负 载量变化，以了解病情的变化和治疗效果。 41 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 全文结论 1(本研究中 IM以男性多见，好发于学龄前儿童。发热、咽峡炎、颈部淋巴结 肿大、肝脾肿大是 IM常见临床表现，眼睑浮肿与其它典型表现一样对 IM具有 诊断价值。热程、热峰有助于判断 IM是否发生 EBV-AHS。 2(儿童 EBV-AHS血液系统和肝脏损害严重，酶学中以 LDH升高更为显著。血 清铁蛋白、甘油三脂和纤维蛋白原在 EBV-AHS的早期阶段即有改变，一旦临床 上怀疑 EBV-AHS应尽快完善以上检查，便于早期诊断和治疗。 3(本研究中 IM入院诊断时血清抗体谱以原发感染为主(65.1%)，EBV原发感 染较 EBV亚急性感染临床症状更典型，病情更重。临床怀疑 IM入院时抗 4(血清抗体检测在诊断 EBV-AHS的敏感性不及 FQ-PCR，在诊断 VCA-IgM阴性患儿予以复查，可提高阳性率。 EBV-AHS时 血清 EBV抗体阴性是不能除外 EBV感染，需完善外周血 EBV-DNA荧光定量检 5(IM血清中 EBV-DNA负载量与临床严重程度呈正相关;检测外周血 测以明确。 EBV-DNA 拷贝数能更好反映体内 EBV的活动情况。EBV-AHS血清中 EBV-DNA负载量显 著高于 IM患儿，对于 EBV感染特别是血清 EBV-DNA呈高拷贝数的患儿，应 动态观察外周血中 EBV-DNA负载量变化，以了解病情的变化和治疗效果。 42 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病毒感染特征 附表附图 表 1-2:IM与 EBV-AHS主要临床 表现比较 EBV-AHS组(n=5) IM组(n=43) 症状 P值 例数(n)构成比(%)均数/中位数例数(n)构成比(%)均数/中位数 1.000*** 发热 42 97.7% 5 100% .006** 热程中位数(天) 5 27 40.4?1.0 .001* 39.2?0.7 热峰 x?s 28 65.1% 5 (?) .167 *** 肝脏肿大 100% .142* 2.7?1.1 5.5?3.7 x?s(cm) 1.000*** 淋巴结肿大 41 95.3% 5 100% .025*** 咽峡炎 42 97.7% 3 60% .051*** 20 46.5% 5 脾脏肿大 100% .264** 中位数(cm) 2.0 4.0 *:两独立样本 T检验;**:Mann-Whitney秩和检验;***:Fisher精确概率法 43 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 Fig1:EBV-DNA扩增标准曲线 Fig2:IM组患儿血清中 EBV-DNA扩增曲线(IM组中血清 EBV- DNA负载量阳 性 29例，均数为 5.88×104copies/ml，最大值2.88×105copies/ml，最小值×103copies/ml。 8.24 44 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 Fig3:EBV-AHS组血清中 EBV-DNA扩增曲线(EBV-AHS组 5例中 EBV-DNA均 阳性，分别为 9.28×108copies/ml;3.02×106copies/ml;1.11×106copies/ml; 1.10×106copies/ml;2.88×105copies/ml。 病程中第 9天 病程中第 16 天 病程中第 24天 病程中第 30天 Fig4:1例 EBV-AHS患儿血清中 EBV-DNA扩增情况。 45 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 参考文献 [1]. Katherine Luzuriaga M.D, Joho L. Sullivan, M.D. Infectious Mononucleosis. [J]. NEJM. 2010; 362; 21: 1993-2000. [2]. Chan CW, Chiang AK, Chan RH, et al. Epstein-Barr virus-associated infectious mononucleosis in Chinese children. [J]. Pediatr Infect Dis J. 2003, 22 (11): 974 - 978. [3]. Macsween KF, Crowford DH. Epstein-Barr virus recent advances. [J]. Latent Infect Dis. 2003; 3(3): 131-140. [4]. Li-Wei Gao, Zheng-De Xie, Ya-Yi Liu, et al. Epidemiologic and clinical characteristics of infectious mononucleosis associated with Epstain-Barr virus infection in children in Beijing. [J]. World J Pediatr.2011; 7(1): 45-49. [5]. Papesch M, Watkins R. Epstein-Barr virus infectious mononucleosis. [J]. Clin Otolaryngol Allied Sci. 2001; 26: 3-8. [6]. Hiroshi Kimura, Yoshinori Ito, Ritsuro Suzuki, et al.Measuring Epstein-Barr virus(EBV) load:the significance and application for each EBV- associated disease. [J]. Virol. 2008; 18: 305-319. [7]. Oludare A, Kristin A, Henry H, et al. Progress and Problems in Understanding and Managing Primary Epstein-Barr Virus Infections. [J]. Vlinical microbiology. 2011: 24(1): 193-209. [8]. Thomas B. Martins MS et al. Evaluation of a Multiplex Fuorescent Microsphere Immunoassay for then Determination of Epstein-Barr virus Serologic Status. [J]. clinpathol. 2008:129:34-41. [9]. Thomas D, et al. Asystematic study of epstein-barr virus serologic assays follow- ing acute infection. [J]. Am J Clin Pathol . 2002; 117: 156-161. [10]. Robertson P, Beynon S, Whybin R, et al. Measurement of EBV-IgG anti-VCA avidity aids the early and reliable diagnosis of primary EBV infection. [J]. J Med Virol. 2003: 70(4): 617-623. [11]. Mark K, Fung , Kathy T. Mordarski , Sharon A. Bader , Ann M. Gronowski. Evaluation of the Wampole Laboratories ELISA-based assay for Epstein–Barr 46 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 virus serology. [J] Clinica Chimica Acta 319 (2002) 43–48. [12]. Herry H, Carol J, Kristin M et al. A Prospective Clinical Study of Epstein- Barr Virus and Host Interactions during Acute Infectious Mononucleosis. [J]. JID. 2005; 192: 1505-1512. [13]. Hilary Williams, Karen Macsween, Kare McAulay et al.Analysis of Immune Activation and Clinical Events in Acute Infectious Mononucleosis. [J]. JID. 2004; 190(1): 63-71. [14].胡亚美，江载芳主编。诸福棠实用儿科学[M]。第七版。北京:人民卫生出 版社，2003,822-825。 [15]. Kimura H, Hoshino Y, Hara S, et al.Viral load in Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic syndrome. [J]. Microbiol Immunol, 2002, 46(8): 579-582. [16]. Kasahara Y,Yachie A. Cell type specific infection of Epstein-Barr virus(EBV) in EBV-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis and chronic active EBV infection. [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2002; 44(3): 283-294. [17]. Ming-Han Tsai, Chih-Yi Hsu, Meng-Hsiu Yen, et al. Epstein-Barr viral asso -ciated infectious mononucleosis and risk factor analysis for complications in hospitalized children. [J]. Microbiol Immunol Infect. 2005; 38: 255-261. [18]. Henter JI, Horne A, Arico M, et al. HLH-2004: Diagnostic and therapeutic guidelines for hemophagocytic lymphohistiocytosis. [J]. Pediatr Blood Cancer. 2007; 46(2): 124-131. [19]. Peter J, Ray CG. Infectious mononucleosis. [J]. Pediatr. 1998; 19: 276-279. [20]. Tsai MH, Hsu CY, Yen MH, et al. Epstein-Barr virus-associated infectious mono -nucleosis and risk factor analysis for complications in hospitalized children. [J]. J Miocrobiol Immunol Infect. 2005; 38(4): 255-261. [21]. Tsurumi, T, M. Fujita, A .Kudoh. Latent and lytic Epstein-Barr virus replication stategies. [J]. Virol. 2005, 15:3-15. [22]. Lahtinen M, Koskela P, Ogmundsdottir H M, et al. Maternal herpesvirus 47 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 infections and risk of acute lymphoblastic leukemia in the offspring. [J]. Am J Epidemiol. 2003; 158(3): 207-213. [23]. Margaret L, Gulley Weihhua Tang. Laboratory.Assays For Epstein-barr Virus- Related Disease. [J]. Molecular Diagnostics. 2008; 10(4): 279-292. [24]. Denis J, Scott R, Sharon L, et al. The immunology of Epstein-barr virus infect. [J]. The Royal Society. 2001; 356:475-488. [25] .C. Creput. L. Galicier. S. Buyse. Understanding organ dysfunction in hemo phag -ocytic lymphohistiocytosis. [J]. Intensive Care Med. 2008; 34: 1177 -1187. [26]. Bauer CC, Aberle SW, Popow-Kraupp T, et al.Serum Epstein-Barr Virus DNA Load in primary Epstein-Barr virus infection. [J]. Journal of Medical Virology. 2005; 75(1): 54-58. [27]. Robertson P, Beynon S, Whybin R, et al. Measurement of EBV-IgG anti-VCA avidity aids the early and reliable diagnosis of primary EBV infection. [J]. J Med Virol. 2003; 70(4): 617-623. [28]. Pitett, RD, Laus S, Wadowsky RM, et al. Clinical evaluation of a quantitative real time polymerase chain reaction assay for diagnosis of primary Epstein-Barr virus infection in children. [J]. Pediatr Infect Dis J. 2003; 22(8): 736-739. [29]. Berger C, Day P, Meier G, et al. Dynamics of Epstein-Barr virus DNA levels in serum during EBV-associated disease. [J]. J Med Virol. 2001; 64(4):501-512. [30]. Fietta P, Manganelli P. The hemophagocytic syndrome(macrophage activation syndrome. [J]. Minerva Med. 2003; 94(1): 19-27. [31]. Chuang HC, Lay JD, Hsieh WC, et al. Epstein-Barr virua LMP1 inhibits the expression of SAP gene and upregulates Th1 cytokines in the pathogenesis of hemophagocytic syndrome. [J]. Blood. 2005; 106(9): 3090-3096. [32]. Ma, C S. Nichols, K. E, Tangye, S. G. Regulation of cellolar and humoral immune responses by the SLAM and SAP families of molecules. [J]. Immonol. 2007; 25.337. 48 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 [33]. Cannons, J. L., Qi, H, et al.Optimal germinal center responses require a multistage Tcell: B Cell a adhesion process involving integrins, SLAM- associated protein and CD84. [J]. Immunity. 2010, 32, 253. [34]. Lewis J, Eiben LJ, et al. Distinct interactions of the X-linked lymphopro -liferative syndrome gene product SAP with cytoplasmic domains of members of the CD2 receptor family. [J]. Clin Immunol. 2001, 100: 15-23. [35]. Latour S, Gish G, et al. Regulation of SLAM-mediated ignal transduction by SAP , the X-linked lymphoproliferative gene product. [J]. Nat Immunol. 2001; 2: 681-690. [36]. Tangye SG, Phillips JH, Lanier LL, et al. Functional requirement for SAP in 2B4 -mediated activation of human natural killer cells as revealed by the X-linked lymphoproliferative syndrome. [J]. Immunol, 2000, 165: 2932-2936. [37]. Streetz K, Leifeld L, Grundmann D, et al . Tumor necrosis factor alpha in the pathogenesis of human and murine fulminant hepatic failure. [J]. Gastro- enterology. 2000; 119(2): 446-460. [38]. Kasahara Y, Yachie A. Cell type specific infection of Epstein-Barr virus(EBV) in EBV-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis and chronic active EBV infection. [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2002; 44(3): 283-294. [39]. Imashuku S. Clinical features and treatment strategies of Epstein-Barr virus- associated hemophagocytic lymphohistiocytosis. [J]. Crit Rev Oncol Hemat. 2002; 44: 259-272. [40]. Kimura H, Hoshino Y, Hara S, et al .Viral load in Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic syndrome. [J]. Microbiol Immunol .2002; 46: 579-582. [41]. Jan A. W, Corinne M. P, Ann C. T. M, et al. Epstein-Barr Viral Load Assessment in immunocompetent Patients With Fulminant Infectious Mononucleosis. [J]. Archintern Med. 2002; 162: 837-839. [42].郭霞，李强，周晨燕，等.儿科传染性单核细胞增多症并发 EB病毒相关性 49 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 噬血细胞综合征临床危险因素分析。中华儿科杂志; 2008; 46(1):69-73。 [43]. Allen CE, Yu X, Kozinetz CA, et al. Highly elevated ferritin levels and the diagnosis of hemophagocytic lymphohistiocytosis. [J]. Pediatr Blood Cancer. 2008; 16:1379-1382 . [44]. Kimura H, Hoshino Y, Kanegane H, et al.Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infectious. [J]. Blood, 2001; 98: 280-286. [45]. Epstein-Barr virus-associated hemophagocytic lymphohistiocytosis:a restro- spective study of 78 pediatric cases in mainland of China. [J]. Chin Med J. 2010; 123(11): 1426-1430. [46]. Fisman D N. Hemophagocytic syndromes and infection. [J]. Emerg Infect Dis. 2000, 6: 601-608. 50 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 综述 EB病毒的生物学特征和原发感染后的相关疾病 【摘要】EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)为嗜 B淋巴细胞疱疹病毒，在人群 中普遍易感，全世界超过 95%的人感染过 EBV。我国是 EBV感染高流行的国家， 10岁时儿童血清 EBV阳性转化率达 100%。EBV感染可引起全身各系统、器官 的疾病，儿童中以非肿瘤性的 EBV相关疾病较多见，传染性单核细胞增多症 (infectious mononucleosis，IM)，慢性活动性 EBV感染(chronic active Epstein-Barr virus infection，CAEBV)和 EBV相关噬血细胞性淋巴组织细胞增生 症(EBV-associated hemophagocytic syndrome，EBV-AHS)。现就 EBV感染的生 【关键词】EB病毒;原发感染;传染性单核细胞增多症;噬血细胞增多症，慢 物学特征和原发感染后性活动性 EBV EBV感染。相关疾病研究进展作一综述。 Epstein-barr virus(EBV)是 1964年由 Epstein和 Barr通过培 养非洲儿童 Burkitt淋巴瘤细胞，并在培养的细胞涂片中用电镜观察到的疱疹病毒颗粒[1]。 EBV为双链 DNA病毒，是一种嗜人 B淋巴细胞病毒，属于疱疹病毒γ亚科家族 中的一员。该病毒在人群中普遍易感，研究表明，全世界超过 95%的人感染过 EBV[2]。EBV原发感染后，机体能够产生特异性的免疫反应，大部分患者预后良 好仅表现无症状的血清学转换，其中 50%可发展为 IM[2]，甚至一些危及生命的 疾病。在亚洲国家，特别是日本报道慢性活动性 EBV感染(chronic active Epstein-Barr virus infection CAEBV)，EBV相关性噬血细胞淋巴细胞增生症 (EBV-associated hemophagocytic syndrome，EBV-AHS)较多见，而西方国家 有关 EBV与慢性疲劳综合征的研究报道较多。 51 EBV有两种亚型，其 EBV核抗原(epstein barr virus nuclear antigen，EBNA) 基因位点:EBNA2，-3A，-3B和-3C有所不同，西半球和东南亚以 1型多见， 非洲 1、2型均常见。 EBV可以感染 B淋巴细胞、EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 上皮细胞、平滑肌细胞、T 细胞、NK细胞以及浆细胞[3]。与其它γ疱疹病毒一样，EBV能够在 B细胞内一、EB病毒感染后的生物学特性 建 立终身潜伏场所。原发感染时，唾液中游离的 EBV通过病毒包膜糖蛋白 gp350/220与 B细胞表面蛋白分子受体 CD21结合感染口咽部的幼稚 B淋巴细胞。 原发 EBV感染后在免疫力正常的个体 EBV特异的细胞毒 T淋巴细胞(CTL)和 NK细胞能够控制病毒转化的 B细胞。EBV原发感染后大部分患儿无症状，少 数可表现为具有典型临床表现的传染性单核细胞增多症 ( infectious mononucleosis，IM)，当出现 EBV特异性免疫功能后症状即可缓解，之后病毒 在 B细胞中建立潜伏感染，在疾病的恢复期大约有万分之一到十万分之一的 B 细胞被 EBV感染[4]，被感染的 B细胞开始潜在的增殖转化，由幼稚 B细胞转化 成增殖型母细胞。潜伏于 B淋巴细胞中的 EBV不能自我复制，随宿主细胞周期 复制而复制，感染者终生携带此病毒[5]。原发感染时 EBV也能感染口咽部的上 皮细胞，上皮细胞缺乏 CD21，EBV通过 BMRF-2蛋白、Gh/gl包膜蛋白分别与 β1整合素和ανβ6/8相互作用，开始了EBV感染上皮细胞的过程[6]。 EBV在体内有两种感染形式:裂解感染和潜伏感染。在裂解期表达即刻早 期基因(IE)BZLF1、BRLF1，早期基因(E)BNLF2a和晚期基因(L)BCRF1[7]。 即刻早期基因产物是病毒进入裂解复制的转化活化因子，其在病毒由潜伏阶段 进入裂解复制或再激活以及病毒的传播中起着重要作用，早期基因产物在病毒复 制、代谢以及阻止抗原提呈方面起作用，晚期基因产物主要起免疫逃逸作用。潜 伏感染时表达 6种核蛋白(EBNA1、2、3A、3B、3C和 LP)、3种膜蛋白(LMP1、 2A和 2B)、两种小的非聚腺苷酰化 RNA(EBERs)和 Bamh1A。EBV潜伏感染 B细胞后的一个重要后果是可以诱导细胞增殖，促使 B细胞分化为记忆 B EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 肿瘤，如鼻咽癌、伯基特淋巴瘤、移植后淋巴细胞增殖性疾病、自然杀伤细胞淋 巴瘤及胃癌等。根据 EBV潜伏基因表达情况将其相关疾病分为四型，(见表 1)。 虽然 EBV的潜伏感染大致分为这四种类型，但这种分型并不十分严谨，在同个 个体甚至同一组织的不同细胞亚型其病毒基因表达是有差异的。例如:IM中 EBV感染转化的 B淋巴细胞属于潜伏?型，而浆细胞和上皮细胞处于裂解感染， 并能够释放游离 EBV;而鼻咽癌的患者，只有少数细胞处于裂解复制阶段，大 部分的鼻咽癌细胞处于潜伏?型[4]。 表 1:EBV潜伏感染类 型 EBNA1 EBNA2 EBNA3s LMP1 LMP2 BARTs EBERs 潜伏感染类型 疾病 0型 , , , , , ? ， HL ， , , , , ， ， ?型 BL ， , , ， ， ， ， ?型 HD,CAEBV,NPC ， ， ， ， ， ， ， IM,LPD ?型 注:HL健康携带者，BL:Burkitt淋巴瘤，HD:霍奇金淋巴瘤，CAEBV:慢 性活动性 EBV感染，NPC鼻咽癌，IM传染性单核细胞增多症，LPD淋巴细胞 增值性疾病。 二、EB病毒感染后机体的免疫功能 EBV原发感染后可诱发机体的体液免疫反应和细胞免疫反应。体液免疫反 应所产生的 EBV特异性抗体是诊断 IM的标准之一，细胞免疫反应(主要是 CD8+T淋巴细胞)针对 EBV潜伏期和裂解期抗原产生特异性 CTL，对控制病毒 复制至关重要，并且与 IM的严重程度相关。恢复期仅少数抗原特异的记忆 T细 通常我们通过免疫荧光的方法检测血清中 EBV抗原特异性抗体滴度反映机 体对胞在体内潜伏下来，随血液循环。当 EBV感染后的体液免疫反应情况。这些抗原包括病毒衣壳抗原( EBV再次增殖复制时，记忆 viral capsidT细胞迅速 进 53 入活化状态并大量增殖，产生有效的免疫应答消除病毒。 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 antigen，VCA)、EBNA，裂解早期抗原(early antigen，EA)以及膜抗原(membrane antigen，MA，gp350/200和 gp85)。一般来说，抗 VCA-IgM在原发感染后的 4~7天出现，3-4周达到峰值，之后迅速减少，12周后基本消失[8]，然而少数患 者感染后的 6个月仍可存在[9]。抗 VCA-IgG与 IgM同时出现，达到峰值后缓慢 减少，并持续存在。抗 EBNA-IgG于 4-6周后出现并持续终生。EA分为 D成分 和 R成分[10]，抗 EA-D阳性表示急性感染，抗 EA-R抗体出现在感染的恢复期， 并持续多年存在[11]。临床上通过检测血清中EBV抗体谱来反映EBV的感染情况， EBNA分为未感染、急性感染、亚急性感染和既往感染(见表-1-IgG的出现是机体对病毒原发感染后的延迟的体液免疫反应 [12] 2)。一般。 表 2:EBV感染后抗体谱表现 我们认为抗 EBNA-1-IgG是 IM急性感染后进入恢复期的标志物，但 Barbara CameronVCA-IgM EA-D EA-R VCA-IgG EBNA-IgG 等人通 未感染 , , , , , 过动态观察 IM长病程与预后良好两组血清中 EBV特异性抗体滴度的动态变， , ，/, , 急性感染 ，/, 化， 亚急性感染 ，/, ， ， ， ，/, 发现前者较后者抗 EBNA-1-IgG出现更早且抗体滴度更高，既往感染 , , , ， ， 因此认为抗 细胞免疫反应在控制 EBV感染中起关键作用，特别是 CD8，CTL， 如在 IM 9 患者循环和组织中淋巴细胞增多可达15×10/L，其中激活表型的CD8细胞占60% ， 以上[13]。研究表明，急性IM患者EBV特异CD8 的变化呈正相关，随着病毒负载量的减少EBV特异的CD8，CTL细胞的数量逐渐 CTL与外周血中EBV-DNA负载量 减少[14]。EBV原发感染后CTL对病毒的裂解肽和潜伏肽的反应不一样，对不同裂 解期肽反应也是不同的。EBV急性感染期间主要针对裂解肽起免疫反应，主要 是即刻早期抗原和早期抗原，而对晚期抗原肽反应很弱 。有人利用酶联免疫 [15] 吸附斑点法(ELISPOT)检测到裂解肽即刻早期抗原(BZLF1和 BRLF1)、早期 54 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 抗原 BMLF1特异性 CD8，CTL具有很强的分泌γ干扰素的反应[12]。Precopio 等人研究 EBV即刻早期抗原 BRLF1特异性杀伤 T细胞(CTLIE)早期抗原 BMLF1 特异性杀伤 T细胞(CTLEA)变化趋势，发现 CTLIE的反应呈下降趋势，在症状 ， Lat的减少而减少，与 CTLEA无关[5]。且即刻早期抗原特异性 着 MbCTL与 出现后 40d与 CTLEA水平相当，CTLEA始终维持较低的水平，且 CD8 EBV外周血中感染的记 EBV 拷贝数的变化相关，而裂解期早期抗原、潜伏期抗原特异性的 ， CD8忆 B细胞(mBLat)的数量变化与 CTLIE的变化趋势呈相关性，CTLIE的呈的，但 CD4 T细胞在控制 EBV感染过程中也起着重要的辅助作用。同时数量随 CTL的变化趋势与之无关[5]。EBV绝大部分病毒肽是通过 它也 ， T细胞在维 MHC?经典途径递 ， 持 EBV感染后免疫反应和清除病毒感染细胞的平衡中起一定的作用[17] 。 具备杀伤功能，并且对抗原性很弱的 EBNA1也有一定功效[16]。CD4 三、儿童常见 EB病毒原发感染相关疾病 1、传染性单核细胞增多症 IM是儿童 EBV感染所致常见的自限性疾病。我国儿童 IM的 好发年龄是 学龄前期儿童，发达国家，青少年为高发人群，提示 EBV原发感染的年龄可能 与卫生条件有关。 IM被认为是一种免疫病理性疾病 disease)，EBV感染后抗原-趋化的 CD8 T淋巴细胞过度增殖，释放大量细胞因 ( Immunopathological ， 子主要是Th1型，如:IFN-Υ，IL-2等引起临床症状[18]。因此 IM患儿存在病 毒感染对机体的直接损害，同时也有因病毒感染后引起免疫反应对机体产生的 免疫损伤。IM的主要临床表现包括发热、咽峡炎、颈部淋巴结肿大、肝脾肿大， 其中发热、咽峡炎和颈部淋巴结肿大为 IM三联征。但其症状的严重性及持续 时间有很大差别，大部分预后良好，少数可发生并发症。IM患儿中有 25-50% 可有血液系统并发症包括溶血性贫血、血小板减少、血小板减少性紫癜等;1-5% 可有神经系统并发症包括格林巴利综合症、横贯性脊髓炎、周围神经炎等;其 他少见但是威胁生命的并发症包括脾破裂(0.5-1%)，上呼吸道阻塞(1%)[2]。 55 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 IM诊断标准[19] : ?(临床表现:发热、咽峡炎、淋巴结肿大、皮疹、肝脾肿大; ?(外周血白细胞分类以淋巴细胞为主,异形淋巴细胞百分比,10%; ?(EBV感染依据:EB病毒衣壳抗原抗体(EBV-CA-IgM)阳性。 具备诊断标准?中任意 3条，并同时具备?，有或无?，可诊断 IM。 IM虽然是一种自限性疾病，通过临床症状和血清学即能诊断，但血清或血 浆中 EBV-DNA负载量与疾病的严重程度相关[20 21] 。研究表明极少数原发 EBV ， 感染患儿可发展成危及生命的噬血细胞综合征，在这些 EBV-AHS患儿外周血 中可检测出很高的 EBV-DNA负载量，指出血清中 EBV-DNA负载量, 10噬血性淋巴组织细胞增生症(6copies/ml(比普通 IM高hemophagocytic lymphohistiocytosis 2个数量级)提示病情恶化或出现严重并发症，，HLH)[22] 。 Teramura如: 等[23]也报道 HLH患者外周血中 EBV-DNA拷贝数显著高于 IM患者， 且与临床症状及各种生化指标如乳酸脱氢酶(LDH)、血清铁蛋白、可溶性白 介素-2受体(SIL-2R)及β 2微球蛋白呈正比。虽然仅仅通过检测外周血中 EBV-DNA负载量不能简单地区别 IM和 HLH，但通过监测原发 EBV感染患儿 2、EB病毒相关性噬血细胞淋巴组织增生症 血清或血浆中游离 EBV-DNA的负载量，对于了解其转归，特别是早期发现有 EBV感染在极少数患儿可发展为 HLH。HLH是由多种原因造成 无病情恶化，疗效判断方面具有重要作用。 NK细胞 和 T细胞功能缺陷，引起大量炎症细胞因子释放，造成机体巨噬细胞活化，机 体脏器、组织损伤的一组临床综合征。其临床表现具有特征性，但缺乏特异性。 主要表现为持续发热，全血细胞减少，肝、脾大，骨髓、淋巴结等组织可见吞 噬血细胞现象;淋巴结肿大、黄疸、中枢神经系症状:抽搐或神经瘫痪也常发 生。多种原因可以引起 HLH:感染、遗传因素、肿瘤、自身免疫系统疾病等。 先天性 HLH可分为两类:一类为家族性 HLH(FHLH),常有穿孔素基因(PRF、 UNC13D、STX11等基因突变;一类为免疫缺陷疾病如先天性白细胞颗粒异常 综合征(CHS)、格里塞利综合征(GS)、X性联淋巴增殖综合征(XLP)分 56 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 别有 RAB27A、LYST、SH2D1A基因缺陷。后天性 HLH常以感染多见，包括病 毒、细菌、真菌、寄生虫都可以诱发，但以 EBV感染最为常见[24] 。无论是先 天性还是后天性 HLH，EBV是最常见的触发因素。HLH的预后与潜在病因密 切相关，非 EBV感染所致 HLH，60-70%随原发病治愈而缓解，而未经治EBV疗的- AHS常常是致命的，尤其 EBV-DNA定量持续增高者[25] 。 与 IM患儿 EBV主要感染 B细胞不同，EBV-AHS中 EBV主要感染 T/NK 淋巴细胞，使 CTL和 NK细胞失去了清除 EBV感染淋巴细胞的能力，导致淋 巴细胞大量增殖、活化，引起大量细胞因子释放及级联放大反应，诱发其吞噬 血细胞，造成组织细胞免疫损伤，引起各种临床症状，如:IFN-γ可引起胆汁 淤积和低蛋白血症;IL-1β可激活纤溶酶原、激活?因子，引起低纤维蛋白血 症，并可引起血清铁蛋白增高，TNF-α抑制脂蛋白酶活性，引起高甘油三脂血 症等。有研究表明，在某些无 SAP/SH2D1A基因突变的散发性 HLH中，EBV 因子血症和吞噬血细胞作用[26] 。 LMP1可以在转录水平上抑制 T细胞表达 SAP，并激活其下游分子 EBV-AHS诊断标准[27,28] : ERK和 IFN- ?.临床和实验室标准(以下 8条标准中符合 γ,导致 T细胞异常活化，释放大量炎症因子，激活巨噬细胞，从而导致高细胞 5条) a发热 b脾大 c血细胞减少?2项:Hb,90g/L(婴儿,4周:Hb,100g/L);PLT,100 ×10/L;ANC,1×10/L 9 9 d高甘油三脂血症和或低纤维蛋白原:空腹三酰甘油? 3mmol/L，纤维蛋 白原?1.5g/L e铁蛋白?500ug/L f sCD25?2400U/ml g NK细胞活性减少和缺乏 h骨髓、脑脊液、淋巴结内噬血现象 57 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 ?.EBV感染的证据:血清、血浆、骨髓及其它病理标本中 EBV-DNA阳性或抗 EBV-VCA-IgM阳性。 EBV-HLH诊断必须找到 EBV感染的证据，临床通常通过血清学检测了解 有无 EBV感染，但检测全血、血清/血浆中 EBV基因组相比血清学检测更有意 义。Teramura等观察到[23]，对 EBV-HLH化疗过程中，监测外周血中 EBV-DNA 拷贝数，如果治疗 4个月后仍能检测到或反而增加，应更改有效的化疗方案或行 造血干细胞移植(SCT)，并且观察 4例行 SCT后基因拷贝数转阴。因此，测 3、慢性活动性 EB病毒感染 定游离 EBV基因与 HLH活动度有很好的相关性，了解疾病的严重性，并且EBV原发感染后，在少数具有免疫力的个体，可出现慢性或复发性 IM样 可以症状，伴随有 EBV抗体滴度的异常改变，称为 CAEBV。在目前报道中，评估疗效(尤其初始CAEBV 4周的治疗)及预后。 在以日本为首的亚洲国家多见，西方国家少见，且日本患者相对西方国家患者 病情重，此种差异是否与环境、种族及不同地区 EBV变异等因素有关，目前尚 不清楚。 EBV原发感染后，在口咽部上皮细胞内发生裂解性感染，病毒 DNA呈线 性自我复制，随着 EBV特异性免疫功能的建立，病毒基因由裂解感染时的线性 环化成附加体，不再进行自我复制，随着细胞周期的复制而复制。从急性的原 发感染进入潜伏感染时，与裂解感染相关抗体抗 EA-IgG、抗 VCA-IgG抗体滴 度逐渐下降，与潜伏感染相关抗体抗 EBNA-IgG开始出现，且抗 VCA-IgG及 抗 EBNA-IgG维持较低的水平[29]。而在 CAEBV的患者中，EA-IgG和 VCA-IgG 的抗体滴度均升高，而 EBNA-IgG抗体滴度很低或者测不到，提示 CAEBV发 拷贝数明显升高，提示其存在病毒的大量复制[30,31] 病机制可能与 EBV不能由裂解感染进入潜伏感染或者由潜伏感染又进入裂解 。 感染有关[29,30]。且通过荧光定量 PCR(fluorogrnic quantitative PCR，FQ-PCR检 根据外周血 EBV感染细胞的主要类型，CAEBV可以分为 T细胞 型、NK 测外周血单个核细胞或者血浆中的 EBV-DNA负载量发现 CAEBV患58 者的病毒 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 细胞型、B细胞型和混合细胞型，以前两型为主[30,31]。T细胞型主要表现为发 热、贫血、肝大、淋巴结肿大、EBV相关抗体滴度升高;NK细胞型主要表现 为蚊虫过敏及相应的皮肤损害，骨髓或者外周血中可见大颗粒样异常淋巴细胞 增多及 IgE升高。两型均可发展为 T/NK细胞淋巴异常增殖性疾病。 CAEBV诊断标准(NIH标准)[32] : 需同时满足每一项中的至少一点。?下列情况持续 6个月以上:EBV原发感 染症状一直持续，包括(发热、淋巴结肿大、肝脾大、肝功能异常);EBV抗 体滴度异常(抗 VCA-IgG?1:5120，抗EA-IgG?1:640或者抗EBNA-IgG,1:2)。 ?主要器官受累证据:淋巴结炎、噬血表现、脑膜脑炎、持续型肝炎、脾大、 间质性肺炎、骨髓增生不良、视网膜炎等。?证实受损组织或外周血 EBV数 量增多;受损组织中 EBV-DNA、RNA或蛋白增多;外周血 EBV-DNA水平增 多,102.5copies/ugDNA。?排除任何免疫缺陷，包括 HIV感染。考虑部分 CAEBV 患者不伴抗体滴度升高，为了提高敏感性，日本学者 Ocano等根据日本相关病 例相关经验，提出推荐EBV抗体滴度异常增高是诊断 CAEBV诊断标准。与 CAEBV 的指标之一，但NIH不同的是，该标准建议降 通过 Kimura等[33] 低 大量临床研究发现，即使部分严重 CAEBV患者也缺乏 EBV抗体的异常增高， EBV抗体滴度标准，其中 VCA-IgG?1:640,EA-IgG?1:160。 而用 FQ-PCR检测外周血 EBV-DNA负载量，CAEBV患者均升高，且与疾病的 严重度和死亡率呈正相关。有研究表明大部分 CAEBV患者 PBMCs中 EBV/DNA 血浆中游离病毒负载量对评估器官损害情况及预后有重要价值。 ,102.5Copies/ug，且血浆中高EBV/DNA负载量与疾病恶化相关。因此检测外周 EBV原发感染疾病表现多样，大部分预后良好，极少数可发展为病情重且 血中病毒载量或病毒载量联合抗体滴度对 CAEBV诊断更有意义，且通过监测 威胁生命的疾病如:HLH，CAEBV。在这些患者特别是无基因缺陷的散发 HLH 其机体的免疫力和病毒之间的相互作用并不十分清楚。无论是先天性还是后天 性 HLH，EBV都是最常见的触发因素，且 EBV感染所致 HLH病情重，预后 差，未经治疗的 EBV-HLH常常是致命的，其原因还需要我们进一步研究探讨。 59 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 参考文献 [1]. Epstein, M. A, B. G. Achong, Y. M. Barr.Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt’s lymphoma. [J]. Lancet. 1964, 702-703. [2]. Katherine, Luzuriaga, M. D. John, L. Sullivan, M. D. InfectiousMononucleosis. [J]. NEJM. 2010, 362, 21: 1993-2000. [3]. Margaret L, Gulley Weihhua Tang Laboratory. Assays For Epstein-barr Virus- Related Disease. [J]. Molecular Diagnostics. 2008; 10(4): 279-292. [4]. Hiroshi Kimura, Yoshinori Ito et al. Mesuring Epstein-Barr virus(EBV) load:the significance and application for each EBV-associated disease. [J]. Virol. 2008; 28: 305-319. [5]. Hadinoto V, Shapiro M, et al .On the dynamics of acute EBV infection and the pathogenesis of infectious mononucleosis. [J]. Blood, 2008, 111(3): 1420-1407. [6]. Chesnokova, L. S, S. L. Nishimura, L, et al. Fusion of epithelial cells by Epstein-Barr virus proteins is triggered by binding of viral glycoproteins gHgL to integrins alphavbeta 6 or alphavbeta8. Proc. Natl. Acad. Sic. U.S.A. 2009, 106: 20464-20469. [7]. Tsurumi, T, M. Fujita, A. Kudoh. Latent and lytic Epstein-Barr virus replication stategies. [J]. Virol. 2005, 15: 3-15. [8]. Thomas B. Martins MS, et al. Evaluation of a Multiplex Fuorescent Microsphere Immunoassay for then Determination of Epstein-Barr virus Serologic Status. [J]. Clin pathol. 2008, 129: 34-41. [9]. Thomas D, et al.A Systematic study of epstein-barr virus serologic assays follow -ing acyte infection. [J]. Clin Pathol. 2002, 117: 156-161. [10]. Mark K. Fung, Kathy T, et al. Evaluation of the Wampole Laboratories ELISA- based assay for Epstein-Barr virus serology. [J]. Clinica Chinica Acta. 2002, 139: 43-48. [11]. Storch GA. Diagnostic virology. [J]. Clin Infect Dis. 2000. 60 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 [12]. Barbara Cameron, Mandvi Bharadwaj, et al. Prolonged Illness after Infectious Mononucleosis Is Associated WITH Altered Immunity but Not with Increasea Viral Load. [J]. JID. 2006, 193(1): 664-671. [13]. Dorothy H. Crawford. Biology and disease associations of Epstein-barr virus. [J]. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 2001, 56: 461-473. [14].Yo Hoshino, Kazuo Nishikawa, et al. Kinetics of Epstein-Barr virus load and virus -specific CD8 T cell in acute infectious mononucleosis. [J]. ELSEVIER. + 2011; 50: 244-246. [15]. Martin Rowe.Jianmin Zuo.Immune responses to Epstein-Barr virus:molecular interactions in the virus evasion of CD8 T cell immunity. [J]. Elsevier. 2010; 12: ， 173-181. [16]. Macarthur GJ, Wilson AD, et al. Primary CD4 T-Cell Responses Provide both ， Helper and Cytotoxic Functions during Epstein-Barr Virus Infection and Trans -formation of Fetal Cord Blood B Cell. [J]. Virol, 2007, 81(9): 4766-4775. [17]. Heller KN, Arrey F. et al. Patients with Epstein Barr virus-positive lymphomas have decreased CD4(，) T-cell responses to the viral nuclear anyigen. [J]. Cancer, 2008, 123(12): 2824-2831. [18]. Hilary Williams, Karen Macsween, et al. Analysis of Immune Activation and Clinical Events in Acute Infectious Mononucleosis. [J]. JID. 2004, 190(1): 63 -71. [19]. Ming-Han Tsai, Chih-Yi Hsu, et al. Epstein-Barr virus-associated infectious mononucleosis and risk factor analysis for complications in hospitalized children. [J]. Microbiol Immunol Infect. 2005; 38; 255-261. [20]. Balfour HH Jr, Holman CJ, Hokanson KM, et al.A prospective clinical study of Epstein-Barr virus and host interactions during acute infectious mononucleosis. [J]. Infect Dis. 2005; 192: 1505-1512. [21]. Kimura H, Nishikawa K, Hoshino Y, et al. Monitoring of cell-free viral DNA in 61 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 primary Epstein-Barr Virus infection. [J]. Med Microbiol Immunol.2000 ;188: 197-202. [22]. Jan A. M, Corinne M. P. , Ann C. T. et al. Epstein-Barr Viral Load Assessment in Immunocompetent Patients With Fulminant Infectious Monoucleosis. [J]. Archintern med. 2002; 162: 837-839. [23]. Thramura T, Tabata Y, Yagi T, et al. Quantitative analysis of cell-free Epstein- Barr Virus genome copy number in patients with EBV-associated hemophago -cytic. Lymphohistiocytosis. [J]. Leuk Lymphoma. 2002, 43: 173-179. [24]. Ishii E, Ohga S, Imashuku S, et al. Nationwide survey of hemophagocytic lymph -ohistiocytosis in Japan.[J]. Int J Hematol, 2007; 86(1). [25]. Kimura H, Hoshino Y, Hara S et al. Viral load in Epstein-Barr virus-associated Hemophagocytic syndrome. [J] .Microbiol Immunol. 2002; 46: 576-582. [26]. Huai-Chia Chuang, Jong-Ding Lay, Wen-Chuan Hsieh, et al. Epstein-Barr virus LMP1 inhibits the expression of SAP gene and upregulates Th1 cytokines in the pathogenesis of hemophagocytic syndrome. [J]. Blood. 2005, 106(9): 3090- 3095. [27]. Jan-lnge Henter, AnnaCarin Horne, Maurizio Arico, et al. HLH-2004:Diagnostic and TherapeutIc Guidelines for Hemophagocytic Lymphohistiocytosis. [J]. Pediatr Blood Cancer . 2007; 48: 124-137. [28]. Imashuku S. Clinical features and treatment strategies of Epstein-Barr virus -associated hemophagocytic lymphohistiocytosis. [J]. Crit Rev Oncol Hematol . 2002; 44: 259-272. [29]. Okan M. Overview and problemayic atandpoints sever chronic active epstein- barr virus infection syndrome. [J]. Crit Rev Oncol Hematol. 2002; 44: 273-282. [30]. Kimura H, Hoshino Y, et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active epstein-barr virus infection. [J]. Blood. 2002; 98: 280-286. [31]. Kimura H, Hoshino Y, Hara S, et al. Differences between Tcelltype and killer 62 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 cell-type chronic Active Epstein-Barr virus infection. [J]. Infect Dis. 2005; 181(4): 531-539. [32]. NIH. Active accrual protocols recruiting new patients. [J]. Clincal research studies. [EB/OL]. 02-1-0147. [33]. Kimura H, Hoshino Y, Kanegane H, et al. Clinical and virologic characteristics of chronic active Epstein-Barr virus infection. [J]. Blood, 2001, 98: 280-286. 63 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 攻读学位期间公开发表的论文 儿童 EB病毒感染及传染性单核细胞增多症临床特点和实验室检查分析。中国实 用儿科杂志。 64 EB病毒感染相关 IM和 HLH的临床研究和病 毒感染特征 致谢 本论文是在陈福雄教授的悉心指导下完成的。感谢陈福雄教授、赖永洪教授 三年来在学习、工作上的悉心指导以及生活上的亲切关心。导师的知识渊博、治 学严谨、正直谦逊、待人以善的处世态度深深影响着我，这种精神引导将使我受 益终身～ 同时衷心感谢吴梓梁教授对我的关怀，鼓励和悉心指导。他渊博的临床知识， 高尚的医德医风，严谨的治学态度，对事业的执着追求是我终身学习的榜样～ 感谢儿科的邹亚伟教授、关镜明书记、陈德辉主任、黄穗主任、卢成瑜主任 等医生和护士在临床学习等各个方面给予的指导和帮助～ 感谢广州医学院第一附属医院儿科血液肿瘤研究室卢慧敏老师以及呼吸病 研究所病毒室杨子峰老师、任幽兰老师在实验技术方面给予的指导和帮助～ 感谢曾意茹、李敏敏、杨清清、陈燕丽等同学及师兄吴泽霖、师姐吴丽萍、 李华梅在生活和学习上的帮助～ 感谢我的家人及朋友给予我的默默支持和无私付出，无以言表，感怀于心～ 65