1．正常值：白蛋白5

1．正常值：白蛋白5 1(正常值:白蛋白57-72, α1球蛋白2-5, α2球蛋白4-9, β球蛋白6(5-12, γ球蛋白12-20, 2(肝硬化时白蛋白显著降低，γ球蛋白升高2-3倍，肾病综合症时白蛋白降低α2和β球蛋白升高。 思考题 1(血清蛋白在醋酸纤维薄膜上可分成5-7条区带，每条区带是否分别只代表一种蛋白质? 2(用什么方法可证明醋酸纤维薄膜有无电渗作用? 3(电场强度愈高血清蛋白在醋酸纤维薄膜上的泳动率愈高，是否电场愈高愈好? (陆劲松 张怡平) 实验三 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳法分 离血红蛋白和细胞色素 原理 蛋白质分子是典型的两性电解质分子，它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子向电场正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正电荷的阳离子向电场负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。如果在一个pH梯度的环境中将含有各种不同等电点的蛋白质混合样品进行电泳，那末在电场作用下，不管这一大群混杂的蛋白质分子原始分布如何，各蛋白质分子将按照它们各自的等电点大小在pH梯度中相对应的位置进行聚焦。经过一定时间以后，不同的蛋白质组分便分隔在不同的区域之中，这种按等电点的大小在pH梯度某一相应位置进行聚焦的行为叫做"聚焦"。等电聚焦是一种特殊的电泳方法，其特殊之处就在于它利用了一种称之为西性电解质载体的物质在电场中构成连续的pH梯度，使蛋白质或具有其它两性电解质性质的样品进行聚焦从而达到离析目的。 所谓两性电解质载体，实际上是许多异构体和同系物的混合物，其化学本质都是多羧基多氨基脂肪族化合物，分子量在300-1000之间，商品名有"Ampholine"(瑞典LKB公司产品)、"Pharmalyte"(瑞典Pharmacia公司产品)等。它们在直流电场的作用下，能从正极到负极形成一个pH值逐渐升高的平滑连续的pH梯度。这种pH梯度的稳定程度如何，对两性电解质的聚焦影响极大。在聚焦过程中，扩散是一种起破坏作用的因素，特别是外加电场撤消以后，它能使两性电解质载体所构成的pH梯度遭到破坏，使因聚焦而被分离的样品组分又重新混合。要消除这一破坏因素需要加入抗对流的支持介质;最常用的抗对流支持介质是聚丙烯酰胺凝胶。 凝胶等电聚焦一般就是指用聚丙烯酰胺凝胶作抗对流支持介质的等电聚焦。这种电泳方法的特点是两性电解质载体因受直流电场作用而在凝胶柱或凝胶板内产生pH梯度:如果是在凝胶柱内产生pH梯度，那末当蛋白质样品电泳到达这种凝胶柱的某一部位，且此部位的pH值正好相当于该蛋白质等电点时便聚焦形成一条蛋白质区带。只要测得聚焦部位的pH值就可得知该蛋白质的等电点。 由于凝胶等电聚焦法消除了扩散作用的影响，延长电泳时间使所测物质更集中、区带更狭窄，因而提高了分辨率。这与一般电泳法因受扩散作用影响，随着电泳时间延长区带愈来愈宽的情况相比，是一个很大的优点。应用凝胶等电聚焦法不仅能测定两性电解质的等电点，而且能将具有不同等电点的混合物质进行分离或鉴定。 以聚丙烯酰胺作为支持物，Ampholine在支持物内形成稳定的pH梯度，当蛋白赁在电场 力的作用下，便会在支持物中运动到相当于自身pI值的pH梯度中聚合成一狭窄的区带而停留下来，因为Ampholine形成的pI梯度是一较平滑的稳定的pH梯度，所以从理论上讲，只要蛋白质的批相差0(01便可得到分离，血红蛋白的pI约在6.9左右、而细胞素色C的pI则在至0(5左右，两者的pI相差甚大、所以在等电聚焦电泳中，可以很好地得到分离。 操作 1(凝胶的制备 (1)取10×0(5cm(内径)的玻璃管，从一端量出7cm作标记，用胶布封底，插入插座，垂直放置。 (2)配制凝胶液 (3)用长滴管吸取制备好的凝胶液，沿玻璃管壁注入至7ml标记平面，缓缓注入，避免气泡。 (4)立即用5ml注射器配6.5号针头或5号10cm局麻针头沿玻璃管壁加入0(5cm高度的蒸馏水，加时贴近凝胶面，缓慢加入，尽量减少胶面与水相混，加蒸馏水的目的除隔离空气中的氧外，并能消除液柱表面的弯月面，使凝胶液面平坦，静置待聚合。 2(电泳 将已聚合的凝胶去除上层水层，垂直插入电泳槽中的橡皮管中，在电泳槽中上槽注入0(2, H2SO4或5,H3PO4，下槽注入0(4,乙醇胺或2,NaOH，加完电极液后，要仔细检查凝胶管上下口内有无气泡，如有气泡必须排除，否则影响导电，上槽接正极，下槽接负极，电压50V，预电泳30分钟，然后将电压维持在200V-300V，1-2小时结束，电泳结束后，取下玻璃管，观察结果，加以分析: 3(剥胶 用带有长针头(10cm长局麻针头)的注射器吸入蒸馏水，将针头插入胶与玻璃管壁之间，边旋转边注水，使针头慢慢螺旋式前进。靠水流压力和润滑作用将玻璃管内壁与凝胶分开，最后可用洗耳球在玻璃管的一端轻轻加压力，就可把凝胶从玻璃管内压出。凝胶盛于培养皿中。 4(样品pI测定。 (1)将所需测定的蛋白区带用刀片切下，置于含5ml蒸馏水的小烧杯中，经常搅拌，4小时后用pH计测其pI。 (2)直接用pH试纸插入所需测定的蛋白区带中，此法虽然十分方便，但较为粗略。 试剂及器材 1(电极缓冲液 上槽(阴极) 0(02mol,L NaOH 下槽(阳极) 0(01mol,L H3PO4 2(20,两性电解质(Ampholine) 3(血红蛋白和细胞色素C 4(30,丙烯酰胺凝胶贮备液 称取丙烯酰胺30(0克，N，N-亚甲基双丙烯酰胺0(8克，加蒸馏水至100ml，4?棕色瓶中保存。 5(10,过硫酸铵 6(1,TEMED 7(电泳装置 思考题 1(试比较聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳有何不同? 2(血红蛋白为何能在等电聚焦电泳中分成三条区带? 3(等电聚焦电泳具有极高的分辨率，所以它是鉴定蛋白质纯度绝对可信的方法。你认为 这种法对吗? (厉兴君 张怡平)