生物仪器分析

生物仪器分析 张润锋 主要参考书目 • 《仪器分析》 大连理工大学出版社 • 《仪器分析导论》(第二版) 化学工业出版社 教学要求 • 掌握常用仪器分析的原理和仪器的简单结构; • 初步具有根据分析目的，结合学到的各种仪器分析方法的特点、应用范围，选择 适宜的分析方法的能力; • 选修课。 第一章 绪 论 • 什么是仪器分析 • 仪器分析方法的分类 • 仪器分析的发展概况 • 仪器分析的特点和局限性 • 分析仪器的性能指标 1. 什么是仪器分析 1.1 分析化学 是化学学科的一个重要分支，是研究物质的组成、含量、结构及其分析 方法的学科。 化学分析法;仪器分析法 1. 什么是仪器分析 1.2 化学分析法/经典分析法 以物质的化学反应为基础的一类分析方法 分类:重量分析法—绝对分析法 滴定分析法—相对分析法 (酸碱滴定，络合滴定，氧化还原滴定，沉淀滴定 ) 1. 什么是仪器分析 1.3 仪器分析 采用比较复杂或特殊的仪器设备，通过测量物质的某些物理或物理化学性质的参数及其变化来获取物质的化学组成、成分含量及化学结构等信息的一类分析方法。 本身不是一门独立的学科，而是多种仪器方法的组合 仪器分析是在化学分析的基础上发展起来的。 • 不少仪器分析方法的原理，涉及到有关化学分析的基本理论; • 不少仪器分析方法，必须与一系列化学分析手段相结合，才能完成分析的全过程，即仪器分析与化学分析相联合; • 仪器分析有时还需要采用化学富集的方法提高灵敏度，如样品富集和萃取。 2. 仪器分析方法的分类 2.1 光分析法 • 光分析法: 是指基于光作用于物质后所产生的辐射信号或所引起的变化来进行分析的一类方法，可分为光谱法和非光谱法两类。 2.1 光分析法 • 非光谱法:指通过测量光的反射、折射、干涉、衍射和偏振等变化所建立的分析方法，包括折射法、干涉法、旋光法、 X射线衍射法等。 2.1 光分析法 • 光谱法:基于物质对光的吸收、发射和散射等作用，通过检测相互作用后的光谱波长和强度变化而建立的光分析法。 • 主要包括: 吸收:原子吸收、紫外、可见、红外、核磁共振 发射:原子发射、原子荧光、X荧光、分子荧光 和磷光法、化学发光法 散射:拉曼光谱法 2.2 电化学分析法 • 是指依据物质在溶液中的电化学性质及其变化来进行分析的方法。 • 根据所测定的电参数不同划分为: 电位分析，电导分析，库仑分析，极谱分析，伏安分析等 • 活跃领域:新型电极与微电极 原位及活体分析 2.3 色谱分析法 • 色谱分析法: 是指根据不同物质在固定相和流动相中分配系数的差异实现混合物分离的分析方法，特别适合于复杂有机混合物的快速高效分析。 2.3 色谱分析法 • 包括气相色谱，液相色谱，离子色谱，超临界流体色谱，薄层色谱，毛细管电泳等。 • 生物大分子与手性化合物的分析是色谱法研究的活跃方面，与其它分析仪器的联用技术发展迅速。 2.4 其它分析法 • 质谱法: 试样在离子源中被电离和裂分成各种大小的带电荷的离子束后，经质量分离器按质荷比的大小分离获得质谱图，进而获得化合物结构信息的分析方 法。 是化合物结构分析中最常用的四种光波谱分析方法(紫外、红外、核磁和质谱)之一。 2.4 其它分析法 • 热分析法: 是测定物质的质量、体积、热导或反应热与温度之间的关系而建立起来的分析方法。 常见的有热重量法、差热分析法等。 仪器分析方法的分类 • 光分析法 光谱法 吸收:原子吸收、紫外、可见、红外、核磁共振 发射:原子发射、原子荧光、X荧光、 分子荧光、磷光、化学发光 散射:拉曼 非光谱法:折射法、干涉法、旋光法、 散射浊度法、衍射法 • 电化学法:电导、电位、电解、库仑、伏安、极谱 • 色谱法:气相、液相、毛细管电泳 • 其它方法:质谱、热分析法等 3. 仪器分析的发展概况 仪器分析的三次革命 • 第一次变革 分析天平的发明; 20世纪初，溶液理论(四大平衡)的建立，奠定了分析化学的理论基础，使其由一门操作技术转变成一门科学。 直到20世纪40年代，化学分析在分析化学中占主导地位，仪器分析方法少且精度低。 3. 仪器分析的发展概况 • 第二次革命 “化学反应为主的经典分析化学—仪器分析为主的现代分析化学”的转变; 20世纪40年代后，物理学和电子学发展，一系列重大科学发现，为仪器分析的建立和发展奠定了理论基础。 核磁共振(NMR)，B loch F ，PurcellE M。 极谱，Heyrovsky J。 气相色谱，Martin A T P ，Synge R L M 仪器分析发展，引发了分析化学的第二次变革;但这一时期仪器分析的自动化程度仍较低。 3. 仪器分析的发展概况 • 第三次革命 计算机的应用 20世纪80年代初开始，实现了计算机控制下的分析数据采集与处理、信息挖掘及三维图像显示。 发展方向:高灵敏度，高选择性，自动化，智能化，信息化和微型化 3. 仪器分析的发展概况 计算机对仪器分析发展的促进作用 a. 促进仪器分析自动化 b. 促进新的分析仪器的出现 c. 提高仪器性能 d. 实现分析仪器智能化、网络化、人性化 3. 仪器分析的发展概况 分析仪器中的计算机应用技术 a. 计算机控制下的数据采集 b. 计算机自动控制 c. 计算机数据处理 d. 专家系统与人工智能 e. 网络技术 f. 虚拟技术 3. 仪器分析的发展概况 • 分析化学的发展趋势 必须突破纯化学分支学科的局限，与物理学、数学、计算机科学和生物学等更加紧密地结合起来，成为一门多学科的边缘学科、交叉学科。 美国《Analytical Chemistry》主编 Prof. Laitinen “分析化学是表征和测量的科学” “化学正从分析化学中离开” “分析化学进入了物理学” 3. 仪器分析的发展概况 • 现代分析化学 是应用化学、物理学、电子学、数学、生物学等学科中的原理、方法和技术成就，以解决物质的无机、有机合成、结构以及微量、薄层、价态、状态等分析的科学。 3. 仪器分析的发展概况 • 现代分析化学面临挑战 分析的准确度和灵敏度 分析速度 操作的简便程度等 • 化学分析远不能适应这些新挑战，而仪器分析应用科技最新成果，为满足这些需要而不断发展，成为现代分析化学的发展方向。 分析化学的一些未来发展途径 自动化和机器人 仪器网络 真正智能仪器 更复杂的数据压缩 在线传感器和微型化系统 高级遥感 4. 仪器分析的特点和局限性 特点: • 灵敏度高，检出限量低，适用于微量、痕量组份的含量分析 • 操作简便、快速 • 可实现在线和遥控监测，适用于生产过程中的控制分析 • 能进行结构分析 • 样品用量少，可进行无损检测。 4. 仪器分析的特点和局限性 局限性: • 准确度不够高，相对误差通常较大(1~10%) • 一般都需要以物进行校准，而很多标准物需要用化学分析方法来标定 • 大型分析仪器比较昂贵 5. 分析仪器的性能指标 由于各种仪器原理差异很大，难有统一的性能指标体系，这里仅作一般性描述 • 信号与噪声 • 灵敏度与检出限 • 分辨率 5.1 信号与噪声 信号定义为分析仪器的响应，理想情况是仪器仅对待测组分有响应。由于仪器本身的不足及干扰的存在，分析过程往往产生信号的波动，即随机噪声。随机噪声叠加在响应信号上就增加了信号的不确定性。 5.1 信号与噪声 通常将没有试样时，仪器所产生的信号称为本底信号，它主要由随机噪声产生。实验中可通过增加平行测定次数来减低随机噪声。 当试样中无待测组分时，仪器所产生的信号成为空白信号。空白信号是由于试样中除待测组分以外的其它组分的干扰所引起的。 定量分析前需对试样预处理，使空白信号接近于本底信号。 5.1 信号与噪声 提高仪器性能，不但要提高灵敏度，而且要降低噪声，即仪器应具有较高的信/噪比。 提高信噪比的三种途径: a. 改进信号的测量技术 b. 信号经过适当处理 c. 实验条件的优化 5.2 灵敏度与检出限 • 灵敏度:是指待测组分浓度(或量)改变一个单位时所引起的信号的变化。 • 检出限:待测组分能被仪器检出的最低量成为检出限。 二者概念不同，注意区别。 待测组分能被检出的最小信号必须要大于噪声信号。 5.3 分辨率 • 分辨率是衡量仪器分辨干扰信号与组分信号或难分离两组分信号的能力指标。不同类型仪器有不同的定义。 光谱分析仪器的分辨率指将波长相邻的两条谱线分开的能力: R = λ/Δλ λ为刚能分辨的两谱线平均波长，Δλ为两波长差。 5.3 分辨率 质谱法中把区分两个可分辨质量的能力定义为分辨率: R = m/Δm m为刚能分辨的两质量的平均值，Δm为两质量差。 要 求 • 理解仪器分析特点和仪器分析与化学分析之间密切关系。 • 了解仪器分析中各种分析方法和仪器，了解仪器分析涉及面广、内容丰富。 • 了解分析化学的发展趋势。 本章问 • 1. 名词解释 分析化学;仪器分析法; 灵敏度;检出限; 本底信号和空白信号 • 2. 简述仪器分析的特点和局限性 相关知识 • 四大平衡 酸碱电离平衡，沉淀溶解平衡，配位,离解平衡，氧化,还原平衡 本课程的初步讲授计划 电化学分析法 原子发射光谱法 原子吸收光谱法 紫外-可见光分析法 红外光分析法 核磁共振波谱法 气相色谱法 高效液相色谱法 质谱分析法 其他仪器分析法 第三章 原子发射光谱法 • 1. 概述 • 2. 理论 • 3. 仪器 • 4. 分析方法 • 5. 原子发射光谱的干扰与校正 1. 概述 • 原子发射光谱法是根据处于激发态的待测元素原子回到基态时发射的特征谱线对待测元素进行分析的方法。 • 原子发射光谱法包括了三个主要的过程，即: •?由光源提供能量使样品蒸发、形成气态原子、并进一步使气态原子激发而产生光辐射; •?将光源发出的复合光经单色器分解成按波长顺序排列的谱线，形成光谱; •?用检测器检测光谱中谱线的波长和强度。 •由于待测元素原子的能级结构不同，因此发射谱线的特征不同，据此可对样品进行定性分析;而根据待测元素原子的浓度不同，因此发射强度不同，可实现元素的定量测定。 • 原子发射光谱的历史 2. 理论 • 每一时刻一个原子只发射一条谱线，因许多原子处于不同的激发态，因此，发射出各种不同的谱线。其中在基态与第一激发态之间跃迁产生的谱线称为共振线，通常它是最强的谱线。 • 由于不同元素的原子能级结构不同，因此能级之间的跃迁所产生的光谱具有不同的特征。根据谱线的特征可以确定元素的种类,这是原子发射光谱定性分析的依据。 3. 仪器 • 3.1 主要部件的性能与作用 • 原子发射光谱仪器的基本结构由三部分组成:激发光源;单色器;检测器。 3.1.1 激发光源 • 激发光源的基本功能是提供使试样中被测元素原子化和原子激发发光所需要的能量。对激发光源的要求是:灵敏度高，稳定性好，光谱背景小，结构简单，操作安全。常用的激发光源有电弧光源、电火花光源、电感耦合高频等离子体光源即ICP光源等。 •直流电弧发生器的工作原理 • 直流电弧发生器的电路图如图所示。可用两种方法引燃电弧:一种是在接通电源后使上下电极接触短路引弧;一种是用高频引弧。燃弧产生的热电子在通过分析间隙G飞向阳极的过程中被加速，当其撞击在阳极上，形成炽热的阳极斑，温度可达3800K，使试样蒸发和原子化。电子流过分析间隙时，使蒸气中的气体分子和原子电离，产生的正离子撞击阴极又使阴极发射电子，这个过程反复进行，维持电弧不灭。原子与电弧中其它粒子碰撞受到激发而发射光谱。 •直流电弧的分析性能 • 直流电弧放电时，电极温度高，有利于试样蒸发，分析的灵敏度很高，而且电极温度高,破坏了试样原来的结构，消除了试样组织结构的影响，但对试样的损伤大。 • 直流电弧光谱，除用石墨或炭电极产生氰带光谱外，通常背景比较浅。 • 直流电弧弧柱在电极表面上反复无常地游动，而且有分馏效应，导致取样与弧焰内组成随时间而变化，测定结果重现性差。 • 直流电弧激发时，谱线容易发生自吸。 • 由于上述特性，直流电弧常用于定性分析以及矿石、矿物难熔物质中痕量组分的定量测定。 • 低压交流电弧发生器的工作原理 • 低压交流电弧发生器由高频引弧电路(I)与低压电弧电路(II)组成。外电源电压经变压器B1升至3000V，向电容器C1充电，通过变阻器R2 调节供给变压器初级线圈的电压来调节充电速度。当C1中所充电压达到放电盘G'的击穿电压时，G'的空气绝缘被击穿，在振荡电路C1-L1-G' 中产生高频振荡，高频振荡电流经电感L1、L2耦合到低压电路中。电弧电路中旁路电容C2较小，一般为0.25-0.5μF，对高频电流阻抗很小,这样可以防止高频电路感应过来的高频电流进入低压电弧电路的供电电路。振荡电压经小功率高压变压器进一步升压至10000V，使分析间隙G击穿，低压电流沿着已经造成的游离空气通道，通过G进行弧光放电。 • 交流电弧的放电特性 • 交流电弧既具有电弧放电特性，又具有火花放电特性。改变电容C2与电感L2，可以改变放电特性:增大电容，减小电感，电弧放电向火花放电转变;减小电容，增大电感，电弧放电特性增强，火花放电特性减弱。 •交流电弧的分析性能 • 直流电弧放电时，电极温度高，有利于试样蒸发，分析的灵敏度很高，而且电极温度高,破坏了试样原来的结构，消除了试样组织结构的影响，但对试样的损伤大。 •?电极温度较低，这是由于交流电弧的间隙性造成的。交流电弧在每半周高频引弧之后，在电压降到不能维持电弧放电时便中断，至下半周再重新被引燃，这样便出现了电弧放电的间隙性。 •?电弧弧温较高，这是因为交流电弧的电弧电流具有脉冲性，电流密度比直流电弧大。 •?稳定性好。交流电弧放电是周期性的，每半周强制引弧，且每次引弧时在电极上有一个新接触点，即一次新的取样，使取样具有良好的代表性，故其精密度比直流电弧好。 •?交流电弧的分析灵敏度接近直流电弧。 •高压电容火花光源的工作原理 •稳定间隙控制的火花电路。外电流电压经高压变压器T升压至8000-15000V，通过扼流线圈D向电容器C充电。电路中串联了一个距离可以精密调节的控制间隙G'，并联了一个自感线圈L'，由于控制间隙G' 比分析间隙G 的击穿电压高，电容器C的充电电压取决于G'，当G'击穿时，通过L'向G'放电，产生高频振荡。因为L'有很高的阻抗，使放电电压几乎全部分配在分析间隙G上，致使G被击穿。由于G'的距离是可精密控制的，因此，光源具有良好的稳定性。由于大量能量消耗在分析间隙上，高频振荡很快衰减，当振荡电流中断以后放电停止。在下半周中电容器C又重新充电放电，反复进行以维持电火花持续放电。 •获得稳定火花放电的另一个方法，是采用旋转间隙控制的火花电路。即在放电电路中串联一个由同步电机带动的断续器M，断续器的绝缘圆盘直径两端固定两个钨电极2和3，与这两个电极相对应的固定电极1和4装置在电火花电路中。圆盘每转180?，对应的电极趋近一次，电火花电路接通一次，电容器放电，使分析间隙G放电。同步电机转速为50转/s，电火花电路每秒接通100次，电源为50周波，保证电火花每半周放电一次。控制间隙仅在每交流半周电压最大值的一瞬间放电，从而获得最大的放电能量。 •高压电容火花光源的放电特性 • 高压电容火花放电过程分为两个阶段:击穿阶段和电弧阶段或称振荡阶段。 • 高压电容火花放电特性取决于放电时释放能量的大小及能量耗散速率。 •高压电容火花放电的分析性能 •?激发温度很高，能激发激发电位很高的原子线和更多的离子线。 •?电极温度低，这是因为每个火花作用于电极上的面积小，时间短，每次放电之后火花随即熄灭，因此电极头灼热不显著。电极温度低，单位时间内进入放电区的试样量少，不适用于粉末和难熔试样的分析，但很适用于分析低熔点金属与合金的丝状、箔状样品。 •?稳定性好，这是因为火花放电能精密地加以控制。 •在紫外区光谱背景较深。 -3• ?电极上被火花冲击的点，受到灼热，经过10s迅速冷却下来，使电极表面层有严重的结构变化，试样表面状况与组分进入放电区的量要经过一段时间之后才能稳定，因此，做定量分析时，需要较长的预燃与曝光时间。 • ?此外，分析结果对第三组分的影响比较敏感。 电感耦合高频等离子体(ICP)光源 •等离子体是一种由自由电子、离子、中性原子与分子所组成的在总体上呈中性的气体，利用电感耦合高频等离子体(ICP)作为原子发射光谱的激发光源始于本世纪60年代。 • ICP的形成和结构 • ICP焰明显地分为三个区域:焰心区、内焰区和尾焰区。 • 焰心区呈白色，不透明，是高频电流形成的涡流区，等离子体主要 通过这一区域与高频感应线圈耦合而获得能量。该区温度高达10000K，电子密度很高，由于黑体辐射、离子复合等产生很强的连续背景辐射。试样气溶胶通过这一区域时被预热、挥发溶剂和蒸发溶质，因此，这一区域又称为预热区。 • 内焰区位于焰心区上方，一般在感应圈以上10-20mm左右，略带淡蓝色，呈半透明状态。温度约为6000-8000K，是分析物原子化、激发、电离与辐射的主要区域。光谱分析就在该区域内进行，因此，该区域又称为测光区。 • 尾焰区在内焰区上方，无色透明，温度较低，在6000K以下，只能激发低能级的谱线。 ICP的特性和分析性能 •在ICP中，由于高频电流的趋肤效应形成环状结构，涡流主要集中在等离子体的表面层内，造成一个环形加热区，其中心是一个温度较低的中心通道，使气溶胶能顺利进入等离子体内。经中心通道进入的气溶胶被加热而解离与原子化，产生的原子和离子限制在中心通道内不扩散到ICP的周围，避免产生能自吸的冷蒸气，使工作曲线具有很宽的动态范围，可达到4-6个数量级，可以测定试样中的痕量组分，还可测定主成份。 •趋肤效应:当交流电通过导体时，由于感应作用引起导体截面上的电流分布不均匀，越接近导体表面电流密度越大的现象。电流频率越高，趋肤效应越明显。 •ICP内部受热的高温气体向垂直于等离子体的外表面膨胀，对气溶胶的注入产生阻力，使气溶胶形成泪滴状沿等离子体的外表面逸出。 •在ICP中，由于高频电流的趋肤效应形成环状结构，其中心是一个温度较低的中心通道，使气溶胶能顺利进入等离子体内。经中心通道进入的气溶胶被加热而解离与原子化，产生的原子和离子限制在中心通道内不扩散到ICP的周围。 •由图可知，在测光区进行分析可以得到很高的信噪比，从而获得很好的检出限。 •ICP通过感应线圈以耦合方式从高频发生器获得能量，不需用电极，避 免了电极沾污与电极烧损所导致的测光区的变动。结果中心通道的气溶胶借助于对流、传导和辐射而间接受到加热，试样成分的变化对ICP的影响很小。因此ICP具有良好的稳定性。 •ICP的电子密度很高，电离干扰一般不予考虑。应用ICP同时测定多种元素，用ICP可测定的元素多达70多种。 •ICP的不足是雾化效率低，对气体和一些非金属等测定的灵敏度还不令人满意，固体进样问题尚待解决。此外，设备和维持费用较高。 3.1.2 分光系统 • 原子发射光谱的分光系统目前采用棱镜和光栅分光系统两种。 棱镜分光系统 •棱镜分光系统的光路。由光源Q来的光经三透镜KI、KII、kIII照明系统聚焦在入射狭缝S上，入射的光由准光镜L1变成平行光束，投射到棱镜P上。波长短的光折射率大，波长长的光折射率小，经棱镜色散之后按波长顺序被分开，再由照明物镜L2分别将它们聚焦在感光板的乳剂面FF'上，便得到按波长顺序展开的光谱。得到的每一条谱线都是狭缝的像。棱镜光谱是零级光谱。 •棱镜分光系统的光学特性可用色散率、分辨率和集光本领三个指标来表征。 光栅分光系统 3.1.3 检测系统 •原子发射光谱的检测目前采用照相法和光电检测法两种。前者用感光板而后者以光电倍增管或电荷耦合器件(CCD)作为接收与记录光谱的主要器件。 感光板 •用感光板来接收与记录光谱的方法称为照相法，采用照相法记录光谱的原子发射光谱仪称为摄谱仪。 •感光板由照相乳剂均匀地涂布在玻璃板上而成。感光板上的照相乳剂感光后变黑的黑度用测微光度计测量以确定谱线的强度。 •感光板的特性常用反衬度、灵敏度与分辨能力表征。 光电倍增管 •用光电倍增管来接收和记录谱线的方法称为光电直读法。光电倍增管既是光电转换元件，又是电流放大元件。 •光电倍增管的外壳由玻璃或石英制成，内部抽真空，阴极涂有能发射电子的光敏物质，如Sb-Cs或Ag-O-Cs等，在阴极C和阳极A间装有一系列次级电子发射极，即电子倍增极D1、D2 … 等。阴极C和阳极A之间加有约1000V的直流电压，当辐射光子撞击光阴极C时发射光电子，该光电子被电场加速落在第一被增极D1上，撞击出更多的二次电子，依次类 58推，阳极最后收集到的电子数将是阴极发出的电子数的10-10倍。 •光电倍增管的特性用以下参数表征: •?暗电流和线性响应范围 •在入射光的光谱成分不变时，光电倍增管的光电流强度i与入射光强度成正比: •式中，Ii为对应于该电流的入射光强度，k为比例系数，i0为暗电流。暗电流指入射光强度为零时的输出电流，它由热电子发射及漏电流引起。因此，降低温度及降低电压都能降低暗电流。光电元件的暗电流愈小，质量就愈好。 •?噪声和信噪比 •在入射光强度不变的情况下，光电流也会引起波动。这种波动会给光谱测量带来噪声。光电倍增管输出信号与噪声的比值，称为信噪比。信噪比决定入射光强度测量的最低极限，即决定待测元素的检出限。只有将噪声减小，才能有效地提高信噪比，降低元素的检出限。 •?灵敏度和工作光谱区 •在入射光通量为1个单位(流明)时，输出光电流强度的数值，称为光电倍增管的灵敏度。若用表示，灵敏度为: •式中，i为输出光电流强度，F为入射光通量。光电倍增管的灵敏度随入射光的波长而变化。这种灵敏度，称为光谱灵敏度。描述光变灵敏度的曲线，称为光谱响应曲线。根据光谱响应曲线，可以确定光电倍增管的工作光谱区和最灵敏波长。 •?工作电压和工作温度 •在入射光强度不变的情况下，光电倍增管供电电压的变化会影响光电流的强度。因此，必须采用稳压电源供电，工作电压的波动不许超过0.05%。当电压升高到一定值后，光电倍增管即产生自发放电。这种自发放电会使光电元件受到损坏。因此，工作时不许超过光电倍增管允许的最高电压。此外，工作环境的温度变化也会影响光电流的强度。因此，光电倍增管必须在温度波动不大的环境中工作，特别不能在高温的环境中工作。 •?疲劳和老化 •入射光强度较大或照射时间较长，会引起光电流的衰减。这种现象称为疲劳现象。疲劳后在黑暗中经过一些时间可以恢复灵敏度的，称为可逆疲劳。疲劳后无法恢复灵敏度的，称为不可逆疲劳或老化。在正常情况下，老化过程是进行得很慢的。如果入射光较强，产生超过1毫安的光电流，光电倍增管就可能因老化而损坏。 CCD(Charge-Coupled Devices, 中文译名是电荷耦合器件) •CCD是一种新型固体多道光学检测器件，它是在大规模硅集成电路工艺基础上研制而成的模拟集成电路芯片。由于其输入面空域上逐点紧密排布着对光信号敏感的像元，因此它对光信号的积分与感光板的情形颇相似。但是，它可以借助必要的光学和电路系统，将光谱信息进行光电转换、储存和传输，在其输出端产生波长-强度二维信号，信号经放大和计算机处理后在末端显示器上同步显示出人眼可见的图谱，无须感光板那样的冲洗和测量黑度的过程。目前这类检测器已经在光谱分析的许多领域获得了应用。 •在原子发射光谱中采用CCD的主要优点是这类检测器的同时多谱线检测能力，和借助计算机系统快速处理光谱信息的能力，它可极大地提高发射光谱分析的速度。如采用这一检测器设计的全谱直读等离子体发射光谱仪可在一分钟内完成样品中多达 70 种元素的测定;此外，它的动态响应范围和灵敏度均有可能达到甚至超过光电倍增管，加之其性能稳定、体积小、比光电倍增管更结实耐用，因此在发射光谱中有广泛的应用前景。 3.2. 原子发射光谱仪的类型 •原子发射光谱仪目前分为摄谱仪和光电直读光谱仪两类，后者又分为多道光谱仪、单道扫描光谱仪和全谱直读光谱仪等。 •摄谱仪 •摄谱仪是用光栅或棱镜做色散元件，用照相法记录光谱的原子发射光谱仪器。利用光栅摄谱仪进行定性分析十分方便，且该类仪器的价格较便宜，测试费用也较低，而且感光板所记录的光谱可长期保存，因此目前应用仍十分普遍。 •由光源B来的光经三透镜L及狭缝S投射到反射镜P1上，经反射之后投射到凹面反射镜M下方的准光镜O1上，变为平行光，再射至平面光栅G上。波长长的光，衍射角大，波长短的光，衍射角小，复合光经过光栅色散之后，便按波长顺序被分开。不同波长的光由凹面反射镜上方的物镜Q2聚焦于感光板的乳剂面F上，得到按波长顺序展开的光谱。转动光栅台D，改变光栅角度，可以调节波长范围和改变光谱级次。P2是二级衍射反射镜，图中虚线表示衍射光路。为了避免一次和二次衍射光相互干 扰，在暗箱前设一光阑，将一次衍射光谱挡掉。不用二次衍射时，转动挡光板将二次衍射反射镜P3挡住。光栅光谱利用的是非零级光谱。 •光电直读光谱仪 •光电直读光谱仪分为多道直读光谱仪、单道扫描光谱仪和全谱直读光谱仪三种。前两种仪器采用光电倍增管作为检测器，后一种采用固体检测器。 •从光源发出的光经透镜聚焦后，在入射狭缝上成像并进入狭缝。进入狭缝的光投射到凹面光栅上，凹面光栅将光色散，聚焦在焦面上，焦面上安装有一组出射狭缝，每一狭缝允许一条特定波长的光通过，投射到狭缝后的光电倍增管上进行检测，最后经计算机进行数据处理。 •多道直读光谱仪的优点是分析速度快，准确度优于摄谱法;光电倍增管对信号放大能力强，可同时分析含量差别较大的不同无素;适用于较宽的波长范围。但由于仪器结构限制，多道直读光谱仪的出射狭缝间存在一定距离，使利用波长相近的谱线有困难。 •多道直读光谱仪适合于固定元素的快速定性、半定量和定量分析。如这类仪器目前在钢铁冶炼中常用于炉前快速监控C、S、P等元素。 •从光源发出的光穿过入射狭缝后，反射到一个可以转动的光栅上，该光栅将光色散后，经反射使某一条特定波长的光通过出射狭缝投射到光电倍增管上进行检测。光栅转动至某一固定角度时只允许一条特定波长的光线通过该出射狭缝，随光栅角度的变化，谱线从该狭缝中依次通过并进入检测器检测，完成一次全谱扫描。 •和多道光谱仪相比，单道扫描光谱仪波长选择更为灵活方便，分析样品的范围更广，适用于较宽的波长范围。但由于完成一次扫描需要一定时间，因此分析速度受到一定限制。 •光源发出的光通过两个曲面反光镜聚焦于入射狭缝，入射光经抛物面准直镜反射成平行光，照射到中阶梯光栅上使光在X向上色散,再经另一个光栅(Schmidt 光栅)在Y 向上进行二次色散，使光谱分析线全部色散在一个平面上，并经反射镜反射进入面阵型CCD检测器检测。 •这种全谱直读光谱仪不仅克服了多道直读光谱仪谱线少和单道扫描光谱仪速度慢的缺点，而且所有的元件都牢固地安置在机座上成为一个整体，没有任何活动的光学器件，因此具有较好的波长稳定性。 4. 分析方法 •每一种元素的原子都有它的特征光谱， 根据原子光谱中的元素特征谱线就可以确定试样中是否存在被检元素。通常将元素特征光谱中强度较大的谱线称为元素的灵敏线。只要在试样光谱中检出了某元素的灵敏线，就可以确证试样中存在该元素。反之，若在试样中未检出某元素的灵敏线，就说明试样中不存在被检元素，或者该元素的含量在检测灵敏度以下。 •光谱定性分析常采用摄谱法，通过比较试样光谱与纯物质光谱或铁光谱来确定元素的存在。 •标准试样光谱比较法 •将欲检查元素的纯物质与试样并列摄谱于同一感光板上，在映谱仪上检查试样光谱与纯物质光谱，若试样光谱中出现与纯物质具有相同特征的谱线，表明试样中存在欲检查元素。这种定性方法对少数指定元素的定性鉴定是很方便的。 •铁谱比较法 •将试样与铁并列摄谱于同一光谱感光板上，然后将试样光谱与铁光谱标准谱图对照，以铁谱线为波长标尺，逐一检查欲检查元素的灵敏线，若试样光谱中的元素谱线与标准谱图中标明的某一元素谱线出现的波长位置相同，表明试样中存在该元素。铁谱比较法对同时进行多元素定性鉴定十分方便。 •此外，还有谱线波长测量法，但此法应用有限。应该注意的是，因为谱线的相互干扰往往是可能发生的，因此，不管采用哪种定性方法，一般说来，至少要有两条灵敏线出现，才可以确认该元素的存在。 4.2 半定量分析 •摄谱法是目前光谱半定量分析最重要的手段，它可以迅速地给出试样中 待测元素的大致含量，常用的方法有谱线黑度比较法和显现法等。 •谱线黑度比较法 •将试样与已知不同含量的标准样品在一定条件下摄谱于同一光谱感光板上，然后在映谱仪上用目视法直接比较被测试样与标准样品光谱中分析线的黑度，若黑度相等，则表明被测试样中欲测元素的含量近似等于该标准样品中欲测元素的含量。该法的准确度取决于被测试样与标准样品组成的相似程度及标准样品中欲测元素含量间隔的大小。 •显线法 •元素含量低时，仅出现少数灵敏线、随着元素含量增加，一些次灵敏线与较弱的谱线相继出现，于是可以编成一张谱线出现与含量的关系表，以后就根据某一谱线是否出现来估计试样中该元素的大致含量。该法的优点是简便快速，其准确程度受试样组成与分析条件的影响较大。 •内标法光谱定量分析的原理 •由于发射光谱分析受实验条件波动的影响，使谱线强度测量误差较大，为了补偿这种因波动而引起的误差，通常采用内标法进行定量分析。 •内标法是利用分析线和比较线强度比对元素含量的关系来进行光谱定量分析的方法。所选用的比较线称为内标线，提供内标线的元素称为内标元素。内标法是盖纳赫1925年提出来的。 •光谱定量分析方法 •校正曲线法 •在选定的分析条件下，用三个或三个以上的含有不同浓度的被测元素的标样激发光源，以分析线强度I，或者分析线对强度比R或者lgR对浓度C或者lgC建立校正曲线。在同样的分析条件下，测量未知试样光谱的I或者R或者lgR，由校正曲线求得未知试样中被测元素含量C。 •如用照相法记录光谱，分析线与内标线的黑度都落在感光板乳剂特性曲线的正常曝光部分，这时可直接用分析线对黑度差Δs与lgC建立校正曲线，进行定量分析。 •校正曲线法是光谱定量分析的基本方法，应用广泛，特别适用于成批样 品的分析。 •标准加入法 •在标准样品与未知样品基体匹配有困难时，采用标准加入法进行定量分析，可以得到比校正曲线法更好的分析结果。 •在几份未知试样中，分别加入不同已知量的被测元素，在同一条件下激发光谱，测量不同加入量时的分析线对强度比。在被测元素浓度低时，自吸收系数b为1，谱线强度比R直接正比于浓度C，将校正曲线R-C延长交于横坐标，交点至坐标原点的距离所相应的含量，即为未知试样中被测元素的含量。 •标准加入法可用来检查基体纯度、估计系统误差、提高测定灵敏度等。 5. 原子发射光谱的干扰与校正 •在发射光谱中最重要的光谱干扰是背景干扰。带状光谱、连续光谱以及光学系统的杂散光等，都会造成光谱的背景。其中光源中未离解的分子所产生的带状光谱是传统光源背景的主要来源，光源温度越低，未离解的分子就越多，因而背景就越强。在电弧光源中，最严重的背景干扰是空气中的N 与碳电极挥发出来的C 所产生的稳定化合物CN分子的三2 条带状光谱,其波长范围分别是353-359nm，377-388nm和405-422nm，干扰许多元素的灵敏线。此外，仪器光学系统的杂散光到达检测器，也产生背景干扰。由于背景干扰的存在使校正曲线发生弯曲或平移，因而影响光谱分析的准确度，故必须进行背景校正。 •校正背景的基本原则是，谱线的表观强度I减去背景强度I 。常用的1+bb校正背景的方法有离峰校正法和等效浓度法。 •非光谱干扰主要来源于试样组成对谱线强度的影响，这种影响与试样在光源中的蒸发和激发过程有关。光源中蒸发、原子化和激发过程中各参数(包括蒸发速度常数a、离解度b、电离度x和电离电位Eu等)对谱线强度具有影响。这种试样组成对谱线强度的影响亦被称为基体效应。 •试样蒸发过程对谱线强度的影响 •试样在光源的作用下蒸发进入等离子体内，蒸发速度取决于物质的性质与蒸发条件。易挥发性的组分先蒸发出来，难挥发性组分后蒸发出来，试样中不同组分的蒸发有先后次序，此种现象称为分馏。以电弧光源为例，激发光源的温度与试样基体的组成存在明显的依赖关系，如果试样基体中含有大量低沸点的物质，则光源温度就受其控制而使得蒸发温度较低，相反，如果基体中含有大量高沸点物质，蒸发温度就较高。由于分析物在不同基体中的蒸发行为不同，因而影响发射谱线的强度。 •物质的蒸发速度可用实验方法测定，蒸发速度随蒸发时间的变化曲线，称为蒸发曲线。不同的元素有不同的蒸发曲线，各元素从电极样孔内蒸发到弧焰中去的顺序是: •金属: •Hg、As、Cd、Zn、Te、Sb、Si、Pb、Tl、Mn、Ag、Cu、Sn、Au、In、Ga、Ge、Fe、Ni、Co、V、Cr、Ti、Pt、U、Zr、Hf、Nb、Th、Mo、Re、Ta、W、B。贵金属的蒸发顺序在Mn与Co之间。贵金属之间的相对挥发顺序是Ag、Au、Pd、Rh、Pt、Ru、Ir、Os。B往往生成蒸发得极慢的碳化硼。 •氧化物: •Hg、As、Cd、Zn、Bi、Sb、Tl、Sn、Mn、Mg、Cu、Ge、In、Ga、Fe、Co、Ni、Ba、Cr、Ti、U、Sc、Mo、Re、Zr、稀土、Th、Nb、Ta、W、B。碱金属氧化物的位置介于Zn与Mn之间。碳酸盐易分解为氧化物。磷酸盐在高温条件下很快失去磷，熔融物中氧化物成分增大，因此，碳酸盐与磷酸盐的挥发顺序同氧化物的挥发顺序是一致的。 •硫化物: •Hg、As、Ge、Sn、Cd、Pb、Sb、Bi、Zn、Tl、In、Ag、Au、Cu、 Ni、 Co、 Mn、Fe、Mo、Re。 •氯化物: •Li、Na、K、Cs)、Mg、Ca、Sr、Ba。 •硫酸盐: •K、Na、Mg、Li、Ca、Ba。 •需要指出的是，有些元素在电极上发生化学反应，因而影响了其蒸发行为。如CuO先还原为Cu而后蒸发，Mo、W氧化物在石墨电极样孔中一部分以氧化物形式先蒸发出来，一部分转化为碳化物，很难挥发。第三组分的存在，既影响弧温，又有可能与被测元素发生高温化学反应，从而影响物质的蒸发。此外，电极形状也影响蒸发，电极样孔壁厚，电极头温度较低;电极样孔深，孔底温度较低，因此，易挥发性物质宜用厚壁深孔(8-10mm深)电极蒸发;难挥发性物质宜用浅孔(1-3mm深)薄壁细颈杯形电极蒸发。 •试样激发过程对谱线强度的影响 •物质蒸发进入等离子体内并原子化，原子或离子在等离子体温度下被激发，激发态原子或离子按照光谱选择定则跃迁到较低的能级或基态，伴随着发射一定波长的特征辐射。激发温度与光源等离子体中主体元素的电离电位有关，当等离子区中含有大量低电离电位的成分时，激发温度较低。电离电位愈高，光源的激发温度就愈高。所以，激发温度也受试样基体组成的影响，进而影响谱线的强度。 •基体效应的抑制 •在实际分析过程中，由于标准样品与试样的基体组成差别常常较大，因此存在基体效应，使测量结果产生误差。所以应尽量采用与试样基体一致的标准样品，以减少测定误差。但是，由于实际样品千差万别，要做到这一点是很不容易的。 •在实际工作中，特别是采用电弧光源时，常常向试样和标准样品中加入 一些添加剂以减小基体效应，提高分析的准确度，这种添加剂有时也被用来提高分析的灵敏度。添加剂主要有光谱缓冲剂和光谱载体。光谱缓冲剂的作用是使各样品的组成趋于一致，控制蒸发条件和激发条件，减小基体组成的变化对谱线强度的影响。而光谱载体的作用是利用分馏效应，促进一些元素提前蒸发，抑制另一些元素的蒸发速度，从而有效地增强分析元素的谱线，抑制基体物质的谱线出现。有时二者没有明显的界限，一种添加剂往往同时起缓冲剂和载体的作用。ICP光源的基体效应较小，一般不需要光谱添加剂，但是为了减小可能存在的干扰，使标准溶液与试样溶液保持大致相同的基体组成也是必要的。 •光谱添加剂是一些具有适当电离电位、适当熔点和沸点、谱线简单或具有化学反应活性的物质，如Ga2O3具有较低的熔点、沸点，且Ga 元素的电离电位较低，可以控制等离子区的电子浓度和蒸发、激发温度的恒定，有利于易挥发、易激发元素的分析。同时可抑制复杂谱线的出现，减小光谱干扰。AgCl等则可使难挥发的Nb、Ta、Ti、Zr、Hf等转变为易挥发的氯化物，改善了蒸发条件，大大提高了这些元素谱线的强度，从而提高了它们的分析灵敏度。 思考题 • 1.什么是原子发射光谱法,其主要过程是什么, • 2.比较分析各种激发光源的分析性能。 • 3.简述不同分光系统光学特性的指标参数。 • 4.试述原子发射光谱的检测。 • 5.简述原子发射光谱仪的类型。 • 6.了解3种分析方法和对应用途。 • 7.原子发射光谱仪有几种干扰，如何进行校正, • 8.名词解释 第四章 原子吸收光谱法 • 1.概述 2.原子吸收分析的理论 3.原子吸收光谱仪器 4.干扰效应及其消除方法 5.原子吸收光谱分析的实验技术 6.原子荧光光谱分析方法 1. 概述 • 原子吸收光谱法是本世纪50年代中期出现并在以后逐渐发展起来的一种新型的仪器分析方法，这种方法根据蒸气相中被测元素的基态原子对其原子共振辐射的吸收强度来测定试样中被测元素的含量。它在地质、冶金、机械、化工、农业、食品、轻工、生物医药、环境保护、材料科学等各个领域有广泛的应用。 • 无锡粮油监测所工程师正在使用AA800原子吸收光谱仪对粮食中的重金属含量。 • 连续光源火焰/石墨炉原子吸收光谱仪 1.1 原子吸收光谱法的优点与不足 • <1> 检出限低，灵敏度高。火焰原子吸收法的检出限可达到ppb级(纳克级)，石墨炉原子吸收法的检出限可达到 -10-1410-10g。 <2> 分析精度好。火焰原子吸收法测定中等和高含量元素的相对标准差可<1%，其准确度已接近于经典化学方法。石墨炉原子吸收法的分析精度一般约为3-5%。 <3> 分析速度快。原子吸收光谱仪在35分钟内，能连续测定50个试样中的6种元素。 • <4> 应用范围广。可测定的元素达70多个，不仅可以测定金属元素,也可以用间接原子吸收法测定非金属元素和有机化合物。 <5> 仪器比较简单，操作方便。 <6> 原子吸收光谱法的不足之处是多元素同时测定尚有困难,有相当一些元素的测定灵敏度还不能令人满意。 1.2 原子吸收光谱的发展历史 • 第一阶段 原子吸收现象的发现与科学解释 早在1802年，伍朗斯顿(W.H.Wollaston)在研究太阳连续光谱时，就发现了太阳连续光谱中出现的暗线。1817年，弗劳霍费(J.Fraunhofer)在研究太阳连续光谱时，再次发现了这些暗线，由于当时尚不了解产生这些暗线的原因，于是就将这些暗线称为弗劳霍费线。1859年，克希荷夫(G.Kirchhoff) 与本生(R.Bunson)在研究碱金属和碱土金属的火焰光谱时， 发现钠蒸气发出的光通过温度较低的钠蒸气时，会引起钠光的吸收，并且根据钠发射线与暗线在光谱中位置相同这一事实，断定太阳连续光谱中的暗线，正是太阳外围大气圈中的钠原子对太阳光谱中的钠辐射吸收的结果。 • 第二阶段 原子吸收光谱仪器的产生 原子吸收光谱作为一种实用的分析方法是从1955年开始的。这一年澳大利亚的瓦尔西(A.Walsh)发表了他的著名论文“原子吸收光谱在化学分析中的应用”奠定了原子吸收光谱法的基础。50年代末和60年代初，Hilger, Varian Techtron 及Perkin-Elmer公司先后推出了原子吸收光谱商品仪器，发展了瓦尔西的设计思想。到了60年代中期，原子吸收光谱开始进入迅速发展的时期。 • 第三阶段 电热原子吸收光谱仪器的产生 1959年,苏联里沃夫发表了电热原子化技术的第一篇论 -12-14文。电热原子吸收光谱法的绝对灵敏度可达到10-10g,使原子吸收光谱法向前发展了一步。近年来,塞曼效应和自吸效应扣除背景技术的发展,使在很高的的背景下亦可顺利地实现原子吸收测定。基体改进技术的应用、平台及探针技术的应用以及在此基础上发展起来的稳定温度平台石墨炉技术(STPF)的应用,可以对许多复杂组成的试样有效地实现原子吸收测定。 • 第四阶段 原子吸收分析仪器的发展 随着原子吸收技术的发展，推动了原子吸收仪器的不断更新和发展，而其它科学技术进步，为原子吸收仪器的不断更新和发展提供了技术和物质基础。近年来，使用连续光源和中阶梯光栅，结合使用光导摄象管、二极管阵列多元素分 析检测器，设计出了微机控制的原子吸收分光光度计，为解决多元素同时测定开辟了新的前景。微机控制的原子吸收光谱系统简化了仪器结构，提高了仪器的自动化程度，改善了测定准确度，使原子吸收光谱法的面貌发生了重大的变化。联用技术(色谱-原子吸收联用、流动注射-原子吸收联用)日益受到人们的重视。色谱-原子吸收联用，不仅在解决元素的化学形态分析方面，而且在测定有机化合物的复杂混合物方面，都有着重要的用途，是一个很有前途的发展方向。 2.原子吸收分析的理论 • 2.1 原子吸收光谱的产生 • 2.2 原子吸收光谱与原子结构 • 2.3 原子吸收光谱的轮廓 2.4 原子吸收光谱的测量 2.1 原子吸收光谱的产生 • 当有辐射通过自由原子蒸气，且入射辐射的频率等于原子中的电子由基态跃迁到较高能态(一般情况下都是第一激发态)所需要的能量频率时，原子就要从辐射场中吸收能量，产生共振吸收，电子由基态跃迁到激发态，同时伴随着原子吸收光谱的产生。 2.2 原子吸收光谱与原子结构 • 由于原子能级是量子化的，因此，在所有的情况下，原子对辐射的吸收都是有选择性的。由于各元素的原子结构和外层电子的排布不同，元素从基态跃迁至第一激发态时吸收的能量不同，因而各元素的共振吸收线具有不同的特征。 • 原子吸收光谱位于光谱的紫外区和可见区。 2.3 原子吸收光谱的轮廓 • 原子吸收光谱线并不是严格几何意义上的线，而是占据着有 限的相当窄的频率或波长范围，即有一定的宽度。原子吸收光谱的轮廓以原子吸收谱线的中心波长和半宽度来表征。中心波长由原子能级决定。半宽度是指在中心波长的地方，极大吸收系数一半处，吸收光谱线轮廓上两点之间的频率差或波长差。半宽度受到很多实验因素的影响。 影响原子吸收谱线轮廓的两个主要因素 • 多普勒变宽 多普勒宽度是由于原子热运动引起的。从物理学中已知，从一个运动着的原子发出的光，如果运动方向离开观测者，则在观测者看来，其频率较静止原子所发的光的频率低;反之，如原子向着观测者运动，则其频率较静止原子发出的光的频率为高，这就是多普勒效应。原子吸收分析中，对于火焰和石墨炉原子吸收池，气态原子处于无序热运动中，相对于检测器而言，各发光原子有着不同的运动分量，即使每个原子发出的光是频率相同的单色光，但检测器所接受的光则是频率略有不同的光，于是引起谱线的变宽。 • 谱线的多普勒变宽?V可由下式决定: D • 式中，R为气体常数;c为光速;M为原子量;T为热力学温度(K);V为谱线的中心频率。 0 可见，多普勒宽度与元素的原子量、温度和谱线频率有关。随温度升高和原子量减小，多普勒宽度增加。 • 碰撞变宽 当原子吸收区的原子浓度足够高时，碰撞变宽是不可忽略的。因为基态原子是稳定的，其寿命可视为无限长，因此对原子吸收测定所常用的共振吸收线而言，谱线宽度仅与激发态原子的平均寿命有关，平均寿命越长，则谱线宽度越窄。原子之间相互碰撞导致激发态原子平均寿命缩短，引起谱线 变宽。 碰撞变宽分为两种，即赫鲁兹马克变宽和洛伦茨变宽。 • 赫鲁兹马克变宽 被测元素激发态原子与基态原子相互碰撞引起的变宽，称为共振变宽，又称赫鲁兹马克变宽或压力变宽。在通常的原子吸收测定条件下，被测元素的原子蒸气压力很少超过10-3mmHg，共振变宽效应可以不予考虑，而当蒸气压力达到0.1mmHg时，共振变宽效应则明显地表现出来。 • 洛伦茨变宽 被测元素原子与其它元素的原子相互碰撞引起的变宽，称为洛伦茨变宽。洛伦茨变宽随原子区内原子蒸气压力增大和温度升高而增大。 • 其它变宽 除上述因素外,影响谱线变宽的还有其它一些因素,例如场致变宽、自吸效应等。但在通常的原子吸收分析实验条件下，吸收线的轮廓主要受多普勒和洛伦茨变宽的影响。在2000-3000K的温度范围内，原子吸收线的宽度约为 -3-210-10nm。 2.4 原子吸收光谱的测量 • 吸收曲线的面积与吸光原子数的关系 原子吸收光谱产生于基态原子对特征谱线的吸收。在一定条件下，基态原子数N正比于吸收曲线下面所包括的整个面0 积。 • 式中e为电子电荷，m为电子质量，c为光速，N0为单位体积原子蒸气中吸收辐射的基态原子数，亦即基态原子密度;f为 振子强度，代表每个原子中能够吸收或发射特定频率光的平均电子数，在一定条件下对一定元素，f可视为一定值。 • 吸收曲线的峰值与吸光原子数的关系 • 峰值吸收系数K0与基态原子数N0之间存在如下关系: • 峰值吸收测量的实现 • 实现峰值吸收测量的条件是光源发射线的半宽度应小于吸收线的半宽度，且通过原子蒸气的发射线的中心频率恰好与吸收线的中心频率V相重合。 0 若采用连续光源，要达到能分辨半宽度为10-3nm，波长为500nm的谱线，按计算 需要有分辨率高达50万的单色器，这在目前的技术条件下还十分困难。因此，目前原子吸收仍采用空心阴极灯等特制光源来产生锐线发射。 3.原子吸收光谱仪器 •原子吸收光谱仪由光源、原子化器、分光器、检测系统等几部分组成(p91)。 •光源—发射待测元素的锐线光谱; •原子化系统—产生待测元素的原子蒸汽，常用高温火焰使试样溶液迅速蒸发、气化、原子化; •光学系统—使光沿一定的途径到达单色器，分离出所需要的共振线; •监测系统—将光信号转变为电信号，并对检测数据进行处理。 3.1 光源 • 光源的功能是发射被测元素的特征共振辐射。对光源的基本要求是: ?发射的共振辐射的半宽度要明显小于吸收线的半宽度; ?辐射强度大、背景低，低于特征共振辐射强度的1%; ?稳定性好，30分钟之内漂移不超过1%;噪声小于0.1%; ?使用寿命长于5安培小时。 空心阴极放电灯是能满足上述各项要求的理想的锐线光源， 应用最广。 • 空心阴极放电灯有一个由被测元素材料制成的空心阴极和一个由钛、锆、钽或其它材料制作的阳极。阴极和阳极封闭在带有光学窗口的硬质玻璃管内，管内充有压强为2-10mmHg的惰性气体氖或氩，其作用是产生离子撞击阴极,使阴极材料发光。 • 空心阴极灯放电是一种特殊形式的低压辉光放电，放电集中于阴极空腔内。当在两极之间施加几百伏电压时，便产生辉光放电。在电场作用下，电子在飞向阳极的途中，与载气原子碰撞并使之电离，放出二次电子，使电子与正离子数目增加，以维持放电。正离子从电场获得动能。如果正离子的动能足以克服金属阴极表面的晶格能，当其撞击在阴极表面时，就可以将原子从晶格中溅射出来。除溅射作用之外，阴极受热也要导致阴极表面元素的热蒸发。溅射与蒸发出来的原子进入空腔内，再与电子、原子、离子等发生第二类碰撞而受到激发，发射出相应元素的特征的共振辐射。 • 空心阴极灯常采用脉冲供电方式，以改善放电特性，同时便于使有用的原子吸收信号与原子化池的直流发射信号区分开，称为光源调制。在实际工作中，应选择合适的工作电流。使用灯电流过小，放电不稳定;灯电流过大，溅射作用增加，原子蒸气密度增大，谱线变宽，甚至引起自吸，导致测定灵敏度降低，灯寿命缩短。 由于原子吸收分析中每测一种元素需换一个灯，很不方便，现亦制成多元素空心阴极灯，但发射强度低于单元素灯，且如果金属组合不当，易产生光谱干扰，因此，使用尚不普遍。 • 无极放电灯 • 对于砷、锑等元素的分析，为提高灵敏度，亦常用无极放电灯做光源。无极放电灯是由一个数厘米长、直径5-12厘米的石英玻璃圆管制成。管内装入数毫克待测元素或挥发性盐类，如金属、金属氯化物或碘化物等，抽成真空并充入压力为67-200Pa的惰性气体氩或氖，制成放电管，将此管装在一个高频发生器的线圈内，并装在一个绝缘的外套里，然后放在一个微波发生器的同步空腔谐振器中。这种灯的强度比空心阴极灯大几个数量级,没有自吸,谱线更纯。 3.2 原子化器 • 原子化器的功能是提供能量，使试样干燥，蒸发和原子化。 在原子吸收光谱分析中，试样中被测元素的原子化是整个分析过程的关键环节。实现原子化的方法，最常用的有两种: 火焰原子化法:是原子光谱分析中最早使用的原子化方法，至今仍在广泛地被应用; 非火焰原子化法，其中应用最广的是石墨炉电热原子化法。 火焰原子化器 • 火焰原子化法中，常用的预混合型原子化器，由雾化器、混合室和燃烧器组成。 • 雾化器是关键部件，其作用是将试液雾化，使之形成直径为微米级的气溶胶。混合室的作用是使较大的气溶胶在室内凝聚为大的溶珠沿室壁流入泄液管排走，使进入火焰的气溶胶在混合室内充分混合均匀以减少它们进入火焰时对火焰的扰动，并让气溶胶在室内部分蒸发脱溶。燃烧器最常用的是单缝燃烧器，其作用是产生火焰，使进入火焰的气溶胶蒸发和原子化。因此，原子吸收分析的火焰应有足够高的温度，能 有效地蒸发和分解试样，并使被测元素原子化。此外，火焰应该稳定、背景发射和噪声低、燃烧安全。 • 原子吸收测定中最常用的火焰是乙炔-空气火焰，此外，应用较多的是氢-空气火焰和乙炔-氧化亚氮高温火焰。乙炔-空气火焰燃烧稳定，重现性好，噪声低，燃烧速度不是很大，温度足够高(约2300?)，对大多数元素有足够的灵敏度。氢-空气火焰是氧化性火焰，燃烧速度较乙炔-空气火焰高，但温度较低(约2050 ? )，优点是背景发射较弱，透射性能好。乙炔-氧化亚氮火焰的特点是火焰温度高(约2955 ? )，而燃烧速度并不快，是目前应用较广泛的一种高温火焰，用它可测定70多种元素。 非火焰原子化器 • 非火焰原子化法中，常用的是管式石墨炉原子化器，管式石墨炉原子化器由加热电源、保护气控制系统和石墨管状炉组成。加热电源供给原子化器能量，电流通过石墨管产生高热高温，最高温度可达到3000?。保护气控制系统是控制保护气的，仪器启动，保护气Ar流通，空烧完毕，切断Ar气流。外气路中的Ar气沿石墨管外壁流动，以保护石墨管不被烧蚀，内气路中Ar气从管两端流向管中心，由管中心孔流出，以有效地除去在干燥和灰化过程中产生的基体蒸气，同时保护已原子化了的原子不再被氧化。在原子化阶段，停止通气，以延长原子在吸收区内的平均停留时间，避免对原子蒸气的稀释。 低温原子化器 • 低温原子化是利用某些元素(如Hg)本身或元素的氢化物(如AsH3)在低温下的易挥发性，将其导入气体流动吸收池内进行原子化。目前通过该原子化方式测定的元素有Hg、As、Sb、Se、Sn、Bi、Ge、Pb、Te等。生成氢化物是一个 氧化还原过程，所生成的氢化物是共价分子型化合物，沸点低、易挥发分离分解。 3.3 分光器 • 分光器由入射和出射狭缝、反射镜和色散元件组成，其作用是将所需要的共振吸收线分离出来。分光器的关键部件是色散元件，现在商品仪器都是使用光栅。原子吸收光谱仪对分光器的分辨率要求不高，曾以能分辨开镍三线Ni230.003、Ni231.603、Ni231.096nm为标准，后采用Mn279.5和279.8nm代替Ni三线来检定分辨率。光栅放置在原子化器之后，以阻止来自原子化器内的所有不需要的辐射进入检测器。 3.4 检测系统 • 原子吸收光谱仪中广泛使用的检测器是光电倍增管，最近一些仪器也采用CCD作为检测器。 4.干扰效应及其消除方法 4.1干扰效应 • 原子吸收光谱分析中，干扰效应按其性质和产生的原因，可以分为四类: 物理干扰 化学干扰 电离干扰 光谱干扰 物理干扰 • 物理干扰是指试样在转移、蒸发和原子化过程中，由于试样任何物理特性(如粘度、表面张力、密度等)的变化而引起的原子吸收强度下降的效应。物理干扰是非选择性干扰，对试样各元素的影响基本是相似的。 配制与被测试样相似组成的标准样品，是消除物理干扰 最常用的方法。在不知道试样组成或无法匹配试样时，可采用标准加入法或稀释法来减小和消除物理干扰。 化学干扰 • 化学干扰是由于液相或气相中被测元素的原子与干扰物质组分之间形成热力学更稳定的化合物，从而影响被测元素化合物的解离及其原子化。磷酸根对钙的干扰，硅、钛形成难解离的氧化物、钨、硼、希土元素等生成难解离的碳化物，从而使有关元素不能有效原子化，都是化学干扰的例子。化学干扰是一种选择性干扰。 • 消除化学干扰的方法有:化学分离;使用高温火焰;加入释放剂和保护剂;使用基体改进剂等。例如磷酸根在高温火焰中就不干扰钙的测定，加入锶、镧或EDTA等都可消除磷酸根对测定钙的干扰。在石墨炉原子吸收法中，加入基体改进剂，提高被测物质的稳定性或降低被测元素的原子化温度以消除干扰。例如，汞极易挥发，加入硫化物生成稳定性较高的硫化汞，灰化温度可提高到300?;测定海水中Cu、Fe、Mn、As，加入 NHNO，使NaCl转化为NHCl，在原子化434 之前低于500?的灰化阶段除去。 电离干扰 • 在高温下原子电离，使基态原子的浓度减少，引起原子吸收信号降低，此种干扰称为电离干扰。电离效应随温度升高、电离平衡常数增大而增大，随被测元素浓度增高而减小。 加入更易电离的碱金属元素，可以有效地消除电离干扰。 光谱干扰 • 光谱干扰包括谱线重叠、光谱通带内存在非吸收线、原子化池内的直流发射、分子吸收、光散射等。当采用锐线光 源和交流调制技术时，前三种因素一般可以不予考虑，主要考虑分子吸收和光散射的影响，它们是形成光谱背景的主要因素。 分子吸收和光散射的影响 • 分子吸收干扰是指在原子化过程中生成的气体分子、氧化物及盐类分子对辐射吸收而引起的干扰。光散射是指在原子化过程中产生的固体微粒对光产生散射，使被散射的光偏离光路而不为检测器所检测，导致吸光度值偏高。 • 光谱背景除了波长特征之外，还有时间、空间分布特征。分子吸收通常先于原子吸收信号之前产生，当有快速响应电路和记录装置时，可以从时间上分辨分子吸收和原子吸收信号。样品蒸气在石墨炉内分布的不均匀性，导致了背景吸收空间分布的不均匀性。 • 提高温度使单位时间内蒸发出的背景物的浓度增加，同时也使分子解离增加。这两个因素共同制约着背景吸收。在恒温炉中，提高温度和升温速率，使分子吸收明显下降。 在石墨炉原子吸收法中，背景吸收的影响比火焰原子吸收法严重，若不扣除背景，有时根本无法进行测定。 4.2 背景校正方法 • 用邻近非共振线校正背景 此法是1964年由W. Slavin提出来的。用分析线测量原子吸收与背景吸收的总吸光度，因非共振线不产生原子吸收，用它来测量背景吸收的吸光度，两次测量值相减即得到校正背景之后的原子吸收的吸光度。 背景吸收随波长而改变，因此，非共振线校正背景法的准确度较差。这种方法只适用于分析线附近背景分布比较均匀的场合。 • 连续光源校正背景 此法是1965年由S.R Koirtyohann提出来的。先用锐线光源测定分析线的原子吸收和背景吸收的总吸光度，再用氘灯(紫外区)或碘钨灯、氙灯(可见区)在同一波长测定背景吸收(这时原子吸收可以忽略不计)，计算两次测定吸光度之差，即可使背景吸收得到校正。由于商品仪器多采用氘灯为连续光源扣除背景，故此法亦常称为氘灯扣除背景法。 • 赛曼效应校正背景 此法是1969年由M. Prugger和R. Torge提出来的。塞曼效应校正背景是基于光的偏振特性，分为两大类:光源调制法与吸收线调制法。以后者应用较广。调制吸收线的方式，有恒定磁场调制方式和可变磁场调制方式。 • 自吸效应校正背景 此法是1982年由S.B. Smith 和Jr. C. M. Hieftje提出来的。自吸效应校正背景法是基于高电流脉冲供电时空心阴极灯发射线的自吸效应。当以低电流脉冲供电时，空心阴极灯发射锐线光谱，测定的是原子吸收和背景吸收的总吸光度。接着以高电流脉冲供电，空心阴极灯发射线变宽，当空心阴极灯内积聚的原子浓度足够高时，发射线产生自吸，在极端的情况下出现谱线自蚀，这时测得的是背景吸收的吸光度。上述两种脉冲供电条件下测得的吸光度之差，便是校正了背景吸收的净原子吸收的吸光度。 5.原子吸收光谱分析的实验技术 5.1 测定条件的选择 • 分析线选择 通常选用共振吸收线为分析线，测定高含量元素时，可以选用灵敏度较低的非共振吸收线为分析线。As、Se等共振吸收线位于200nm以下的远紫外区，火焰组分对其有明显吸收，故用火焰原子吸收法测定这些元素时，不宜选用共振吸收线为分析线。 • 狭缝宽度选择 狭缝宽度影响光谱通带宽度与检测器接受的能量。原子吸收光谱分析中，光谱重叠干扰的几率小，可以允许使用较宽的狭缝。调节不同的狭缝宽度，测定吸光度随狭缝宽度而变化，当有其它的谱线或非吸收光进入光谱通带内，吸光度将立即减小。不引起吸光度减小的最大狭缝宽度，即为应选取的合适的狭缝宽度。 • 空心阴极灯的工作电流选择 空心阴极灯一般需要预热10-30min才能达到稳定输出。灯电流过小，放电不稳定,故光谱输出不稳定，且光谱输出强度小;灯电流过大，发射谱线变宽，导致灵敏度下降，校正曲线弯曲，灯寿命缩短。选用灯电流的一般原则是，在保证有足够强且稳定的光强输出条件下，尽量使用较低的工作电流。通常以空心阴极灯上标明的最大电流的一半至三分之二作为工作电流。在具体的分析场合，最适宜的工作电流由实验确定。 原子化条件的选择 • (1)火焰类型和特性:在火焰原子化法中，火焰类型和特性 是影响原子化效率的主要因素。对低、中温元素，使用空气-乙炔火焰;对高温元素，宜采用氧化亚氮-乙炔高温火焰;对分析线位于短波区(200nm以下)的元素，使用空气-氢火焰是合适的。对于确定类型的火焰，稍富燃的火焰(燃气量大于化学计量)是有利的。对氧化物不十分稳定的元素如Cu、Mg、Fe、Co、Ni等，用化学计量火焰(燃气与助燃气的比例与它们之间化学反应计量量相近)或贫燃火焰(燃气量小于化学计量)也是可以的。为了获得所需特性的火焰，需要调节燃气与助燃气的比例。 • (2)燃烧器的高度选择:在火焰区内，自由原子的空间分布是不均匀，且随火焰条件而改变，因此，应调节燃烧器的高度，以使来自空心阴极灯的光束从自由原子浓度最大的火焰区域通过，以期获得高的灵敏度。 • (3)程序升温的条件选择:在石墨炉原子化法中，合理选择干燥、灰化、原子化及除残温度与时间是十分重要的。干燥应在稍低于溶剂沸点的温度下进行，以防止试液飞溅。灰化的目的是除去基体和局外组分，在保证被测元素没有损失的前提下应尽可能使用较高的灰化温度。原子化温度的选择原则是，选用达到最大吸收信号的最低温度作为原子化温度。原子化时间的选择，应以保证完全原子化为准。原子化阶段停止通保护气，以延长自由原子在石墨炉内的平均停留时间。除残的目的是为了消除残留物产生的记忆效应，除残温度应高于原子化温度。 • 进样量选择 进样量过小，吸收信号弱，不便于测量;进样量过大，在火焰原子化法中，对火焰产生冷却效应，在石墨炉原子化 法中，会增加除残的困难。在实际工作中，应测定吸光度随进样量的变化，达到最满意的吸光度的进样量，即为应选择的进样量。 5.2 分析方法 • 标准曲线法 这是最常用的基本分析方法。配制一组合适的标准样品，在最佳测定条件下，由低浓度到高浓度依次测定它们的吸光度A，以吸光度A对浓度C作图。在相同的测定条件下，测定未知样品的吸光度，从A-C标准曲线上用内插法求出未知样品中被测元素的浓度。 • 标准加入法 当无法配制组成匹配的标准样品时，使用标准加入法是合适的。分取几份等量的被测试样，其中一份不加入被测元素，其余各份试样中分别加入不同已知量C、C、C……C123n的被测元素，然后，在标准测定条件下分别测定它们的吸光度A，绘制吸光度A对被测元素加入量C的曲线。 I • 如果被测试样中不含被测元素，在正确校正背景之后，曲线应通过原点;如果曲线不通过原点，说明含有被测元素，截距所相应的吸光度就是被测元素所引起的效应。外延曲线与横坐标轴相交，交点至原点的距离所相应的浓度C，即为所x求的被测元素的含量。应用标准加入法，一定要彻底校正背景。 思考题 • 1.什么是原子吸收光谱法,其有什么优点与不足, • 2.简述原子吸收光谱法的基本原理。 • 3.影响原子吸收光谱线的主要因素是什么, • 4.原子吸收光谱仪器的主要组成及其作用, • 5.简述原子吸收光谱法的干扰效应及其消除办法, • 6.论述原子吸收光谱中测定条件的选择。 第五章 紫外可见光谱法 • 1.分子光谱概述 • 2.紫外,可见吸收光谱 • 3.紫外,可见分光光度计 • 4.分光光度测定方法 • 5.紫外,可见分光光度法的应用 1.分子光谱概述 •1.1 电磁辐射的特性 •光的本质是电磁辐射，光的基本特性是波粒二象性。 光的波动性是指光可以用互相垂直的、以正弦波振荡的电场和磁场表示。电磁波具有速度、方向、波长、振幅和偏振面等。光可有自然光、偏振光(线偏振或园偏振)、连续波、调制波、脉冲波等。表示光的波动性有如下参数: • 光的粒子性是指光可以看成是由一系列量子化的能量子(即光子)组成。光子能量为: 1.2 电磁辐射与光谱分析法 • • 谱图的三要素 • 一般进行光谱分析时，要同时注意谱图的位置(能量)、强度(跃迁几率)、波宽这三个要素，才能得出正确的结论。 1.3 紫外-可见吸收光谱法概述 • 分子的紫外-可见吸收光谱法是基于分子内电子跃迁产生的吸收光谱进行分析的一种常用的光谱分析法。分子在紫外-可见区的吸收与其电子结构紧密相关。紫外光谱的研究对象大多是具有共轭双键结构的分 子。胆甾酮(a)与异亚丙基丙酮(b)分子结构差异很大，但两者具有相似的紫外吸收峰。两分子中相同的O=C-C=C共轭结构是产生紫外吸收的关键基团。 • 生色团对分子紫外吸收的影响 • 胆甾酮(a)与异亚丙基丙酮(b) • 紫外-可见以及近红外光谱区域的详细划分如下图所示。紫外-可见光区一般用波长(nm)表示。其研究对象大多在200-380 nm的近紫外光区和/或380-780 nm的可见光区有吸收。紫外-可见吸收测定的灵敏度取决于产生光吸收分子的摩尔吸光系数。该法仪器设备简单,应用十分广泛。如医院的常规化验中，95%的定量分析都用紫外-可见分光光度法。在化学研究中，如平衡常数的测定、求算主-客体结合常数等都离不开紫外-可见吸收光谱。 2.紫外,可见吸收光谱 2.1 分子结构与吸收光谱 • 分子光谱是带状光谱 • 分子对电磁辐射的吸收是分子总能量变化的和，即:E = E + E + elvibE，式中E代表分子的总能量，E，E，E分别代表电子能级的能rotelvibrot 量、振动能级的能量以及转动能级的能量。 • 分子在吸收过程中发生电子能级跃迁的同时伴随振动能级和转动能级的能量变化。一般原子对电磁辐射的吸收只涉及原子核外电子能量的变化，是一些分离的特征锐线，而分子的吸收光谱是由成千上万条彼此靠得很紧的谱线组成，看起来是一条连续的吸收带。 • 溶液中相邻分子间的碰撞导致分子各种能级的细微变化，也会引起谱带的进一步加宽和汇合。当分子由气态变为溶液时，一般会失去振动精细结构。 2.2 影响紫外-可见吸收光谱的因素 • 各种因素对吸收谱带的影响表现为谱带位移、谱带强度的变化、谱带 精细结构的出现或消失等。 • 谱带位移包括蓝移(或紫移)和红移。蓝移(或紫移)指吸收峰向短波长移动，红移指吸收峰向长波长移动。吸收峰强度变化包括增色效应和减色效应。前者指吸收强度增加，后者指吸收强度减小。 • 空间阻碍使共轭体系破坏，λ蓝移，ε减小。 maxmax • 取代基的影响 • 溶剂的影响 3.紫外,可见分光光度计 3.1紫外-可见分光光度计的基本结构 • 紫外-可见分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器以及数据处理及记录(计算机)等组成。 光源 • 光源的作用是提供激发能,使待测分子产生吸收。要求能够提供足够强的连续光谱、有良好的稳定性、较长的使用寿命,且辐射能量随波长无明显变化。常用的光源有热辐射光源和气体放电光源。利用固体灯丝材料高温放热产生的辐射作为光源的是热辐射光源。如钨灯、卤钨灯。两者均在可见区使用,卤钨灯的使用寿命及发光效率高于钨灯。气体放电光源是指在低压直流电条件下,氢或氘气放电所产生的连续辐射。一般为氢灯或氘灯,在紫外区使用。这种光源虽然能提供至160nm的辐射,但石英窗口材料使短波辐射的透过受到限制(石英 200nm,熔融石英 185nm),而大于360nm时,氢的发射谱线叠加于连续光谱之上,不宜使用。 单色器 • 单色器的作用是使光源发出的光变成所需要的单色光。通常由入射狭缝、准直镜、色散元件、物镜和出射狭缝构成。入射狭缝用于限制杂散光进入单色器，准直镜将入射光束变为平行光束后进入色散元件。后者将复合光分解成单色光，然后通过物镜将出自色散元件的平行光聚焦于出口狭缝。出射狭缝用于限制通带宽度。 • 吸收池 • 用于盛放试液。石英池用于紫外-可见区的测量，玻璃池只用于可见区。 • 检测器 • 简易分光光度计上使用光电池或光电管作为检测器。目前最常见的检测器是光电倍增管，其特点是在紫外-可见区的灵敏度高，响应快。但强光照射会引起不可逆损害，因此高能量检测不宜，需避光。 • 有的用二极管阵列作为检测器，极管阵列检测器不使用出口狭缝,在其位置上放一系列二极管的线形阵列,则分光后不同波长的单色光同时被检测。二极管阵列检测器的特点是响应速度快。但灵敏度不如光电倍增管，因后者具有很高的放大倍数。 3.2 紫外-可见分光光度计的工作原理 • 紫外-可见分光光度计，按其光学系统可分为单波长与双波长分光光度计、单光束与双光束分光光度计。 双光束紫外-可见分光光度计 • 单光束仪器中，分光后的单色光直接透过吸收池，交互测定待测池和参比池。这种仪器结构简单，适用于测定特定波长的吸收，进行定量。而双光束仪器中，从光源发出的光经分光后再经扇形旋转镜分成两束，交替通过参比池和样品池，测得的是透过样品溶液和参比溶液的光信号强度之比。 双波长紫外-可见分光光度计 •该仪器既可用作双波长分光光度计又可用作双光束仪器。当用作单波长双光束仪器 2出射的单色光束为遮光板所阻挡,单色器1出射的单色光束被斩光器分为时,单色器 两束断续的光，交替通过参比池和样品池，最后由光电倍增管检测信号。 3.3 分光光度计的校正 • 波长校正 • 可采用辐射光源法校正。常用氢灯(486.13, 656.28 nm)、氘灯(486.00, 656.10 nm)或石英低压汞灯(253.65, 435.88, 546.07 nm)校正。 • 镨钕玻璃在可见区有特征吸收峰，也可用来校正。 • 苯蒸汽在紫外区的特征吸收峰可用于校正。在吸收池内滴一滴液体苯，盖上吸收池盖，待苯挥发后绘制苯蒸汽的吸收光谱。 • 吸光度校正 • 以重铬酸钾水溶液的吸收曲线为标准值校正。将0.0303克重铬酸钾溶于1 升的0.05mol/l 氢氧化钾中，以1cm 吸收池，25?C测定吸收光谱。 4.分光光度测定方法 4.1 分光光度滴定 • 以一定的标准溶液滴定待测物溶液，测定滴定中溶液的吸光度变化，通过作图法求得滴定终点，从而计算待测组分含量的方法称为分光光度滴定。一般有直接滴定法和间接滴定法两种。前者选择被滴定物、滴定剂或反应生成物之一摩尔吸光系数最大的物质的λ为吸收波 max长进行滴定。间接滴定法需使用指示剂。 • 滴定曲线有如下几种形式。 4.2 差示分光光度法 • 吸光度A在0.2-0.8范围内误差最小。超出此范围，如高浓度或低浓度溶液，其吸光度测定误差较大。尤其是高浓度溶液，更适合用差示法。 • 一般分光光度测定选用试剂空白或溶液空白作为参比，差示法则选用一已知浓度的溶液作参比。该法的实质是相当于透光率标度放大。 • 高吸收法在测定高浓度溶液时使用。选用比待测溶液浓度稍低的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为100%。 • 低吸收法在测定低浓度溶液时使用。选用比待测液浓度稍高的已知浓度溶液作标准溶液，调节透光率为0。 • 最精密法是同时用浓度比待测液浓度稍高或稍低的两份已知溶液作标准溶液，分别调节透光率为0或100%。 4.3 导数分光光度法 • 用吸光度对波长求一阶或高阶导数并对波长作图，可以得到导数光谱。 • 因此，吸光度A的导数值与浓度C成比例。 • 随着导数阶数的增加，谱带变得尖锐，分辨率提高，但原吸收光谱的基本特点逐渐消失。 导数光谱的特点在于灵敏度高，可减小光谱干扰。因而在分辨多组分混合物的谱带重叠、增强次要光谱(如肩峰)的清晰度以及消除混浊样品散射的影响时有利。 4.4 双波长分光光度法 • 检测的是试样溶液对两波长光吸收后的吸光度差。 • 两束光通过吸收池后的吸光度差与待测组分浓度成正比。 • 双波长分光光度法的特点 • ?可用于悬浊液和悬浮液的测定，消除背景吸收。 ?无须分离，可用于吸收峰相互重叠的混合组分的同时测定。 ?可用于测定高浓度溶液中吸光度在0.01-0.005以下的痕量组分。 ?可测定导数光谱。 4.5 胶束增溶分光光度法 • 利用表面活性剂胶束的增溶、增敏、增稳、褪色、析相等作用，以提高显色反应的灵敏度、对比度或选择性，改善显色反应条件，并在水相中直接进行光度测量的光度分析方法。简言之，胶束增溶分光光度法是指，表面活性剂的存在提高了分光光度法测定灵敏度的一类方法。 4.6 动力学分光光度法 • 动力学分光光度法是利用反应速度参数测定待测物型体原始浓度的 -6-9方法。 动力学分光光度法的特点是灵敏度高(10-10g/ml，有的可 -12达10g/ml)。但由于影响因素多，不易严格控制，测定误差较大。 4.7 反射光谱法 • 反射光谱法测定的是从样品表面反射回来的辐射能量大小。镜面反射具有定义明确的反射角，如从镜面的反射一样;而漫反射时，部分被反射表面吸收，部分被反射表面散射。反射光谱的测定是在紫外-可见分光光度计上加一可进行反射操作的附件。 • (a)中两个对角镜用于反射从样品反射过来的光线。(b)是用于反射光谱测定的积分球附件。 4.8 光声光谱法 • 光声光谱法是1970年以后发展起来，可用于测定固体、半固体状态的生物组织或浑浊液体样品的紫外-可见吸收光谱。而普通的紫外-可见吸收光谱法由于散射及反射的影响，不能得到这类样品的理想谱图。 5.紫外,可见分光光度法的应用 5.1 定性分析 • 判断异构体:紫外吸收光谱的重要应用在于测定共轭分子。共轭体系越大，吸收强度越大，波长红移。 • 判断共轭状态:可以判断共轭生色团的所有原子是否共平面等。 • 已知化合物的验证:与标准谱图比对，紫外-可见吸收光谱可以作为有机化合物结构测定的一种辅助手段。 5.2 单组分定量分析 • 紫外-可见吸收光谱是进行定量分析最广泛使用的、最有效的手段之一。尤其在医院的常规化验中，95%的定量分析都用此法。其用于定量分析的优点是: • ?可用于无机及有机体系。 -4-5• ?一般可检测10-10 mol/l的微量组分，通过某些特殊方法(如胶束 -6-7增溶)可检测10-10 mol/l的组分。 • ?准确度高，一般相对误差1-3%，有时可降至百分之零点几。 分析条件的选择 定量分析方法 • 标准曲线法 • 配制不同浓度的标准溶液，由低浓度至高浓度依次测定其吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，在一定范围内应得到通过原点的直线，即标准曲线。通过标准曲线可求得未知样品的浓度。 • 标准加入法 • 样品组成比较复杂，难于制备组成匹配的标样时用标准加入法。将待测试样分成若干等份，分别加入不同已知量0, C1, C2…, Cn的待测组分配制溶液。由加入待测试样浓度由低至高依次测定上述溶液的吸收光谱，作一定波长下浓度与吸光度的关系曲线，得到一条直线。若直 线通过原点，则样品中不含待测组分;若不通过原点，将直线在纵轴上的截距延长与横轴相交，交点离开原点的距离为样品中待测组分的浓度。 5.3 混合物分析 • 根据吸光度的加和性，测定混合物中n个组分的浓度，可在n个不同波长处测量n个吸光度值，列出n个方程组成的联立方程组。方法的关键是选择合适的测定波长。在某一测定波长下其他组分的贡献要小。 • 5.4 平衡常数的测定 5.5 络合物结合比的测定 • 通过紫外-可见吸收光谱的测定，可以求得主客体络合物的结合比。 • 代表了第一种情况。曲线转折点对应的摩尔浓度比[Y]/[M] = n:m，即为该络合物的组成比。 • B-H方程(Benesi-Hildbrand Method) 思考题 • 1.谱图的三要素是什么, • 2.名词:紫外-可见吸收光谱法 • 3.为什么分子光谱是带状光谱, • 4.影响紫外-可见吸收光谱的因素有哪些, • 5.分光光度计如何校正, • 6.紫外-分光光度计有哪些应用, 第六章 红外光谱法 • 1. 概述 • 2. 红外吸收的基本原理 • 3. 红外光谱仪 • 4. 红外光谱与分子结构的关系 • 5. 红外光谱的应用 • 6. 拉曼光谱 1. 概述 • 1.1红外光谱法概述 • 19世纪初人们通过实验证实了红外光的存在。二十世纪初人们进一步系统地了解了不同官能团具有不同红外吸收频率这一事实。1950年以后出现了自动记录式红外分光光度计。随着计算机科学的进步，1970年以后出现了傅立叶变换型红外光谱仪。红外测定技术如全反射红外、显微红外、光声光谱以及色谱-红外联用等也不断发展和完善，使红外光谱法得到广泛应用。 • 红外及拉曼光谱都是分子振动光谱。通过谱图解析可以获取分子结构的信息。任何气态、液态、固态样品均可进行红外光谱测定，这是其它仪器分析方法难以做到的。由于每种化合物均有红外吸收，尤其是有机化合物的红外光谱能提供丰富的结构信息，因此红外光谱是有机化合物结构解析的重要手段之一。 • 1.2 红外光谱区域及其应用 • 红外光谱属于振动光谱，其光谱区域可进一步细分如下: • 红外光谱最重要的应用是中红外区有机化合物的结构鉴定。通过与标准谱图比较，可以确定化合物的结构;对于未知样品，通过官能团、顺反异构、取代基位置、氢键结合以及络合物的形成等结构信息可以推测结构。近年来红外光谱的定量分析应用也有不少报道,尤其是近红外、远红外区的研究报告在增加。如近红外区用于含有与C，N，O等原子相连基团化合物的定量;远红外区用于无机化合物研究等。傅立叶变换红外光谱还可作为色谱检测器。 • 典型的红外光谱。横坐标为波数(cm-1，最常见)或波长(mm)，纵坐标为透光率或吸光度。 2. 红外吸收的基本原理(自学) -1• 能量在4,000 400cm的红外光不足以使样品产生分子电子能级的跃迁，而只是振动能级与转动能级的跃迁。由于每个振动能级的变化都伴随许多转动能级的变化，因此红外光谱也是带状光谱。分子在振动和转动过程中只有伴随净的偶极矩变化的键才有红外活性。因为分子振动伴随偶极矩改变时，分子内电荷分布变化会产生交变电场，当其频率与入射辐射电磁波频率相等时才会产生红外吸收。因此，除少数同核双原子分子如O，N，Cl等无红外吸收外，大多数分子都有红外222 活性。 • 见课本p122-131 3. 红外光谱仪 • 3.1 红外光谱仪的组成 • 红外光谱仪与紫外-可见分光光度计的组成基本相同，由光源、样品室、单色器以及检测器等部分组成。两种仪器在各元件的具体材料上有较大差别。色散型红外光谱仪的单色器一般在样品池之后。 光源 • 一般分光光度计中的氘灯、钨灯等光源能量较大，要观察分子的振动能级跃迁，测定红外吸收光谱，需要能量较小的光源。黑体辐射是最接近理想光源的连续辐射。满足此要求的红外光源是稳定的固体在加热时产生的辐射，常见的有如下几种。 • 能斯特灯 • 能斯特灯的材料是稀土氧化物，作成圆筒状(20x2 mm)，两端为铂引线。其工作温度为1200-2200K。此种光源具有很大的电阻负温度系数，需要预先加热并设计电源电路能控制电流强度，以免灯过热损坏。 • 碳化硅棒 • 尺寸为50x5mm,工作温度1300-1500K。与能斯特灯相反,碳化硅棒具有正的电阻温度系数,电触点需水冷以防放电。其辐射能量与能斯特灯接近,但在>2000cm-1区域能量输出远大于能斯特灯。 • 白炽线圈 • 用镍铬丝螺旋线圈或铑线做成。工作温度约1100K。其辐射能量略低于前两种，但寿命长。 • 一般近红外区的光源用钨灯即可，远红外区用水银放电灯作光源。 检测器 • 红外检测器有热检测器、热电检测器和光电导检测器三种。前两种用于色散型仪器中，后两种在傅立叶变换红外光谱仪中多见。 • 热检测器 • 热检测器依据的是辐射的热效应。辐射被一小的黑体吸收后，黑体温度升高，测量升高的温度可检测红外吸收。以热检测器检测红外辐射时，最主要的是要防止周围环境的热噪声。一般使用斩光器使光源辐射断续照射样品池。 • 热检测器最常见的是热电偶。将两片金属铋熔融到另一不同金属如锑的两端，就有了两个连接点。两接触点的电位随温度变化而变。检测端接点做成黑色置于真空舱内，有一个窗口对红外光透明。参比端接点在同一舱内并不受辐射照射，则两接点间产生温差。热电偶可检测 -610K的温度变化。 • 热电检测器 • 热电检测器使用具有特殊热电性质的绝缘体，一般采用热电材料的单晶片，如硫酸三甘氨酸酯TGS。在电场中放一绝缘体会使绝缘体产生极化，极化度与介电常数成正比。但移去电场，诱导的极化作用也随之消失。而热电材料即使移去电场，其极化也并不立即消失，极化强度与温度有关。当辐射照射时，温度会发生变化，从而影响晶体的电荷分布，这种变化可以被检测。 • 热电检测器通常作成三明治状。将热电材料晶体夹在两片电极间，一个电极是红外透明的，容许辐射照射。辐射照射引起温度变化，从而晶体电荷分布发生变化，通过外部连接的电路可以测量。电流的大小与晶体的表面积、极化度随温度变化的速率成正比。当热电材料的温度升至某一特定值时极化会消失，此温度称为居里点。TGS的居里点为47?。热电检测器的响应速率很快，可以跟踪干涉仪随时间的变化，故多用于傅立叶变换红外光谱仪中。 • 光电导检测器 • 光电导检测器采用半导体材料薄膜，如Hg-Cd(镉)-Te(锑)或PbS(硫化 铅)或InSb(铟锑) ，将其置于非导电的玻璃表面密闭于真空舱内。则吸收辐射后非导电性的价电子跃迁至高能量的导电带，从而降低半导体的电阻，产生信号。Hg-Cd-Te缩写为MCT，该检测器用于中红外区及远红外区，需冷至液氮温度(77K)以降低噪声。这种检测器比热电检测器灵敏，在FT-IR及GC/FT-IR仪器中获得广泛应用。 • 此外，PbS检测器用于近红外区室温下的检测。 3.2 色散型红外光谱仪 • 色散型仪器在红外光谱仪出现后的很长一段时间内一直使用。该仪器的特点是: • ?为双光束仪器。使用单光束仪器时，大气中的H2O、CO2在重要的红外区域内有较强的吸收，因此需要一参比光路来补偿，使这两种物质的吸收补偿到零。采用双光束光路可以消除它们的影响，测定时不必严格控制室内的湿度及人数。 • ?单色器在样品室之后。由于红外光源的低强度，检测器的低灵敏度(使用热电偶时)，故需要对信号进行大幅度放大。而红外光谱仪的光源能量低，即使靠近样品也不足以使其产生光分解。而单色器在样品室之后可以消除大部分散射光而不至于到达检测器。 • ?切光器转动频率低，响应速率慢，以消除检测器周围物体的红外辐射。 • 图中，光源光被分成两束，分别作为参比和样品光束通过样品池。各光束交替通过扇形旋转镜M7，利用参比光路的衰减器对经参比光路和样品光路的光的吸收强度进行对照。因此通过参比和样品后溶剂的影响被消除，得到的谱图只是样品本身的吸收。 3.3 傅立叶变换红外光谱仪 • 目前几乎所有的红外光谱仪都是傅立叶变换型的。色散型仪器的主要不足是扫描速度慢，灵敏度低，分辨率低。因此色散型仪器自身局限性很大。 • 傅立叶变换红外光谱仪的构成 • 时域谱和频域谱的关系以及多色光干涉的时域谱 • 光程差为零时有一极大值。这是因为任一波长的单色光在该处均为相长干涉且位相相同。反之，偏离零光程差的位置，总的干涉光强度则迅速下降。 • 傅立叶变换红外光谱仪的优点 • ?大大提高了谱图的信噪比(throughput or Jaquinot advantage)。FT-IR仪器所用的光学元件少，无狭缝和光栅分光器，因此到达检测器的辐射强度大，信噪比大。 -1• ?波长(数)精度高(?0.01cm)，重现性好。 • ?分辨率高。 • ?扫描速度快(multiplex or Fellgett advantage)。傅立叶变换仪器动镜一次运动完成一次扫描所需时间仅为一至数秒,可同时测定所有的波数区间。而色散型仪器在任一瞬间只观测一个很窄的频率范围,一次完整的扫描需数分钟。 • 由于傅立叶变换红外光谱仪的突出优点，目前已经取代了色散型红外光谱仪。 3.4 红外光谱测定中的样品处理技术 • 液体样品 • 液膜法:液体样品常用液膜法。该法适用于不易挥发(沸点高于80 C)的液体或粘稠溶液。使用两块KBr或NaCl盐片，如图5.11所示。将液体滴1-2滴到盐片上，用另一块盐片将其夹住，用螺丝固定后放入样品室测量。若测定碳氢类吸收较低的化合物时，可在中间放入夹片(spacer，约0.05-0.1mm厚)，增加膜厚。测定时需注意不要让气泡混入，螺丝不应拧得过紧以免窗板破裂。使用以后要立即拆除，用脱脂棉沾氯仿、丙酮擦净。 • 溶液法: • 溶液法适用于挥发性液体样品的测定。使用固定液池，将样品溶于适当溶剂中配成一定浓度的溶液(一般以10%w/w左右为宜)，用注射器注入液池中进行测定。如图所示。所用溶剂应易于溶解样品;非极性，不与样品形成氢键;溶剂的吸收不与样品吸收重合。常用溶剂为CS、2CCl、CHCl等。 43 • 水溶液的简易测定法: 由于盐片窗口怕水，因此一般水溶液不能测定红外光谱。利用聚乙烯薄膜是水溶液红外光谱测定的一种简易方法。如图所示，在金属管上铺一层聚乙烯薄膜，其上压入一橡胶圈。滴下水溶液后，再盖一层聚乙烯薄膜，用另一橡胶圈固定后测定。需注意的是，聚乙烯、水及重水都有红外吸收。 • 固体样品 • 压片法: • 固体样品常用压片法，它也是固体样品红外测定的标准方法。将固体样品0.5-1.0mg与150mg左右的KBr一起粉碎，用压片机压成薄片。薄片应透明均匀。压片模具及压片机因生产厂家不同而异。如图是一种压片模具的示意图。 • 调糊法: • 固体样品还可用调糊法(或重烃油法，Nujol法)。将固体样品(5-10mg)放入研钵中充分研细，滴1-2滴重烃油调成糊状，涂在盐片上用组合窗板组装后测定。若重烃油的吸收妨碍样品测定，可改用六氯丁二烯。 • 薄膜法: • 适用于高分子化合物的测定。将样品溶于挥发性溶剂后倒在洁净的玻璃板上，在减压干燥器中使溶剂挥发后形成薄膜，固定后进行测定。 -1-1常见盐片的红外透明范围为:KBr(400 cm )，NaCl(650 cm )， -1CsI(150 cm )等。 • 气体样品 • 气体样品的测定可使用窗板间隔为2.5-10cm的大容量气体池，如图所示。抽真空后，向池内导入待测气体。测定气体中的少量组分时使用池中的反射镜，其作用是将光路长增加到数十米。气体池还可用于挥发性很强的液体样品的测定。 特殊红外测定技术 • 全反射法 ATR • 全反射法可用于样品深度方向及表面分析。利用一特殊棱镜(如TlBr -1和TlI作成的KRS-5棱镜在250cm以上透明)，在其两面夹上样品(如 图)，入射光从样品一侧照射进入(入射角为35-50?)，经在样品、棱镜中多次反射后到达检测器。此法用于测定不易溶解、熔化、难于粉碎的弹性或粘性样品，如涂料、橡胶、合成革、聚氨基甲酸乙酯等表面及其涂层。可用于表面薄膜的测定。 • 反射吸收法 RAS • 反射吸收法用于样品表面、金属板上涂层薄膜的测定。甚至单分子层的解析。如图，入射光经反射镜照射到置于样品窗的样品表面，其反射光再经另一反射镜进入仪器。反射吸收测定的原理是，只有与基板垂直的偶极矩变化可以被选择性地检测。 • 粉末反射法DR • 粉末反射法又称扩散反射法。KBr压片法适用或不适用的样品都可用DR法测定，也用于微小样品、色谱馏分定性、吸附在粉末表面的样品分析。 • 照射到粉末样品上的光首先在其表面反射，一部分直接进入检测器，另一部分进入样品内部多次透射、散射后再从表面射出，后者称为扩散反射光。DR法就是利用扩散散射光获取红外光谱的方法。与压片法相比，DR法由于测定的是多次透过样品的光，因此两者的光谱强度比不同，压片法中的弱峰有时会增强。 • 显微红外法 • 与薄片切片机(microtome)等并用，显微红外法可以进行微小部分的结构解析。检测限可达pg级，空间分辨率为10um。 • 红外光声光谱法PAS • 用光声池、前置放大器代替傅立叶变换红外光谱仪的检测器，就构成了傅立叶变换红外光声光谱仪。样品置于光声池中测定。 • 红外光声光谱法主要用于下列样品的测定: • ?强吸收、高分散的样品。如深色催化剂、煤及人发等。 • ?橡胶、高聚物等难以制样的样品。 • ?不允许加工处理的样品。如古物表层等。 • 各种红外测定技术的适用对象,根据样品性质的不同可以选择适当的测定技术。 4 红外光谱与分子结构的关系 • 红外光谱源于分子振动产生的吸收，其吸收频率对应于分子的振动频率。大量实验结果表明，一定的官能团总是对应于一定的特征吸收频率，即有机分子的官能团具有特征红外吸收频率。这对于利用红外谱图进行分子结构鉴定具有重要意义。 -1-1• 红外谱图有两个重要区域。4000-1300cm的高波数段和1300cm以下的低波数段。前者称为官能团区，后者称为指纹区。 • 含氢官能团(折合质量小)、含双键或叁键的官能团(键力常数大)在官能团区有吸收，如OH，NH以及C=O等重要官能团在该区域有吸收，它们的振动受分子中剩余部分的影响小。如果待测化合物在某些官能团应该出峰的位置无吸收，则说明该化合物不含有这些官能团。 • 不含氢的单键(折合质量大)、各键的弯曲振动(键力常数小)出现在 -11300cm以下的低波数区。该区域的吸收特点是振动频率相差不大，振动的耦合作用较强，因此易受邻近基团的影响。同时吸收峰数目较多，代表了有机分子的具体特征。大部分吸收峰都不能找到归属，犹如人的指纹。因此，指纹区的谱图解析不易，但与标准谱图对照可以进行最终确认。指纹区还包含了分子的骨架振动。 4.1官能团的特征吸收频率 4.2影响官能团吸收频率的因素 • 诱导效应 • 共轭效应 • 共振效应 • 空间效应 • 氢键的影响 5 红外光谱的应用 • 红外光谱主要用于有机化合物的结构鉴定。如果从样品的出处可以大致推测结构，则确认特定原子团或原子团间的结合就比较容易。通过 测定已知物与待测样品的红外光谱进行比较，两者应一致。但需要注意以下几点: • ?即使同一物质，其红外谱图的测定条件(如测定方法，样品状态、浓度，仪器操作条件等)不同，谱图也有所差别。 • ?特征吸收受分子整体的影响会略有偏移。这种偏移在得出结论时要考虑。如相邻基团的状态，与溶剂的作用等。 • ?如果有部分不一致，还应考虑杂质的存在。 • 对于完全未知的样品，则需进行谱图解析。但完全依靠红外光谱来进行化合物的最后确认相当困难，需要结合其他谱图信息(核磁共振，质谱，紫外光谱等)。 6. 拉曼光谱 • 1928年，印度物理学家C. V. Raman发现光通过透明溶液时，有一部分光被散射，其频率与入射光不同，频率位移与发生散射的分子结构有关。这种散射称为拉曼散射，频率位移称为拉曼位移。 • 由红外光谱及拉曼光谱可以获得分子结构的直接信息，仪器分辨率高。采用显微测定等手段可以进行非破坏、原位测定以及时间分辨测定等。 6.1 拉曼光谱简介 • 从图中可见，拉曼光谱的横坐标为拉曼位移，以波数表示。 Stokes位移和入射光波数。纵坐标为拉曼光强。 • 由于拉曼位移与激发光无关，一般仅用Stokes位移部分。对发荧光的分子，有时用反Stokes位移。 拉曼光谱的特点 • ?波长位移在中红外区。有红外及拉曼活性的分子,其红外光谱和拉曼光谱近似。 • ?可使用各种溶剂，尤其是能测定水溶液，样品处理简单。 ?低波数段测定容易(如金属与氧、氮结合键的振动nM-O, nM-N等)。而红外光谱的远红外区不适用于水溶液，选择窗口材料、检测器困难。 • ?由Stokes、反Stokes线的强度比可以测定样品体系的温度。 • ?显微拉曼的空间分辨率很高，为1mm。 • ?时间分辨测定可以跟踪10-12s量级的动态反应过程。 ?利用共振拉曼、表面增强拉曼可以提高测定灵敏度。 其不足之处在于， 激光光源可能破坏样品;荧光性样品测定一般不适用，需改用近红外激光激发等等。 瑞利和拉曼散射的产生 • 测定拉曼散射光谱时，一般选择激发光的能量大于振动能级的能量但低于电子能级间的能量差，且远离分析物的紫外-可见吸收峰。当激发光与样品分子作用时，样品分子即被激发至能量较高的虚态(图中用虚线表示)。左边的一组线代表分子与光作用后的能量变化，粗线出现的几率大，细线表示出现的几率小，因为室温下大多数分子处于基态的最低振动能级。中间一组线代表瑞利(Rayleigh)散射，光子与分子间发生弹性碰撞，碰撞时只是方向发生改变而未发生能量交换。 瑞利和拉曼散射的产生 • 右边一组线代表拉曼散射，光子与分子碰撞后发生了能量交换，光子将一部分能量传递给样品分子或从样品分子获得一部分能量,因而改变了光的频率。能量变化所引起的散射光频率变化称为拉曼位移。由于室温下基态的最低振动能级的分子数目最多,与光子作用后返回同一振动能级的分子也最多,所以上述散射出现的几率大小顺序为:瑞利散射>Stokes线>反Stokes线。随温度升高，反Stokes线的强度增加。 • 拉曼活性: • 除去复杂的原理，记住: • 要产生拉曼散射，分子的极化度必须是核间距的函数，只有振动时极化度发生变化的分子才是拉曼活性的。 6.3 拉曼光谱参数 • ?频率 即拉曼位移，一般用Stokes位移表示。是结构鉴定的重要依据。 • ?强度I • ?去偏振度 r (depolarization) 红外及拉曼光谱法的比较 • 红外及拉曼光谱法的相同点在于，对于一个给定的化学键，其红外吸收频率与拉曼位移相等，均代表第一振动能级的能量。因此，对某一给定的化合物，某些峰的红外吸收波数与拉曼位移完全相同，红外吸收波数与拉曼位移均在红外光区，两者都反映分子的结构信息。 • 从图中可以看出，同一物质，有些峰的红外吸收与拉曼散射完全对应， 但也有许多峰有拉曼散射却无红外吸收，或有红外吸收却无拉曼散射。因此，红外光谱与拉曼光谱互补，可用于有机化合物的结构鉴定。 • 红外光谱的入射光及检测光均是红外光，而拉曼光谱的入射光大多数是可见光 ，散射光也是可见光。红外光谱测定的是光的吸收，横坐标用波数或波长表示，而拉曼光谱测定的是光的散射，横坐标是拉曼位移。 • 两者的产生机理不同。红外吸收是由于振动引起分子偶极矩或电荷分布变化产生的。拉曼散射是由于键上电子云分布产生瞬间变形引起暂时极化，产生诱导偶极，当返回基态时发生的散射。散射的同时电子云也恢复原态。 6.4 拉曼光谱仪 • 拉曼光谱仪的光源为激光光源。 • 由于拉曼散射很弱，因此要求光源强度大，一般用激光光源。有可见及红外激光光源等。如具有308nm，351nm发射线的紫外激光器;Ar+激光器一般在488.0nm, 514.5nm等可见区发光;而Nd:YaG激光器则在1064nm的近红外区使用。 • 色散型拉曼光谱仪有多个单色器(double or triple monochrometer system)。 • 由于测定的拉曼位移较小，因此仪器需要较高的单色性。在傅立叶变换拉曼光谱仪中，以迈克尔逊干涉仪代替色散元件，光源利用率高，可采用红外激光，用以避免分析物或杂质的荧光干扰。 • 拉曼光谱仪的检测器为光电倍增管、多探测器(如CCD: Charge Coupled Device)等。 • 微区分析装置的应用。 • 微区分析装置是拉曼光谱仪的一个附件，由光学显微镜、电子摄像管、显象荧光屏、照相机等组成。可以将局部样品的放大图显示在荧光屏上，用照相机拍摄样品的显微图象。如人眼球晶体中白内障病变部位的观测等。 6.5 拉曼光谱的应用 • 用通常的拉曼光谱可以进行半导体、陶瓷等无机材料的分析。如剩余应力分析、晶体结构解析等。拉曼光谱还是合成高分子、生物大分子分析的重要手段。如分子取向、蛋白质的巯基、卟啉环等的分析。 • 此外，拉曼光谱在燃烧物分析、大气污染物分析等方面有重要应用。 • 从图中可以看出，不同的碳材料其拉曼光谱不同，因此可以彼此区分。 共振拉曼 RRS(Resonance Raman Scattering) • 以分析物的紫外-可见吸收光谱峰的邻近处作为激发波长。样品分子吸光后跃迁至高电子能级并立即回到基态的某一振动能级，产生共振拉 -14曼散射。该过程很短，约为10秒。而荧光发射是分子吸光后先发生振动松弛，回到第一电子激发态的第一振动能级，返回基态时的发光。 -6-8荧光寿命一般为10-10秒。 26• 共振拉曼强度比普通的拉曼光谱法强度可提高10-10倍，检测限可达 -810摩尔/升，而一般的拉曼光谱法只能用于测定0.1摩尔/升以上浓度的样品。因此RRS法用于高灵敏度测定以及状态解析等,如低浓度生物大分子的水溶液测定。共振拉曼的主要不足是荧光干扰。 • 用共振拉曼确定血红蛋白和细胞色素c中Fe的氧化态和Fe原子的自旋状况。此时共振拉曼仅取决于四个吡咯环的振动方式，与蛋白质有关的其它拉曼峰并不增强，在极低浓度时并不干扰。 • 表面增强拉曼 SERS(Surface-Enhanced Raman Scattering) • 表面增强拉曼是用通常的拉曼光谱法测定吸附在胶质金属颗粒如银、金或铜表面的样品，或吸附在这些金属片的粗糙表面上的样品。尽管原因尚不明朗，人们发现被吸附的样品其拉曼光谱的强度可提高 3610-10倍。如果将表面增强拉曼与共振拉曼结合，光谱强度的净增加 -9-12几乎是两种方法增强的和。检测限可低至10-10摩尔/升。表面增强拉曼主要用于吸附物种的状态解析等。 思考题 • 1.简述红外光谱仪的组成及各个部件。 • 2.简述色散型红外光谱仪的特点。 • 3.简述傅里叶变换红外光谱仪的优点。 • 4.简述影响官能团吸收频率的因素。 • 5.比较红外及拉曼光谱。 第七章 核磁共振波谱法 • 核磁共振的基本原理 • 核磁共振波谱仪 • 实验方法和技术 • 二维核磁共振谱 • 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR): 1945年Bloch和Purcell, 因此荣获1952年诺贝尔物理奖。 • 二维核磁共振理论及傅里叶变换核磁共振: R.R. Ernst教授, 1991年诺贝尔化学奖。 • 由此说明了核磁共振的重要性。 • 仪器发展: • 1953年出现第一台核磁共振商品仪器 • 核磁共振在仪器、实验方法、理论和应用等方面有着飞跃的进步: • (1)谱仪频率已从30MHz发展到900MHz。1000MHz谱仪亦在加紧试制之中。 • (2)仪器工作方式从连续波谱仪发展到脉冲-傅里叶变换谱仪。 • (3)随着多种脉冲序列的采用，所得谱图已从一维谱到二维谱、三维谱甚至更高维谱。 • (4)所应用的学科已从化学、物理扩展到生物、医学等多个学科。 1. 核磁共振的基本原理 • 1.1 核磁共振的产生 • 原子核由中子和质子所组成，因此有相应的质量数和电荷数。很多种同位素的原子核都具有磁矩，这样的原子核可称为磁性核，是核磁共 振的研究对象。 • 原子核的磁矩取决于原子核的自旋角动量P，其大小为: • P的大小由I(原子核的自旋量子数)决定。 • 原子核可按，的数值分为以下三类: 121632• (1)中子数、质子数均为偶数，则I=0，如C、O、S。此类原子核不能用核磁共振法进行测定。 (2)中子数与质子数其一为偶数，另一为奇数，则，为半整数，如I=1/2: 11315193137 7911333537H、C、N、F、P、Se, I=3/2:Li、Be、B、S、Cl、Cl等。 2614• (3)中子数、质子数均为奇数，则I为整数，如H(D)、Li、N等I=1;5810Co，I=2;B，I=3。 • (,)、(,)类原子核是核磁共振研究的对象。其中，I=1/2的原子核，其电荷均匀分布于原子核表面，这样的原子核不具有四极矩，其核磁共振的谱线窄，最宜于核磁共振检测。 • 在静磁场中，具有磁矩的原子核存在着不同能级。此时，如运用某一特定频率的电磁波来照射样品，并使该电磁波满足提供相邻能级之间发生跃迁所对应的能量差 ，原子核即可进行能级之间的跃迁，这就是核磁共振。 • 当发生核磁共振现象时，原子核在能级跃迁的过程中吸收了电磁波的能量，由此可检测到相应的信号。 • 1.2 弛豫过程 • 对磁旋比为γ 的原子核外加一静磁场B时，原子核的能级会发生分0 裂。处于低能级的粒子数n将多于高能级的离子数n，这个比值可用12 玻尔兹曼定律计算。由于能级差很小，n和n很接近。设温度为300K，12 磁感强度为1.4092T(即14092G，相应于60MHz射频仪器的磁感强度)，可算出: • 在能够产生核磁共振的电磁波的作用下，n减少，n增加，因二者相12 差不多，当n=n时不能再测出核磁共振信号，称作饱和。 12 • 由此看出，为能连续存在核磁共振信号，必须有从高能级返回低能级的过程，这个过程即称为弛豫过程。 • 弛豫过程有两类。其一为自旋-晶格弛豫，亦称为纵向弛豫。其结果是一些核由高能级回到低能级。该能量被转移至周围的分子(固体的晶格，液体则为周围的同类分子或溶剂分子)而转变成热运动，即纵向弛豫反映了体系和环境的能量交换;第二种弛豫过程为自旋-自旋弛豫，亦称为横向弛豫。这种弛豫并不改变n，n的数值，但影响具体12 的(任一选定的)核在高能级停留的时间。这个过程是样品分子的核之间的作用，是一个熵的效应。 • 类似于化学反应动力学中的一级反应，纵向弛豫，横向弛豫过程的快慢分别用1/T、1/T来描述。T叫纵向弛豫时间，T叫横向弛豫时间。 1212 1.3 核磁共振参数 • (1)化学位移δ 核磁共振法的最主要功效在于:对某一选定的磁性核种(某一同位素)来说，不同官能团中的核，其共振频率会稍有变化，即在谱图中的位置有所不同，因此由不同的谱峰的位置可以确定样品分子中存在着哪些官能团。 • 核外电子对原子核有一定的屏蔽作用， σ称为屏蔽常数。它反映核外电子对核的屏蔽作用的大小，也就是反映了核所处的化学环境。 • 因σ总是远远小于1，峰的位置不便精确测定，故在实验中采用某一标准物质作为基准，以其峰位作为核磁谱图的坐标原点。不同官能团的原子核谱峰位置相对于原点的距离，反映了它们所处的化学环境，故称为化学位移δ， • 式中B、B分别为在固定电磁波频率时，样品和标准物质满足共振样品标准 条件时的磁感强度。δ的单位是ppm，是无量纲的。 δ为一相对值，它与仪器所用的磁感强度无关。用不同磁感强度(也就是用不同电磁波频率)的仪器所测定的δ数值均相同。 • (2)耦合常数 J • 自旋-自旋耦合引起峰的裂分(分裂) • 一般情况下，核磁共振谱都呈现谱峰的分裂，称之为峰的裂分。产生峰的裂分的原因在于核磁矩之间的相互作用，这种作用称为自旋-自旋耦合作用。 • ? 受耦合作用而产生的谱线裂分数为n+1，n表示产生耦合的原子核(其自旋量子数为1/2)的数目，这称为n+1规律。若考虑一般情况，因受自旋量子数为I的n个原子核耦合，产生的谱线数目为2nI+1，这称为2nI+1规律。n+1规律是2nI+1规律的特例(I=1/2)，却是最经常使用的。需强调，n为产生耦合作用的核数。 • ? 每相邻两条谱线间的距离都是相等的。 n? 谱线间强度比为(a+b)展开式的各项系数。 • 谱线裂分所产生的裂距是相等的，它反映了核之间耦合作用的强弱，称为耦合常数J，以Hz为单位。 耦合常数J反映的是两个核之间作用的强弱，故其数值与仪器的工作频率无关。 • 耦合常数的大小和两个核在分子中相隔化学键的数目密切相关，故在 131J的左上方标以两核相距的化学键数目。如C-H之间的耦合常数标为111212113J，而H-C-C-H中两个H之间的耦合常数标为J。耦合常数随化学键数目的增加而迅速下降，因自旋耦合是通过成键电子传递的。两个氢核相距四根键以上即难以存在耦合作用，若此时J?0，则称为远程 2耦合或长程耦合。碳谱中J以上即称为长程耦合。 谱线分裂的裂距反映耦合常数J的大小，确切地说，反映了J的绝对值。J是有正负号的，但在常见的谱图中往往不能确定它的符号。 • (3)其它参数 • 峰面积: • 峰面积反映了某种(官能团)原子核的定量信息。这对推测未知物结构或对混合物体系进行定量分析均是重要的。核磁谱仪在画完样品的 谱图之后，可以再画出相应的积分曲线。 • 纵向弛豫时间T和横向弛豫时间T 12 弛豫时间和所讨论的核在分子中的环境有关。弛豫时间的测定有助于谱线归属的标识，也可用来研究分子的大小，分子(或离子)与溶剂的缔合，分子内的旋转，链节运动，分子运动的各向异性等，需补充的是T较T更能提供信息。 12 2.核磁共振波谱仪 • 本节所讨论的内容限于测试液态样品的高分辨核磁共振波谱仪，不涉及测定固体样品及生物活体的特殊要求。 2.1 脉冲-傅里叶变换核磁共振波谱线 • 为产生核磁共振，必须满足提供能级跃迁的能量。最简单的方式就是固定电磁波频率，连续扫描静磁感强度来实现。当然也可以固定静磁感强度，连续改变电磁波频率。不论上述中的哪一种，都称为连续扫描方式，以这样方式工作的谱仪称为连续波谱仪。这样的谱仪有很多缺点:效率低，采样慢，难于累加，更不能实现核磁共振的新技术，因此连续波谱仪已被取代为脉冲-傅里叶变换核磁共振波谱图。 • 所有傅里叶变换分析仪器都有共同点:首先是在一个很短的时间内激发所有的检测对象，使它们都产生相应的信号;其次是计算机把所有检测对象同时产生的信号(我们称为时域信号，因其变量为时间)转换为按频率分布的信号，即我们所熟悉的频谱。对傅里叶变换核磁共振波谱来说，首先就要使不同基团的核同时共振，同时产生各自的核磁共振信号。为达到这点，我们在某一时刻对样品应加一个相当宽的频谱的射频。 • 脉冲宽度应足够短，脉冲应有足够的强度。我们可以这样来理解，连续波谱仪在任一瞬间最多只有一种原子核共振，而现在，几微秒的时间间隔之内，所有的原子核(指所观测的但处于不同官能团的某种同位素)都要共振，它们吸收的能量都来自脉冲，因而脉冲需有足够强 -6度。在连续波谱仪中，射频强度是10T数量级，而在傅里叶变换谱仪 -4中是几到几十10T数量级。 • 在强而短的脉冲作用下，所观测的同位素的所有不同官能团的原子核都发生了核磁共振。在脉冲停止之后，它们都产生相应的核磁共振信号。这些信号含多种频率，总的信号是多种频率信号的叠加。这样的信号是以时间为变量的，也是随时间而衰减的，称作自由感应衰减信号。这样的信号是不能直接利用的，因它是时畴谱(时域谱)，人们不能识别，需要把它转换成频畴谱(频域谱)，这个转换由计算机完成，这是一个傅里叶变换过程。 • 傅里叶变换核磁共振波谱仪的原理早已被探讨清楚，但直至1965年Cooley和Tukey提出快速傅里叶变换计算方法后，商品傅里叶变换核磁共振波谱仪才得以在70年代问世。 采用脉冲-傅里叶变换仪器可方便地对少量样品进行累加测试。使对样品量的要求大为降低并大大改善信噪比。由于采用脉冲，因而可以设计多种脉冲序列，完成多种用连续波谱仪根本无法完成的实验，有人称之为“自旋工程”。多种多样的核磁共振二维谱就是重要的例子。 • 600MHz核磁共振波谱仪(局部) • 谱仪的主要部件: • 核磁共振波谱仪在空间上由两部分:磁铁或磁体(内含探头)和谱仪主体。高频谱仪采用超导磁体，它与谱仪主体相距较大，以降低磁场对操作人员的影响。 磁铁或磁体 • 磁铁或磁体产生强的静磁场，以满足产生核磁共振的要求。由于电磁铁不可避免地会消耗大量电能，已经停止生产，因此仅采用永久磁铁。200MHz以上高频谱仪采用超导磁体，它利用含铌合金在液氦温度下的超导性质。 • 由含铌合金丝缠绕的超导线圈完全浸泡在液氦中间。为减低液氦的消耗，其外围是液氮层。液氦及液氮均由高真空的罐体贮存，以降低蒸发量。在液氮、液氦均灌装以后，由一套专用的连接装置，通过液氦导管下方的超导线圈电流输入插座，对超导线圈缓慢地通入电流。当 超导线圈中的电流达到额定值(也即是产生额定的磁感强度时)，使线圈的两接头闭合。只要液氦始终完全淹没线圈，含铌合金在此温度下的超导性则使电流一直维持下去。以上过程为谱仪安装过程中的升场。液氦需及时补充，视不同谱仪而定，约为3至10月。每7至10天则需补加液氮。 • 磁体的中心为探头，为使磁力线均匀，铅垂，设置有两大组匀场线圈。每大组匀场线圈又由多组线圈构成。后者每组线圈产生一组特殊的磁力线，由它们的综合作用，产生均匀的磁场。两(大)组匀场线圈为低温匀场线圈和室温匀场线圈。低温匀场线圈浸泡在液氦中，升场以后进行调节。室温匀场线圈由分析测试人员在放置样品管后进行调节。 • 无论是用磁铁或磁体，核磁共振谱仪均要求磁场高度均匀，若样品中各处磁场不均匀，各处的原子核共振频率不同，这将导致谱峰加宽，即分辨率下降。为使磁场匀均，除前面所讲的采用低温和室温两大组匀场线圈之外，还有后面将叙述的使样品管旋转。 • 还要求磁场随时间稳定，这就要采用锁场装置。 探头 • 探头是核磁谱仪的核心部件，它固定于磁体或磁铁的中心，为圆柱形，探头的中心放置装载样品溶液的样品管。探头对样品发射产生核磁共振的射频波脉冲并检测核磁共振的信号。这两个功能常可由一个线圈来完成。在此线圈之外有去耦线圈，以测得去耦的谱图。 谱仪主体 • 除磁体(或磁铁)和探头之外，核磁共振谱仪尚包括多个部件，如射频发生器，前置放大器，接收器等等。由于是傅里叶变换分析仪器，必须有相应的计算机硬件、软件。高频核磁谱仪一般配有工作站，以进行复杂的运算和操作。 3.实验方法和技术 • 3.1 样品的制备 • 在测试样品时，选择合适的溶剂配制样品溶液，样品的溶液应有较低 的粘度，否则会降低谱峰的分辨率。若溶液粘度过大，应减少样品的用量或升高测试样品的温度(通常是在室温下测试)。 当样品需作变温测试时，应根据低温的需要选择凝固点低的溶剂或按高温的需要选择沸点高的溶剂。 • 对于核磁共振氢谱的测量，应采用氘代试剂以便不产生干扰信号。氘代试剂中的氘核又可作核磁谱仪锁场之用。以用氘代试剂作锁场信号的"内锁"方式作图，所得谱图分辨率较好。特别是在微量样品需作较长时间的累加时，可以边测量边调节仪器分辨率。 对低、中极性的样品，最常采用氘代氯仿作溶剂，因其价格远低于其它氘代试剂。极性大的化合物可采用氘代丙酮、重水等。 针对一些特殊的样品，可采用相应的氘代试剂:如氘代苯(用于芳香化合物、芳香高聚物)、氘代二甲基亚砜(用于某些在一般溶剂中难溶的物质)、氘代吡啶(用于难溶的酸性或芳香化合物)等。 • 对于核磁共振碳谱的测量，为兼顾氢谱的测量及锁场的需要，一般仍采用相应的氘代试剂。 为测定化学位移值，需加入一定的基准物质。基准物质加在样品溶液中称为内标。若出于溶解度或化学反应性等的考虑，基准物质不能加在样品溶液中，可将液态基准物质(或固态基准物质的溶液)封入毛细管再插到样品管中，称之为外标。 • 对碳谱和氢谱，基准物质最常用四甲基硅烷。 • 记录常规氢谱的操作 • 记录常规碳谱的操作 • 记录二维核磁共振谱 • 多重共振 4.二维核磁共振谱 • 发展历程: • 1939:气态NMR试验成功 1945:凝聚态NMR试验成功 1945:美物理学家Block和Purcell同时发现NMR现象，证实了核自旋 的存在，为量子力学的一些理论提供了直接的验证，是本世纪物理学发展史上的一件大事 141950:W.G.Proctor和当时旅美学者虞福春发现NHNO中N的共振谱43线为两条，说明同一核在不同化学环境会表现出不同的核磁共振信号(化学位移δ不同) 191951:Gutowsky等发现POClF溶液中F谱图中有两条谱线，而分子2 中只有一个F，由此发现了自旋--自旋耦合(spin-spincoupling) 1952:Block和Purcell二人因发现NMR现象，获诺贝尔物理奖。 • 1961:法国著名物理学家A.Abragam出版专著《核磁学原理》，目前已成为物理学中广泛引用的专著 1966:高分辨核磁共振谱仪出现 1970年代:R.R.Ernst创立脉冲傅里叶变换核磁共振(FT-NMR) 1970-1980年代:R.R.Ernst发展了二维核磁共振(2DNMR) 1987:R.R.Ernst及其学生G.Bodenhausen和A.Wokaun合作出版《一维和二维核磁共振原理》，此书与A.Abragam出版的专著《核磁学原理》被国际NMR领域称为NMR发展史上的两块里程碑 1991:R.R.Ernst因其创立脉冲傅里叶变换核磁共振(FT-NMR)及发展二维核磁共振(2DNMR)这两项杰出贡献,当之无愧的独享了1991年诺贝尔化学奖 • 原理: • 二维核磁共振波谱实验在时间域上可以分为四个时期，即准备期，演化期，混合期和检测期。 • 准备期一般比较长，使自旋系统达到热平衡。演化期，加上一个或多个射频脉冲使核系统演化。混合期包括脉冲和延迟时间。在检测期信号作为t2的函数被检测，并以演化期的时间间隔t1为参数。保持其余部分不变，而使发展期的时间t1逐渐增加一个步长delta1，重复多次实验，即可得到时间域的二维信号S(t1，t2)，对此作二维傅里叶变换即得频率域的二维核磁共振谱S(w1，w2)。 • 特点: • 二维核磁共振谱是将化学位移、耦合常数等核磁共振参数展开在二维 平面上，这样在一维谱中重叠在一个频率坐标轴上的信号分别在两个独立的频率坐标轴上展开，这样不仅减少了谱线的拥挤和重叠，而且提供了自旋核之间相互作用的信息。这些对推断一维核磁共振谱图中难以解析的复杂化合物结构具有重要作用。 5.核磁共振的应用 • NMR技术即核磁共振谱技术，是将核磁共振现象应用于分子结构测定的一项技术。对于有机分子结构测定来说，核磁共振谱扮演了非常重要的角色，核磁共振谱与紫外光谱、红外光谱和质谱一起被有机化学 113家们称为“四大名谱”。目前对核磁共振谱的研究主要集中在H和C两类原子核的图谱。 核磁共振的特点 • ?共振频率决定于核外电子结构和核近邻组态; • ?共振峰的强弱决定于该组态在合金中所占的比例; • ?谱线的分辨率极高。 • 早期的核磁共振谱主要集中于氢谱，这是由于能够产生核磁共振信号 1的H原子在自然界丰度极高，由其产生的核磁共振信号很强，容易检测。随着傅立叶变换技术的发展，核磁共振仪可以在很短的时间内同时发出不同频率的射频场，这样就可以对样品重复扫描，从而将微弱 13的核磁共振信号从背景噪音中区分出来，这使得人们可以收集C核磁共振信号。 • 近年来发展的二维核磁共振谱技术，使人们能够获得更多关于分子结构的信息，目前二维核磁共振谱已经可以解析分子量较小的蛋白质分子的空间结构。 核磁共振-生物学中应用 • 核磁共振波谱技术用来研究生物大分子有如下特点: • ?不破坏生物高分子结构(包括空间结构)。 ?在溶液中测定符合生物体的常态，也可测定固体样品，比较晶态和溶液态的构象异同。 ?不仅可用来研究构象而且可用来研究构象变化即动力学过程。 ?可以提供分子中个别基团的信息，对于比较小的多肽和蛋白质已可通过二维NMR获得全部三维结构信息。 ?可用来研究活细胞和活组织。 1133115191• 在生物学研究中最常用的是H，C，P谱，此外还有N，F等。H 1谱发展最早，H在生物体中无所不在，核磁相对灵敏度高，故应用最广，包括用于核磁成像。缺点是含氢基团极多，谱线易重叠而不易解 1213析。碳亦为生物体内重要元素，但C自旋为零，C天然丰度低，仅 1为1.1,，对等数量的核在相同磁场下其灵敏度只及H的1.6,。其优点是化学位移范围宽，在宽带去耦条件下进行实验，波谱简单，易分 1313辨，随着测定技术及C标记方法的发展，C 谱已有极广泛的应用。31P谱常用于活组织测定，观察ATP等含磷化合物的代谢过程，并已用于核磁成像。 • NMR在生物学研究中范围很广。主要有: • 分析研究 :如确定生物分子成分及浓度，特别是可不破坏组织细胞而测知其中组分;确定异构体比例;确定分子解离状态;确定金属离子或配基是否处于结合状态;以及测定细胞膜内外的pH差异。 • 热力学研究:如测定酶与底物、配基、抑制剂的结合常数;测定可解离基团的pK值，特别是能测定生物大分子中分处不同微环境的同类残基的同类基团的不同pK值，这是其他方法所不及的;还可测定相变温度，ΔG等其他热力学参数。 • 动力学研究:监测反应进程，测定各组分随时间的变化;通过变温实验和线形分析，测平衡过程的动力学常数，包括某些生化反应的反应速率，研究分子间(如酶与抑制剂，DNA与药物)相互作用的动力学过程。 • 分子运动研究:弛豫参数(T，T，NOE)可用来研究生物高分子的12 动力学，以及生物膜的流动性。 • 分子构象及构象变化研究:目前用二维核磁共振技术加上计算机模拟已能独立确定小的蛋白质分子及核苷酸片段在溶液中的三维空间结构。改变物理化学因素或加入可与生物分子相互作用的其他物质，将会使核磁图谱发生变化，从而可用来研究这种构象变化。 31131• 活体研究:用P，C，H磁共振方法测定活细胞，活组织以致整体的代谢物浓度及变化，测定细胞内pH值，观察药物或不同生理状况对代谢的影响。研究对象有微生物、植物、各种动物以至人体器官等。 核磁共振成像 • 核磁共振成像(NMR image，MRI)技术是核磁共振在医学领域的应用。人体内含有非常丰富的水，不同的组织，水的含量也各不相同，如果能够探测到这些水的分布信息，就能够绘制出一幅比较完整的人体内部结构图像，核磁共振成像技术就是通过识别水分子中氢原子信号的分布来推测水分子在人体内的分布，进而探测人体内部结构的技术。 • 最早的核磁共振成像实验是由1973年劳特伯发表的，并立刻引起了广泛重视，短短10年间就进入了临床应用阶段。作用在样品上有一稳定磁场和一个交变电磁场，去掉电磁场后，处在激发态的核可以跃迁到低能级，辐射出电磁波，同时可以在线圈中感应出电压信号，称为核磁共振信号。 • 人体组织中由于存在大量水和碳氢化合物而含有大量的氢核，一般用氢核得到的信号比其他核大1000倍以上。正常组织与病变组织的电压信号不同，结合CT技术，即电子计算机断层扫描技术，可以得到人体组织的任意断面图像，尤其对软组织的病变诊断，更显示了它的优点，而且对病变部位非常敏感，图像也很清晰。若将核磁共振的频率变数增加到两个或多个，可以实现二维或多维核磁共振，从而获得比一维核磁共振更多的信息。 • 目前核磁共振成像应用仅限于氢核，但从实际应用的需要，还要求可以对其他一些核如:C13、N14、P31、S33、Na23、I127等进行核磁共振成像。C13已经进入实用阶段，但仍需要进一步扩大和深入。核磁共振与其他物理效应如穆斯堡尔效应(γ射线的无反冲共振吸收效应)、电子自旋共振等的结合可以获得更多有价值的信息，无论在理论上还是在实际应用中都有重要意义。核磁共振拥有广泛的应用前景，伴随着脉冲傅里叶技术已经取得了一次突破，使C13谱进入应用阶段，有理由相信，其它核的谱图进入应用阶段应为期不远。 • 与用于鉴定分子结构的核磁共振谱技术不同，核磁共振成像技术改编的是外加磁场的强度，而非射频场的频率。核磁共振成像仪在垂直于主磁场方向会提供两个相互垂直的梯度磁场，这样在人体内磁场的分布就会随着空间位置的变化而变化，每一个位置都会有一个强度不同、方向不同的磁场，这样，位于人体不同部位的氢原子就会对不同的射频场信号产生反应，通过记录这一反应，并加以计算处理，可以获得水分子在空间中分布的信息，从而获得人体内部结构的图像。 • 应用核磁共振断层成像术显示人的大脑 • 核磁共振成像技术还可以与X射线断层成像技术(CT)结合为临床诊断和生理学、医学研究提供重要数据。核磁共振成像技术是一种非介入探测技术，相对于X-射线透视技术和放射造影技术，MRI对人体没有辐射影响，相对于超声探测技术，核磁共振成像更加清晰，能够显示更多细节，此外相对于其他成像技术，核磁共振成像不仅仅能够显示有形的实体病变，而且还能够对脑、心、肝等功能性反应进行精确的判定。在帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、癌症等疾病的诊断方面，MRI技术都发挥了非常重要的作用。 • 磁共振成像与1901年获得诺贝尔物理学奖的普通X射线或1979年获得诺贝尔医学奖的计算机层析成像(computerized tomography, CT)相比，磁共振成像的最大优点是它是目前少有的对人体没有任何伤害的安全、快速、准确的临床诊断方法。如今全球每年至少有6000万病例利用核磁共振成像技术进行检查。具体说来有以下几点: • 对人体没有游离辐射损伤;各种参数都可以用来成像，多个成像参数能提供丰富的诊断信息，这使得医疗诊断和对人体内代谢和功能的研究方便、有效。能获得脑和脊髓的立体图像，不像CT(只能获取与人体长轴垂直的剖面图)那样一层一层地扫描而有可能漏掉病变部位;能诊断心脏病变，CT因扫描速度慢而难以胜任;对软组织有极好的分辨力。对膀胱、直肠、子宫、阴道、骨、关节、肌肉等部位的检查优 1于CT;原则上所有自旋不为零的核元素都可以用以成像，例如氢(H)、 13141531碳(C)、氮(N和N)、磷(P)等。 复习思考 • 1.名词: • 核磁共振(原理)，饱和，化学位移，自旋-自旋耦合作用，耦合常数 • 2.什么是弛豫，分为几类, • 3.采用脉冲-傅里叶变换仪器的好处, • 4.论述应用核磁共振波普分析时样品的制备。 • 5.简述二维核磁共振波谱实验原理。 • 6.讨论核磁共振在生物学研究中的应用。 • 7.讨论核磁共振应用于生物大分子研究的特点。 第七章 核磁共振波谱法 • 核磁共振的基本原理 • 核磁共振波谱仪 • 实验方法和技术 • 二维核磁共振谱 • 核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance, NMR): 1945年Bloch和Purcell, 因此荣获1952年诺贝尔物理奖。 • 二维核磁共振理论及傅里叶变换核磁共振: R.R. Ernst教授, 1991年诺贝尔化学奖。 • 由此说明了核磁共振的重要性。 • 仪器发展: • 1953年出现第一台核磁共振商品仪器 • 核磁共振在仪器、实验方法、理论和应用等方面有着飞跃的进步: • (1)谱仪频率已从30MHz发展到900MHz。1000MHz谱仪亦在加紧试制之中。 • (2)仪器工作方式从连续波谱仪发展到脉冲-傅里叶变换谱仪。 • (3)随着多种脉冲序列的采用，所得谱图已从一维谱到二维谱、三维谱甚至更高维谱。 • (4)所应用的学科已从化学、物理扩展到生物、医学等多个学科。 1. 核磁共振的基本原理 • 1.1 核磁共振的产生 • 原子核由中子和质子所组成，因此有相应的质量数和电荷数。很多种同位素的原子核都具有磁矩，这样的原子核可称为磁性核，是核磁共振的研究对象。 • 原子核的磁矩取决于原子核的自旋角动量P，其大小为: • P的大小由I(原子核的自旋量子数)决定。 • 原子核可按，的数值分为以下三类: 121632• (1)中子数、质子数均为偶数，则I=0，如C、O、S。此类原子核不能用核磁共振法进行测定。 (2)中子数与质子数其一为偶数，另一为奇数，则，为半整数，如I=1/2: 11315193137 7911333537H、C、N、F、P、Se, I=3/2:Li、Be、B、S、Cl、Cl等。 2614• (3)中子数、质子数均为奇数，则I为整数，如H(D)、Li、N等I=1;5810Co，I=2;B，I=3。 • (,)、(,)类原子核是核磁共振研究的对象。其中，I=1/2的原子核，其电荷均匀分布于原子核表面，这样的原子核不具有四极矩，其核磁共振的谱线窄，最宜于核磁共振检测。 • 在静磁场中，具有磁矩的原子核存在着不同能级。此时，如运用某一特定频率的电磁波来照射样品，并使该电磁波满足提供相邻能级之间发生跃迁所对应的能量差 ，原子核即可进行能级之间的跃迁，这就是核磁共振。 • 当发生核磁共振现象时，原子核在能级跃迁的过程中吸收了电磁波的能量，由此可检测到相应的信号。 • 1.2 弛豫过程 • 对磁旋比为γ 的原子核外加一静磁场B时，原子核的能级会发生分0 裂。处于低能级的粒子数n将多于高能级的离子数n，这个比值可用12 玻尔兹曼定律计算。由于能级差很小，n和n很接近。设温度为300K，12 磁感强度为1.4092T(即14092G，相应于60MHz射频仪器的磁感强度)， 可算出: • 在能够产生核磁共振的电磁波的作用下，n减少，n增加，因二者相12 差不多，当n=n时不能再测出核磁共振信号，称作饱和。 12 • 由此看出，为能连续存在核磁共振信号，必须有从高能级返回低能级的过程，这个过程即称为弛豫过程。 • 弛豫过程有两类。其一为自旋-晶格弛豫，亦称为纵向弛豫。其结果是一些核由高能级回到低能级。该能量被转移至周围的分子(固体的晶格，液体则为周围的同类分子或溶剂分子)而转变成热运动，即纵向弛豫反映了体系和环境的能量交换;第二种弛豫过程为自旋-自旋弛豫，亦称为横向弛豫。这种弛豫并不改变n，n的数值，但影响具体12 的(任一选定的)核在高能级停留的时间。这个过程是样品分子的核之间的作用，是一个熵的效应。 • 类似于化学反应动力学中的一级反应，纵向弛豫，横向弛豫过程的快慢分别用1/T、1/T来描述。T叫纵向弛豫时间，T叫横向弛豫时间。 1212 1.3 核磁共振参数 • (1)化学位移δ 核磁共振法的最主要功效在于:对某一选定的磁性核种(某一同位素)来说，不同官能团中的核，其共振频率会稍有变化，即在谱图中的位置有所不同，因此由不同的谱峰的位置可以确定样品分子中存在着哪些官能团。 • 核外电子对原子核有一定的屏蔽作用， σ称为屏蔽常数。它反映核外电子对核的屏蔽作用的大小，也就是反映了核所处的化学环境。 • 因σ总是远远小于1，峰的位置不便精确测定，故在实验中采用某一标准物质作为基准，以其峰位作为核磁谱图的坐标原点。不同官能团的原子核谱峰位置相对于原点的距离，反映了它们所处的化学环境，故称为化学位移δ， • 式中B、B分别为在固定电磁波频率时，样品和标准物质满足共振样品标准 条件时的磁感强度。δ的单位是ppm，是无量纲的。 δ为一相对值，它与仪器所用的磁感强度无关。用不同磁感强度(也就是用不同电磁波频率)的仪器所测定的δ数值均相同。 • (2)耦合常数 J • 自旋-自旋耦合引起峰的裂分(分裂) • 一般情况下，核磁共振谱都呈现谱峰的分裂，称之为峰的裂分。产生峰的裂分的原因在于核磁矩之间的相互作用，这种作用称为自旋-自旋耦合作用。 • ? 受耦合作用而产生的谱线裂分数为n+1，n表示产生耦合的原子核(其自旋量子数为1/2)的数目，这称为n+1规律。若考虑一般情况，因受自旋量子数为I的n个原子核耦合，产生的谱线数目为2nI+1，这称为2nI+1规律。n+1规律是2nI+1规律的特例(I=1/2)，却是最经常使用的。需强调，n为产生耦合作用的核数。 • ? 每相邻两条谱线间的距离都是相等的。 n? 谱线间强度比为(a+b)展开式的各项系数。 • 谱线裂分所产生的裂距是相等的，它反映了核之间耦合作用的强弱，称为耦合常数J，以Hz为单位。 耦合常数J反映的是两个核之间作用的强弱，故其数值与仪器的工作频率无关。 • 耦合常数的大小和两个核在分子中相隔化学键的数目密切相关，故在 131J的左上方标以两核相距的化学键数目。如C-H之间的耦合常数标为111212113J，而H-C-C-H中两个H之间的耦合常数标为J。耦合常数随化学键数目的增加而迅速下降，因自旋耦合是通过成键电子传递的。两个氢核相距四根键以上即难以存在耦合作用，若此时J?0，则称为远程 2耦合或长程耦合。碳谱中J以上即称为长程耦合。 谱线分裂的裂距反映耦合常数J的大小，确切地说，反映了J的绝对值。J是有正负号的，但在常见的谱图中往往不能确定它的符号。 • (3)其它参数 • 峰面积: • 峰面积反映了某种(官能团)原子核的定量信息。这对推测未知物结构或对混合物体系进行定量分析均是重要的。核磁谱仪在画完样品的谱图之后，可以再画出相应的积分曲线。 • 纵向弛豫时间T和横向弛豫时间T 12 弛豫时间和所讨论的核在分子中的环境有关。弛豫时间的测定有助于谱线归属的标识，也可用来研究分子的大小，分子(或离子)与溶剂的缔合，分子内的旋转，链节运动，分子运动的各向异性等，需补充的是T较T更能提供信息。 12 2.核磁共振波谱仪 • 本节所讨论的内容限于测试液态样品的高分辨核磁共振波谱仪，不涉及测定固体样品及生物活体的特殊要求。 2.1 脉冲-傅里叶变换核磁共振波谱线 • 为产生核磁共振，必须满足提供能级跃迁的能量。最简单的方式就是固定电磁波频率，连续扫描静磁感强度来实现。当然也可以固定静磁感强度，连续改变电磁波频率。不论上述中的哪一种，都称为连续扫描方式，以这样方式工作的谱仪称为连续波谱仪。这样的谱仪有很多缺点:效率低，采样慢，难于累加，更不能实现核磁共振的新技术，因此连续波谱仪已被取代为脉冲-傅里叶变换核磁共振波谱图。 • 所有傅里叶变换分析仪器都有共同点:首先是在一个很短的时间内激发所有的检测对象，使它们都产生相应的信号;其次是计算机把所有检测对象同时产生的信号(我们称为时域信号，因其变量为时间)转换为按频率分布的信号，即我们所熟悉的频谱。对傅里叶变换核磁共振波谱来说，首先就要使不同基团的核同时共振，同时产生各自的核磁共振信号。为达到这点，我们在某一时刻对样品应加一个相当宽的频谱的射频。 • 脉冲宽度应足够短，脉冲应有足够的强度。我们可以这样来理解，连续波谱仪在任一瞬间最多只有一种原子核共振，而现在，几微秒的时间间隔之内，所有的原子核(指所观测的但处于不同官能团的某种同位素)都要共振，它们吸收的能量都来自脉冲，因而脉冲需有足够强 -6度。在连续波谱仪中，射频强度是10T数量级，而在傅里叶变换谱仪 -4中是几到几十10T数量级。 • 在强而短的脉冲作用下，所观测的同位素的所有不同官能团的原子核都发生了核磁共振。在脉冲停止之后，它们都产生相应的核磁共振信号。这些信号含多种频率，总的信号是多种频率信号的叠加。这样的信号是以时间为变量的，也是随时间而衰减的，称作自由感应衰减信号。这样的信号是不能直接利用的，因它是时畴谱(时域谱)，人们不能识别，需要把它转换成频畴谱(频域谱)，这个转换由计算机完成，这是一个傅里叶变换过程。 • 傅里叶变换核磁共振波谱仪的原理早已被探讨清楚，但直至1965年Cooley和Tukey提出快速傅里叶变换计算方法后，商品傅里叶变换核磁共振波谱仪才得以在70年代问世。 采用脉冲-傅里叶变换仪器可方便地对少量样品进行累加测试。使对样品量的要求大为降低并大大改善信噪比。由于采用脉冲，因而可以设计多种脉冲序列，完成多种用连续波谱仪根本无法完成的实验，有人称之为“自旋工程”。多种多样的核磁共振二维谱就是重要的例子。 • 600MHz核磁共振波谱仪(局部) • 谱仪的主要部件: • 核磁共振波谱仪在空间上由两部分:磁铁或磁体(内含探头)和谱仪主体。高频谱仪采用超导磁体，它与谱仪主体相距较大，以降低磁场对操作人员的影响。 磁铁或磁体 • 磁铁或磁体产生强的静磁场，以满足产生核磁共振的要求。由于电磁铁不可避免地会消耗大量电能，已经停止生产，因此仅采用永久磁铁。200MHz以上高频谱仪采用超导磁体，它利用含铌合金在液氦温度下的超导性质。 • 由含铌合金丝缠绕的超导线圈完全浸泡在液氦中间。为减低液氦的消耗，其外围是液氮层。液氦及液氮均由高真空的罐体贮存，以降低蒸发量。在液氮、液氦均灌装以后，由一套专用的连接装置，通过液氦导管下方的超导线圈电流输入插座，对超导线圈缓慢地通入电流。当超导线圈中的电流达到额定值(也即是产生额定的磁感强度时)，使线圈的两接头闭合。只要液氦始终完全淹没线圈，含铌合金在此温度下的超导性则使电流一直维持下去。以上过程为谱仪安装过程中的升场。液氦需及时补充，视不同谱仪而定，约为3至10月。每7至10天则需补加液氮。 • 磁体的中心为探头，为使磁力线均匀，铅垂，设置有两大组匀场线圈。每大组匀场线圈又由多组线圈构成。后者每组线圈产生一组特殊的磁力线，由它们的综合作用，产生均匀的磁场。两(大)组匀场线圈为低温匀场线圈和室温匀场线圈。低温匀场线圈浸泡在液氦中，升场以后进行调节。室温匀场线圈由分析测试人员在放置样品管后进行调节。 • 无论是用磁铁或磁体，核磁共振谱仪均要求磁场高度均匀，若样品中各处磁场不均匀，各处的原子核共振频率不同，这将导致谱峰加宽，即分辨率下降。为使磁场匀均，除前面所讲的采用低温和室温两大组匀场线圈之外，还有后面将叙述的使样品管旋转。 • 还要求磁场随时间稳定，这就要采用锁场装置。 探头 • 探头是核磁谱仪的核心部件，它固定于磁体或磁铁的中心，为圆柱形，探头的中心放置装载样品溶液的样品管。探头对样品发射产生核磁共振的射频波脉冲并检测核磁共振的信号。这两个功能常可由一个线圈来完成。在此线圈之外有去耦线圈，以测得去耦的谱图。 谱仪主体 • 除磁体(或磁铁)和探头之外，核磁共振谱仪尚包括多个部件，如射频发生器，前置放大器，接收器等等。由于是傅里叶变换分析仪器，必须有相应的计算机硬件、软件。高频核磁谱仪一般配有工作站，以进行复杂的运算和操作。 3.实验方法和技术 • 3.1 样品的制备 • 在测试样品时，选择合适的溶剂配制样品溶液，样品的溶液应有较低的粘度，否则会降低谱峰的分辨率。若溶液粘度过大，应减少样品的用量或升高测试样品的温度(通常是在室温下测试)。 当样品需作变温测试时，应根据低温的需要选择凝固点低的溶剂或按高温的需要选择沸点高的溶剂。 • 对于核磁共振氢谱的测量，应采用氘代试剂以便不产生干扰信号。氘代试剂中的氘核又可作核磁谱仪锁场之用。以用氘代试剂作锁场信号的"内锁"方式作图，所得谱图分辨率较好。特别是在微量样品需作较长时间的累加时，可以边测量边调节仪器分辨率。 对低、中极性的样品，最常采用氘代氯仿作溶剂，因其价格远低于其它氘代试剂。极性大的化合物可采用氘代丙酮、重水等。 针对一些特殊的样品，可采用相应的氘代试剂:如氘代苯(用于芳香化合物、芳香高聚物)、氘代二甲基亚砜(用于某些在一般溶剂中难溶的物质)、氘代吡啶(用于难溶的酸性或芳香化合物)等。 • 对于核磁共振碳谱的测量，为兼顾氢谱的测量及锁场的需要，一般仍采用相应的氘代试剂。 为测定化学位移值，需加入一定的基准物质。基准物质加在样品溶液中称为内标。若出于溶解度或化学反应性等的考虑，基准物质不能加在样品溶液中，可将液态基准物质(或固态基准物质的溶液)封入毛细管再插到样品管中，称之为外标。 • 对碳谱和氢谱，基准物质最常用四甲基硅烷。 • 记录常规氢谱的操作 • 记录常规碳谱的操作 • 记录二维核磁共振谱 • 多重共振 4.二维核磁共振谱 • 发展历程: • 1939:气态NMR试验成功 1945:凝聚态NMR试验成功 1945:美物理学家Block和Purcell同时发现NMR现象，证实了核自旋的存在，为量子力学的一些理论提供了直接的验证，是本世纪物理学发展史上的一件大事 141950:W.G.Proctor和当时旅美学者虞福春发现NHNO中N的共振谱43线为两条，说明同一核在不同化学环境会表现出不同的核磁共振信号(化学位移δ不同) 191951:Gutowsky等发现POClF溶液中F谱图中有两条谱线，而分子2 中只有一个F，由此发现了自旋--自旋耦合(spin-spincoupling) 1952:Block和Purcell二人因发现NMR现象，获诺贝尔物理奖。 • 1961:法国著名物理学家A.Abragam出版专著《核磁学原理》，目前已成为物理学中广泛引用的专著 1966:高分辨核磁共振谱仪出现 1970年代:R.R.Ernst创立脉冲傅里叶变换核磁共振(FT-NMR) 1970-1980年代:R.R.Ernst发展了二维核磁共振(2DNMR) 1987:R.R.Ernst及其学生G.Bodenhausen和A.Wokaun合作出版《一维和二维核磁共振原理》，此书与A.Abragam出版的专著《核磁学原理》被国际NMR领域称为NMR发展史上的两块里程碑 1991:R.R.Ernst因其创立脉冲傅里叶变换核磁共振(FT-NMR)及发展二维核磁共振(2DNMR)这两项杰出贡献,当之无愧的独享了1991年诺贝尔化学奖 • 原理: • 二维核磁共振波谱实验在时间域上可以分为四个时期，即准备期，演化期，混合期和检测期。 • 准备期一般比较长，使自旋系统达到热平衡。演化期，加上一个或多个射频脉冲使核系统演化。混合期包括脉冲和延迟时间。在检测期信号作为t2的函数被检测，并以演化期的时间间隔t1为参数。保持其余部分不变，而使发展期的时间t1逐渐增加一个步长delta1，重复多次实验，即可得到时间域的二维信号S(t1，t2)，对此作二维傅里叶变换 即得频率域的二维核磁共振谱S(w1，w2)。 • 特点: • 二维核磁共振谱是将化学位移、耦合常数等核磁共振参数展开在二维平面上，这样在一维谱中重叠在一个频率坐标轴上的信号分别在两个独立的频率坐标轴上展开，这样不仅减少了谱线的拥挤和重叠，而且提供了自旋核之间相互作用的信息。这些对推断一维核磁共振谱图中难以解析的复杂化合物结构具有重要作用。 5.核磁共振的应用 • NMR技术即核磁共振谱技术，是将核磁共振现象应用于分子结构测定的一项技术。对于有机分子结构测定来说，核磁共振谱扮演了非常重要的角色，核磁共振谱与紫外光谱、红外光谱和质谱一起被有机化学 113家们称为“四大名谱”。目前对核磁共振谱的研究主要集中在H和C两类原子核的图谱。 核磁共振的特点 • ?共振频率决定于核外电子结构和核近邻组态; • ?共振峰的强弱决定于该组态在合金中所占的比例; • ?谱线的分辨率极高。 • 早期的核磁共振谱主要集中于氢谱，这是由于能够产生核磁共振信号 1的H原子在自然界丰度极高，由其产生的核磁共振信号很强，容易检测。随着傅立叶变换技术的发展，核磁共振仪可以在很短的时间内同时发出不同频率的射频场，这样就可以对样品重复扫描，从而将微弱 13的核磁共振信号从背景噪音中区分出来，这使得人们可以收集C核磁共振信号。 • 近年来发展的二维核磁共振谱技术，使人们能够获得更多关于分子结构的信息，目前二维核磁共振谱已经可以解析分子量较小的蛋白质分子的空间结构。 核磁共振-生物学中应用 • 核磁共振波谱技术用来研究生物大分子有如下特点: • ?不破坏生物高分子结构(包括空间结构)。 ?在溶液中测定符合生物体的常态，也可测定固体样品，比较晶态和溶液态的构象异同。 ?不仅可用来研究构象而且可用来研究构象变化即动力学过程。 ?可以提供分子中个别基团的信息，对于比较小的多肽和蛋白质已可通过二维NMR获得全部三维结构信息。 ?可用来研究活细胞和活组织。 1133115191• 在生物学研究中最常用的是H，C，P谱，此外还有N，F等。H 1谱发展最早，H在生物体中无所不在，核磁相对灵敏度高，故应用最广，包括用于核磁成像。缺点是含氢基团极多，谱线易重叠而不易解 1213析。碳亦为生物体内重要元素，但C自旋为零，C天然丰度低，仅 1为1.1,，对等数量的核在相同磁场下其灵敏度只及H的1.6,。其优点是化学位移范围宽，在宽带去耦条件下进行实验，波谱简单，易分 1313辨，随着测定技术及C标记方法的发展，C 谱已有极广泛的应用。31P谱常用于活组织测定，观察ATP等含磷化合物的代谢过程，并已用于核磁成像。 • NMR在生物学研究中范围很广。主要有: • 分析研究 :如确定生物分子成分及浓度，特别是可不破坏组织细胞而测知其中组分;确定异构体比例;确定分子解离状态;确定金属离子或配基是否处于结合状态;以及测定细胞膜内外的pH差异。 • 热力学研究:如测定酶与底物、配基、抑制剂的结合常数;测定可解离基团的pK值，特别是能测定生物大分子中分处不同微环境的同类残基的同类基团的不同pK值，这是其他方法所不及的;还可测定相变温度，ΔG等其他热力学参数。 • 动力学研究:监测反应进程，测定各组分随时间的变化;通过变温实验和线形分析，测平衡过程的动力学常数，包括某些生化反应的反应速率，研究分子间(如酶与抑制剂，DNA与药物)相互作用的动力学过程。 • 分子运动研究:弛豫参数(T，T，NOE)可用来研究生物高分子的12 动力学，以及生物膜的流动性。 • 分子构象及构象变化研究:目前用二维核磁共振技术加上计算机模拟 已能独立确定小的蛋白质分子及核苷酸片段在溶液中的三维空间结构。改变物理化学因素或加入可与生物分子相互作用的其他物质，将会使核磁图谱发生变化，从而可用来研究这种构象变化。 31131• 活体研究:用P，C，H磁共振方法测定活细胞，活组织以致整体的代谢物浓度及变化，测定细胞内pH值，观察药物或不同生理状况对代谢的影响。研究对象有微生物、植物、各种动物以至人体器官等。 核磁共振成像 • 核磁共振成像(NMR image，MRI)技术是核磁共振在医学领域的应用。人体内含有非常丰富的水，不同的组织，水的含量也各不相同，如果能够探测到这些水的分布信息，就能够绘制出一幅比较完整的人体内部结构图像，核磁共振成像技术就是通过识别水分子中氢原子信号的分布来推测水分子在人体内的分布，进而探测人体内部结构的技术。 • 最早的核磁共振成像实验是由1973年劳特伯发表的，并立刻引起了广泛重视，短短10年间就进入了临床应用阶段。作用在样品上有一稳定磁场和一个交变电磁场，去掉电磁场后，处在激发态的核可以跃迁到低能级，辐射出电磁波，同时可以在线圈中感应出电压信号，称为核磁共振信号。 • 人体组织中由于存在大量水和碳氢化合物而含有大量的氢核，一般用氢核得到的信号比其他核大1000倍以上。正常组织与病变组织的电压信号不同，结合CT技术，即电子计算机断层扫描技术，可以得到人体组织的任意断面图像，尤其对软组织的病变诊断，更显示了它的优点，而且对病变部位非常敏感，图像也很清晰。若将核磁共振的频率变数增加到两个或多个，可以实现二维或多维核磁共振，从而获得比一维核磁共振更多的信息。 • 目前核磁共振成像应用仅限于氢核，但从实际应用的需要，还要求可以对其他一些核如:C13、N14、P31、S33、Na23、I127等进行核磁共振成像。C13已经进入实用阶段，但仍需要进一步扩大和深入。核 磁共振与其他物理效应如穆斯堡尔效应(γ射线的无反冲共振吸收效应)、电子自旋共振等的结合可以获得更多有价值的信息，无论在理论上还是在实际应用中都有重要意义。核磁共振拥有广泛的应用前景，伴随着脉冲傅里叶技术已经取得了一次突破，使C13谱进入应用阶段，有理由相信，其它核的谱图进入应用阶段应为期不远。 • 与用于鉴定分子结构的核磁共振谱技术不同，核磁共振成像技术改编的是外加磁场的强度，而非射频场的频率。核磁共振成像仪在垂直于主磁场方向会提供两个相互垂直的梯度磁场，这样在人体内磁场的分布就会随着空间位置的变化而变化，每一个位置都会有一个强度不同、方向不同的磁场，这样，位于人体不同部位的氢原子就会对不同的射频场信号产生反应，通过记录这一反应，并加以计算处理，可以获得水分子在空间中分布的信息，从而获得人体内部结构的图像。 • 应用核磁共振断层成像术显示人的大脑 • 核磁共振成像技术还可以与X射线断层成像技术(CT)结合为临床诊断和生理学、医学研究提供重要数据。核磁共振成像技术是一种非介入探测技术，相对于X-射线透视技术和放射造影技术，MRI对人体没有辐射影响，相对于超声探测技术，核磁共振成像更加清晰，能够显示更多细节，此外相对于其他成像技术，核磁共振成像不仅仅能够显示有形的实体病变，而且还能够对脑、心、肝等功能性反应进行精确的判定。在帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、癌症等疾病的诊断方面，MRI技术都发挥了非常重要的作用。 • 磁共振成像与1901年获得诺贝尔物理学奖的普通X射线或1979年获得诺贝尔医学奖的计算机层析成像(computerized tomography, CT)相比，磁共振成像的最大优点是它是目前少有的对人体没有任何伤害的安全、快速、准确的临床诊断方法。如今全球每年至少有6000万病例利用核磁共振成像技术进行检查。具体说来有以下几点: • 对人体没有游离辐射损伤;各种参数都可以用来成像，多个成像参数能提供丰富的诊断信息，这使得医疗诊断和对人体内代谢和功能的研 究方便、有效。能获得脑和脊髓的立体图像，不像CT(只能获取与人体长轴垂直的剖面图)那样一层一层地扫描而有可能漏掉病变部位;能诊断心脏病变，CT因扫描速度慢而难以胜任;对软组织有极好的分辨力。对膀胱、直肠、子宫、阴道、骨、关节、肌肉等部位的检查优 1于CT;原则上所有自旋不为零的核元素都可以用以成像，例如氢(H)、 13141531碳(C)、氮(N和N)、磷(P)等。 复习思考 • 1.名词: • 核磁共振(原理)，饱和，化学位移，自旋-自旋耦合作用，耦合常数 • 2.什么是弛豫，分为几类, • 3.采用脉冲-傅里叶变换仪器的好处, • 4.论述应用核磁共振波普分析时样品的制备。 • 5.简述二维核磁共振波谱实验原理。 • 6.讨论核磁共振在生物学研究中的应用。 • 7.讨论核磁共振应用于生物大分子研究的特点。 第九章 高效液相色谱法 • 1.概述 • 2.液相色谱仪器 3.液相色谱分离模式 • 4.液相色谱检测技术 5.其他色谱方法 6.液相色谱的应用 1. 概述 • 高效液相色谱法的发展 • 在所有色谱技术中，液相色谱法(liquid chromatography，LC)是最早(1903年)发明的，但其初期发展比较慢，在液相色谱普及之前，纸色谱法、气相色谱法和薄层色谱法是色谱分析法的主流。到了20世纪60年代后期，将已经发展得比较成熟的气相色谱的理论与技术应用到液相色谱上来，使液相色谱得到了迅速的发展。特别是填料制备技术、检测技术和高压输液泵性能的不断改进，使液相色谱分析实现了高效化和高速化。 • 具有这些优良性能的液相色谱仪于1969年商品化。从此，这种分离效率高、分析速度快的液相色谱就被称为高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)，也称高压液相色谱法或高速液相色谱法。 • 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用气相色谱难以分析的物质，如挥发性差、极性强、具有生物活性、热稳定性差的物质。现在，HPLC的应用范围已经远远超过气相色谱，位居色谱法之首。 • 高效液相色谱的类型 • 广义地讲，固定相为平面状的纸色谱法和薄层色谱法也是以液体为流动相，也应归于液相色谱法。不过通常所说的液相色谱法仅指所用固定相为柱型的柱液相色谱法。 通常将液相色谱法按分离机理分成吸附色谱法、分配色谱法、离子色谱法和凝胶色谱法四大类。其实，有些液相色谱方法并不能简单地归于这四类。表列举了一些液相色谱方法。按分离机理，有的相同或部分重叠。但这些方法或是在应用对象上有独特之处，或是在分离过程上有所不同，通常被赋予了比较固定的名称。 2.液相色谱仪器 • 液相色谱仪流程图 • 现在的液相色谱仪一般都做成一个个单元组件，然后根据分析要求将各所需单元组件组合起来。最基本的组件是高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器和数据系统(记录仪、积分仪或色谱工作站)。此外，还可根据需要配置流动相在线脱气装置、梯度洗脱装置、自动进样系统、柱后反应系统和全自动控制系统等。 • 液相色谱仪的工作过程:输液泵将流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导入,流动相将样品带入色谱柱,在色谱柱中各组分因在固定相中的分配系数或吸附力大小的不同而被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据系统记录、处理或保存。 输液泵 • 高压输液泵是液相色谱仪的关键部件，其作用是将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱系统。对于带在线脱气装置的色谱仪，流动相先经过脱气装置再输送到色谱柱。输液泵的稳定性直接关系到分析结果的重复性和准确性。 • 对输液泵的基本要求 • 流量准确可调。对于一般的分析工作而言，流动相的流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量一般为5-10mL/min。输液泵的流量控制精度通常要求小于?0.5%。输液泵必须能精确地调节流动相流量，这可以通过电子线路调节电机转速或冲程长短来实现。流量的测定通常采用热脉冲流量计。 • 耐高压。高效液相色谱柱是将很细颗粒(3-10 μm粒径)的填料，在高压下填充到柱管中的，为了保证流动相以足够大的流速通过色谱柱，需要足够高的柱前压。通常要求泵的输出压力达到30-60MPa的高压。 • 液流稳定。输液泵输出的液流应无脉动，或配套脉冲抑制器。 泵的死体积小。为了快速更换溶剂和适于梯度洗脱，泵的死体积通常要求小于0.5mL。泵的结构材料应耐化学腐蚀。 • 输液泵按输出液恒定的因素分恒压泵和恒流泵。对液相色谱分析来说，输液泵的流量稳定性更为重要，这是因为流速的变化会引起溶质的保留值的变化，而保留值是色谱定性的主要依据之一。因此，恒流泵的应用更广泛。 • 输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能总结于表。 (1) 活塞型往复泵 • 活塞型往复泵是液相色谱仪中使用最广泛的一种恒流泵。 • 单活塞往复泵: 如图所示，在活塞柱的一端有一偏心轮，偏心轮连 在电动机上，电动机带动偏心轮转动时，活塞柱则随之左右移动。在活塞的另一端有上下两个单向阀，各有1-2个蓝宝石或陶瓷球，由其起阀门的作用。下面的单向阀与流动相连通，为活塞的溶液入口;上面的单向阀与色谱柱相连，为活塞的溶液出口。 • 双活塞往复泵: 如图(a)所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮，偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得的排液特性如图(b)所示，即具有稳定的输出流量，这样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。 (2) 隔膜型往复泵 • 隔膜型往复泵也是一种恒流泵，其结构如图所示。一块隔膜将泵缸分为两部分，一部分充满了油，另一部分充满了流动相。活塞与油接触，当活塞往复运动时，隔膜受到油压的作用，对流动相部分产生"吸引"或"推压"，使流动相部分的单向阀吸液或排液，从而获得稳定的液流。通过调节泵活塞的冲程即可进行流量调节。 • 隔膜泵的活塞不直接与流动相接触，故不存在活塞密封垫磨损对流动相的污染。隔膜泵的死体积小(约0.1mL)，因此，更换流动相后平衡快，有利于梯度洗脱。隔膜泵的缺点是结构比较复杂，价格较贵，和单活塞机械往复泵一样，也产生脉冲，也需要配置阻尼装置来消除脉冲。 脱气装置 • 为什么要脱气 • 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。 • 脱气方法 • 目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是离线超声波振荡脱气、在线惰性气体鼓泡吹扫脱气和在线真空脱气。 超声波振荡脱气: 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。 • 惰性气体鼓泡吹扫脱气: 将气源(钢瓶)中的气体(氦气)缓慢而均匀地通入储液罐中的流动相中，氦气分子将其它气体分子置换和顶替出去，而它本身在溶剂中的溶解度又很小，微量氦气所形成的小气泡对检测无影响。 • 真空脱气装置: 将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该输液管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。图是单流路真空脱气装置的原理图。一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。 梯度洗脱装置 • 为什么要进行梯度洗脱, 在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。 • 梯度洗脱操作 在液相色谱中流速(压力)梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。 • 线性梯度 • 阶梯梯度 • 高压梯度 • 低压梯度 • 线性梯度: 在某一段时间内连续而均匀增加流动相强度。 • 阶梯梯度: 直接从某一低强度的流动相改变为另一较高强度的流动相。 梯度洗脱时，流动相的输送就是要将几种组成的溶液混合后送到分离系统，因此，梯度洗脱装置就是解决溶液的混合问题，其主要部件除高压泵外，还有混合器和梯度程序控制器。根据溶液混合的方式可以将梯度洗脱分为高压梯度和低压梯度。 • 高压梯度: 一般只用于二元梯度，即用两个高压泵分别按设定的比例输送A和B两种溶液至混合器，混合器是在泵之后，即两种溶液是在高压状态下进行混合的。 • 高压梯度系统的主要优点是，只要通过梯度程序控制器控制每台泵的输出，就能获得任意形式的梯度曲线，而且精度很高，易于实现自动化控制。其主要缺点是使用了两台高压输液泵，使仪器价格变得更昂贵，故障率也相对较高，而且只能实现二元梯度操作。 • 低压梯度: 只需一个高压泵，与等度洗脱输液系统相比，就是在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压(低压)下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。 • 来自于四种溶液瓶的四根输液管分别与真空脱气装置的四条流路相接，经脱气后的四种溶液进入比例阀，混合后从一根输出管进入泵体。多元梯度泵的流路可以部分空置。 进样器 • 进样器是将样品溶液准确送入色谱柱的装置，分手动和自动两种方式。 • 进样器要求密封性好，死体积小，重复性好，进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。现在的液相色谱仪所采用的手动进样器几乎都是耐高压、重复性好和操作方便的六通阀进样器，其原理与气相色 谱中所介绍的相同。 色谱柱 • 色谱柱的构成 色谱柱是实现分离的核心部件，要求柱效高、柱容量大和性能稳定。柱性能与柱结构、填料特性、填充质量和使用条件有关。 色谱填料: 经过制备处理后，用于填充色谱柱的物质颗粒，通常是5-10 μm粒径的球形颗粒。 色谱柱管: 内部抛光的不锈钢管。典型的液相色谱分析柱尺寸是内径4.6mm，长250mm。 • 色谱柱: 也称固定相，是将色谱填料填充到色谱柱管中所构成的,其结构如图。 • 色谱柱的填充 • 干法填充: 在硬台面上铺上软垫，将空柱管上端打开垂直放在软垫上，用漏斗每次灌入50-100mg填料，然后垂直台面墩10-20次。 湿法填充: 又称淤浆填充法，使用专门的填充装置(图)。 • 填料的结构 • 色谱填料是由基质和功能层两部分构成。 基质: 又常称作载体或担体，通常制备成数微米至数十微米粒径的球形颗粒，它具有一定的刚性，能承受一定的压力，对分离不起明显的作用，只是作为功能基团的载体。常用来作基质的有硅胶和有机高分子聚合物微球。 功能层: 是通过化学或物理的方法固定在基质表面的、对样品分子的保留起实质作用的有机分子或功能团。 • 如图是硅胶基质的冠醚大分子固定相的结构示意图，功能层冠醚分子吸附或键合在硅胶基质的表面。 • 填料的物理结构: 分为微孔型(或凝胶型)、大孔型(全多孔型)、薄壳型和表面多孔型四种类型，如图所示。 数据处理系统与自动控制单元 • 数据处理系统: 又称色谱工作站。它可对分析全过程(分析条件、仪器状态、分析状态)进行在线显示，自动采集、处理和储存分析数据。一些配置了积分仪或记录仪的老型号液相色谱仪在很多实验室还在使用，但近年新购置的色谱仪，一般都带有数据处理系统，使用起来非常方便。 自动控制单元: 将各部件与控制单元连接起来，在计算机上通过色谱软件将指令传给控制单元，对整个分析实现自动控制，从而使整个分析过程全自动化。也有的色谱仪没有设计专门的控制单元，而是每个单元分别通过控制部件与计算机相连，通过计算机分别控制仪器的各部分。 3.液相色谱分离模式 • 吸附色谱(adsorption chromatography) • • 原理: 基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。 • 固定相: 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。 活性硅胶: 一种多孔性物质,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基 ,作吸附剂的硅胶需经加热处理,除掉其表面吸附水,使之活化。按其孔径分布分为表面多孔和全多孔两类。硅胶既是吸附色谱最常用的固定相，也是分配色谱、离子色谱等色谱固定相的常用基质。 • 流动相: 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃(己烷、戊烷、庚烷等)、二氯甲烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等等。 • 分离过程: 硅羟基呈微酸性，易与氢结合，是吸附的活性点。流动相溶剂在吸附剂表面形成单分子或双分子吸附层，当样品分子进入色谱柱，样品主要靠氢键结合力吸附到硅羟基上，与流动相分子竞争吸附点。样品分子反复地被吸附，又反复地被流动相分子顶替解吸，随 着流动相的流动而在柱中向前移动。因为不同的样品分子在固定相表面的吸附能力不同，因而吸附-解吸的速度不同，各组分被洗脱的时间(保留时间)也就不同，使得各组分相互分离。 • 应用: 吸附色谱在早期的HPLC中应用得最多，现在，很多以前用吸附色谱分离的物质被更方便和更有效的化学键合相反相分配色谱所代替。由于硅羟基活性点在硅胶表面常按一定几何规律排列，因此吸附色谱用于结构异构体分离和族分离仍是最有效的方法。如农药异构体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。 • 分配色谱(partition chromatography) • 原理: 主要基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同(分配作用)而实现分离的液相色谱分离模式。 • 键合固定相: 分配色谱原本是基于样品分子在包覆于惰性载体(基质)上的固定相液体和流动相液体之间的分配平衡的色谱方法，因此也称液-液分配色谱。因为作固定相的液体往往容易溶解到流动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去了。这种化学键合型固定相是当今HPLC最常用的固定相，大约占HPLC固定相的四分之三。 • 极性键合固定相: 键合在载体表面的功能分子是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团的有机分子。 非极性键合固定相: 键合在载体表面的功能分子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS(Octa Decyltrichloro Silane)柱或C18柱就是最典型的代表，它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合，在硅胶表面形成化学键合态的十八烷基，其极性很小。 • 正相HPLC(normal phase HPLC): 是由极性固定相和非极性(或弱极性)流动相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相HPLC，早期的液相色谱中曾广泛采用这种体系。对于一些在非极性疏水固定相中强烈保留的有机分子常常采用正相HPLC模式。 反相HPLC(reversed phase HPLC): 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶，代表性的流动相是甲醇和乙腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，几乎可用于所有能溶于极性或弱极性溶剂中的有机物质的分离。 • 凝胶色谱(gel chromatography) • 原理: 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。样品分子与固定相之间不存在相互作用力(吸附、分配和离子交换等)，因而凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱、分子筛色谱等。比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅速流出色谱柱，不能被分离。比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停留(保留)的时间也就越长(图)。 • 固定相: 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 流动相: 在凝胶色谱中，流动相的作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。 凝胶过滤色谱(gel filtration chromatography, GFC): 以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。 凝胶渗透色谱(gel permeation chromatography, GPC): 以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量(分布)的测定。 离子色谱法(ion chromatography, IC) • 离子交换色谱法(ion exchange chromatography, IEC) IEC使用的是低交换容量的离子交换剂，这种交换剂的表面有离子交换基团。带负电荷的交换基团(如磺酸基和羧酸基)可以用于阳离子 的分离，带正电荷的交换基团(如季胺盐)可以用于阴离子的分离。 • 阴离子交换过程的示意图。由于静电场相互作用，样品阴离子以及淋洗剂阴离子(也称淋洗离子)都与固定相中带正电荷的交换基团作用，样品离子不断地进入固定相，又不断地被淋洗离子交换而进入流动相，在两相中达到动态平衡，不同的样品阴离子与交换基的作用力大小不同，电荷密度大的离子与交换基的作用力大，在树脂中的保留时间就长，于是不同的离子相互分离。 • 离子排斥色谱法( ion chromatography exclusion , ICE) ICE的分离机理是以树脂的Donnan排斥为基础的分配过程。分离阴离子用强酸性高交换容量的阳离子交换树脂，分离阳离子用强碱性高交换容量的阴离子交换树脂。 -+-• 离子排斥色谱的原理。强电解质Cl形成HCl，因受排斥作用不能穿过半透膜进入树脂的微孔，迅速通过色谱柱而无保留。而弱电解质CH3COOH可以穿过半透膜进入树脂微孔。电解质的离解度越小，受排斥作用也越小，因而在树脂中的保留也就越大。 • 离子对色谱(ion-pair chromatography, IPC) 无机离子以及离解很强的有机离子通常可以采用离子交换色谱或离子排斥色谱进行分离。有很多大分子或离解较弱的有机离子需要采用通常用于中性有机化合物分离的反相(或正相)色谱。然而，直接采用正相或反相色谱又存在困难，因为大多数可离解的有机化合物在正相色谱的硅胶固定相上吸附太强，致使被测物质保留值太大、出现拖尾峰，有时甚至不能被洗脱。在反相色谱的非极性(或弱极性)固定相中的保留又太小。在这种情况下，就可采用离子对色谱。 • 离子对色谱也称离子相互作用色谱，是在流动相中加入适当的具有与被测离子相反电荷的离子，即"离子对试剂"，使之与被测离子形成中性的离子对化合物，此离子对化合物在反相色谱柱上被保留。保留的大小主要取决于离子对化合物的解离平衡常数和离子对试剂的浓度。离子对色谱也可采用正相色谱的模式，即可以用硅胶柱，但不如反相 色谱效果好，多数情况下采用反相色谱模式，所以离子对色谱也常称反相离子对色谱。 4.液相色谱检测技术 • 检测器: 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。 检测器利用溶质的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当溶质从色谱柱流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰的形式记录下来。 紫外-可见光(UV-VIS)检测器 • 原理: 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。 很多有机分子都具紫外或可见光吸收基团，有较强的紫外或可见光吸收能力，因此UV-VIS检测器既有较高的灵敏度，也有很广泛的应用范围。由于UV-VIS对环境温度、流速、流动相组成等的变化不是很敏感，所以还能用于梯度淋洗。一般的液相色谱仪都配置有UV-VIS检测器。 用UV-VIS检测时，为了得到高的灵敏度，常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其它目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长，另外，应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相。 • 二极管阵列检测器(diode-array detector, DAD): 以光电二极管阵列(或CCD阵列，硅靶摄像管等)作为检测元件的UV-VIS检测器(图8-15)。它可构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度和波长的三维谱图。与普通UV-VIS检测器不同的是，普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定波长的光进入流动池。而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所有波长的光在接受器上被检测。 • 直接紫外检测: 所使用的流动相为在检测波长下无紫外吸收的溶剂，检测器直接测定被测组分的紫外吸收强度。多数情况下采用直接紫外 检测。 间接紫外检测: 使用具有紫外吸收的溶液作流动相，间接检测无紫外吸收的组分。在离子色谱中使用较多，如以具有紫外吸收的邻苯二甲酸氢钾溶液作阴离子分离的流动相，当无紫外吸收的无机阴离子被洗脱到流动相中时，会使流动相的紫外吸收减小。 柱后衍生化光度检测: 对于那些可以与显色剂反应生成有色配合物的组分(过渡金属离子、氨基酸等)，可以在组分从色谱柱中洗脱出来之后与合适的显色剂反应，在可见光区检测生成的有色配合物。 示差折光检测器(differential refractometers, RI) • 原理:基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。 示差折光检测法也称折射指数检测法。绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物(如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃)是比较适合的。在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。 RI 检测器根据其设计原理可分为反射型(根据Fresnel定律)、折射型(根据Snell定律)和干涉型三种类型。 荧光检测器(fluorescence detector) • 原理: 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。 • 特点: 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。 电导检测器(conductivity detector, CD) • 原理: 基于离子性物质的溶液具有导电性，其电导率与离子的性质和浓度相关。 电导检测器是离子色谱中必备的检测器。 电导检测器的构成: 由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。 电导池的结构: 检测体积可达到微升甚至纳升级。其基本结构是在柱流出液中放置两根电极，然后通过适当的电子线路测量溶液的电导。 • 电导检测器工作原理: 电导池工作时，电极间及电极附近溶液中所发生的电化学过程可以用图表示。当向电导池的两个电极施加电压时，溶液中的阴离子向阳极移动，阳离子向阴极移动。在电解质溶液中的离子数目和离子的移动速率决定溶液的电阻大小，离子的迁移率或单位电场中离子的速率取决于离子的电荷及其大小、介质类型、溶液温度和离子浓度。离子的迁移速率取决于施加电压的大小。所施加的电压既可以是直流电压，也可以是正弦波或方波电压。当施加的有效电位确定后，即可测量出电路中的电流值，即能测出电导值。 蒸发光散射检测器 (evaporative light-scattering detector, ELSD) • ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管(溶剂蒸发室)、激光光源和光检测器(光电转换器)等部件构成。色谱柱流出液导入雾化器，被载气(压缩空气或氮气)雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质，激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。 • 因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。其灵敏度与载气流速、汽化室温度和激光光源强度等参数有关。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。 5.其它色谱方法 • 超临界流体色谱 毛细管电泳和毛细管 电色谱 亲和色谱 激光色谱 超临界流体色谱 (supercritical fluid chromatography, SFC) • 超临界流体:指高于临界压力和临界温度时的一种物质状态，它既不是气体，也不是液体，但它兼具气体的低粘度和液体的高密度以及介于气体和液体之间的较高扩散系数等特征。 SFC:以超临界流体作流动相，以固体吸附剂(如硅胶)或键合在载体(或毛细管壁)上的有机高分子聚合物作固定相的色谱方法。 • 常用流动相:超临界状态下的 、氧化亚氮、乙烷、三氟甲烷等。 最常用，因为它的临界温度低(31?)、临界压力适中(7.29MPa)、无毒、便宜，但其缺点是极性太低，对一些极性化合物的溶解能力较差，所以，通常要用另一台输液泵往流动相中添加1-5,的甲醇等极性有机改性剂。 色谱柱:液相色谱的填充柱和气相色谱的毛细管柱都可以使用，但由于超临界流体的强溶解能力，所使用的毛细管填充柱的固定相必须交联。 应用:从理论上讲，SFC既可以象液相色谱一样分析高沸点和难挥发样品，也可象气相色谱一样分析挥发性成分。不过，超临界流体色谱更重要的应用是用来作分离和制备，即超临界流体萃取。 毛细管电泳和毛细管电色谱 • 毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE):以高压电场为驱动力，以电解质为电泳介质，以毛细管为分离通道，样品组分依据淌度和分配行为的差异而实现分离的一种色谱方法。它有多种分离模式，可以采用液相色谱中的各种检测方法。CE既可以分离带电荷的溶质，也可以通过毛细管胶束电动色谱等分离模式分析中性溶质，CE的高分离效率、高检测灵敏度，样品用量极少等特点使它在生物医药样品的分析中显示出突出的优越性。 • 毛细管电色谱(capillary electrochromatography, CEC):以电渗流(或电渗流结合高压输液泵)为流动相驱动力的微柱色谱法。CEC是液相色谱与毛细管电泳相结合的产物，它的分离机理包含有电泳迁移和色谱固定相的保留机理，一般而言，溶质与固定相间的相互作用对分离起主导作用。所用色谱柱为填充了HPLC填料的填充型毛细管柱和管内壁涂渍了固定相功能分子的开管毛细管柱。CEC还处在发展阶段，目前主要应用在药物、手性化合物和多环芳烃的分离分析。另外CEC 与质谱联用既可解决LC/MS的分离效率不高的问题，又可克服CE/MS中质量流量太小的缺陷。 亲和色谱(affinity chromatography) • 定义:利用蛋白质或生物大分子等样品与固定相上生物活性配位体之间的特异亲和力进行分离的液相色谱方法。 固定相:将具有生物活性的配位体以共价键结合到不溶性固体基质上制得。 生物活性配位体:常用的有酶(如底物及其类似物)、辅酶(如类固醇)、抗体(植物激素)、激素(如糖和多糖)、抗生素(核苷酸)等。 • 基质:通常为凝胶，许多无机和有机聚合物都可形成凝胶，如琼脂糖衍生物、多孔玻璃。 分离过程:亲和色谱是吸附色谱的发展，在分离过程中涉及疏水相互作用、静电力、范德华力和立体相互作用。在键合了某类配体的亲和色谱柱上加入含生物活性大分子的样品，只有那些与该柱中配位体表现出明显亲和性的生物大分子才会被吸附，这些被吸附的生物分子只有在改变流动相(缓冲溶液)的组成时才会被洗脱。 应用:亲和色谱主要用于蛋白质和生物活性物质的分离与制备。 激光色谱 • 原理:以激光的辐射压力为驱动力，将待分离组分(或物质颗粒)按几何尺寸大小予以分离的一种色谱分离技术。 • 分离过程:欲分离的粒子随流动相(粒子溶液本身)以一定的流速流经一个内径为200 μm左右的毛细管，将一定功率的激光束聚焦于毛细管的出口(流动相流出口)，激光束的入射方向与粒子的在流动相中的流动方向相反，但都与毛细管同轴。这时，溶质粒子同时受到流动相的推动力和与之相反的激光束辐射压力的作用。由于溶质粒子的折光指数大于溶剂的折光指数，因此溶质粒子受激光辐射压力作用而聚焦于激光束的中心线上，当溶质粒子受到的激光辐射压力大于流动相推力时，溶质粒子就会发生反转并获得一定加速度，沿激光束中心线运动，直至所受到的流动相阻力与激光辐射压力相等时，溶质才会停留。因为不同几何尺寸的溶质粒子受到激光辐射的作用力不同，它们在毛细管中的停留位置也就不同，从而达到分离。 • 检测:可以用配有显微物镜的电视摄像机记录分离结果。 应用:激光色谱是1995年刚刚提出的新的色谱方法，尽管尚无商品仪器，但可预言其在生命科学领域将发挥重要作用，如分离高分子聚合物微球、生物细胞、生物大分子、肽、DNA、线粒体。从理论上讲，可以实现单个蛋白质分子的检测。 6.液相色谱的应用 • HPLC在不同领域的主要应用 • HPLC几乎在所有学科领域都有广泛应用，可以用于绝大多数物质成分的分离分析，它和气相色谱都是应用最广泛的仪器分析技术。 液相色谱分离模式的选择 • 分离方式是按固定相的分离机理分类的，选定了固定相(色谱柱)基本上就确定了分离方式。当然，即使同一根色谱柱，如果所用流动相和其它色谱条件不同，也可能成为不同的分离方式。选择分离方式大体上可以参照图。