产淀粉酶细菌菌株分离

产淀粉酶细菌菌株分离 产 淀 粉 酶 芽 孢 杆 菌 的 筛 选 1 目的 了解产淀粉酶细菌的分离和纯化的原理，掌握常用的微生物分离、纯化方法 2 原理 从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。 微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。 土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。 3 材料 3.1 培养基 淀粉培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、氯化钠 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉0. 8% 。 3.2 溶液或试剂 盛9ml无菌水的试管，盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶,制霉菌素母液(抑制真菌)。 3.3 样品 土样 3.4仪器或其它用具 高压蒸汽灭菌锅、旋涡混合器、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种环、接种针、接种钩、滴管、恒温水浴装置等。 4实验流程 倒平板?制备梯度稀释液?涂布(或倾注法)?培养?挑单菌落?保存。 5步骤 准备工作: 摆好实验材料:将培养基、接种工具和其它用品全部在超净工作台上摆好。进行紫外线灭菌30min，关闭紫外灯，20-30min后打开照明灯，进行操作。接种前用酒精棉球将双手消毒。 5.1 稀释平板法 ? 倒平板 将淀粉培养基加热溶化待冷至55,60?时，混合均匀后分别倒平板，淀粉培养基倒六皿三皿用于稀释平板;三皿用于划线分离。 ? 制备土壤稀释液 选好采样地点，产去表层5cm，取5-15cm处。用无菌器具采样几十克，装入无菌的塑料袋或纸袋中扎好，记录采样时间、地点、采样环境等以备考证。采样后应尽快分离。 称取土样lg，放入盛99ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将锥形瓶加塞、包扎、摇匀(无菌室里)，利用恒温水浴装置80?左右水浴，水浴-1锅温度恒定后维持20min(制悬液时就应先开始加热)，制成10 g/ml的土壤悬液。用一支lml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌-2吸管从此试管中吸取lml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10、-3-4-5-610、10、10、10不同稀释度的土壤溶液。 ? 涂布 -4-5-6将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10、10和10三种稀度，然后用 -4-5-6无菌吸管分别由10、10和10 三管土壤稀释液中各吸取0.1或0.2ml，小心地滴在淀粉平板培养基表面中央位置。 用无菌涂布器涂布。右手拿无菌涂布器平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿同心圆方向轻轻地向外扩展，使之分布均匀。室温下静置5,l0min，使菌液浸入培养基。 ? 培养 平板倒置于37?培养箱中培养24h。取出培养好的平皿, 在长出的菌落上滴加碘液,菌落周围如有无色透明圈出现, 说明淀粉被水解,即该菌株能产生淀粉酶. 5.2画线分离 从稀释平板法所得的菌落中选择菌落周围透明圈和菌落直径之比值较大的菌落，进行划线分离。将划线分离后的培养皿放入37 ? 培养箱中培养 24 h ，在长出的菌落上滴加碘液,观察记录结果。 5.3 富集培养 在上一步划线分离所得培养基中挑选产酶活力较高的单个菌落，在斜面培养基上进行富集培养。将斜面培养基放入37 ? 培养箱中培养 24 h . 6结果与分析