仙台病毒RT_PCR检测方法的建立与应用

仙台病毒RT_PCR方法的建立与应用 2008 年 1 月 中国比较医学杂志 January , 2008 第 18 卷 第 1 期CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINE Vol . 18 No . 1 技术和方法 仙台病毒 RT2PCR 检测方法的建立与应用 2 , 31 ,2 ,3 2 ,3 2 , 3 2 ,3 2 , 3 王宗耀,谢建云,邵伟娟,王胜昌,胡建华,高诚 (11 扬州大学比较医学中心 ,扬州 225009 ; 21 上海实验动物质量监督检验站 ,上海 200032 ; )31 上海实验动物研究中心 上海市生育科学研究所 ,上海 200032 () 【摘要】 目的 建立仙台病毒的 RT2PCR 方法并应用于常规检测 。方法 根据仙台病毒 gi :9627219F 蛋白的 基因序列 , Ff 和 Fr 引物 ,以仙台病毒总 RNA 逆转录的 cDNA 为模板扩增出约 609 bp 预期条带 ; 将建立的 RT2 PCR 方法应用于人工感染小鼠和送检细胞样品检测 。结果 八份感染小鼠样品中全部扩增出约 609 bp 目的条带 ,16 份肿瘤细胞样品有 12 份扩增出 609 bp 目的条带 。结论 建立的仙台病毒 RT2PCR 方法是一种灵敏 、快速 、特异 的方法 ,能够用于常规检测 。 【关键词】 仙台病毒 ;逆转录2聚合酶链反应 ;检测 () 【文章编号】167127856 20080120049205 【中图分类号】R373 【文献标识码】A Esta blishment and Application of Reverse Transcripta se2Ploymera se Cha in Reaction f or Senda i Virus 1 ,2 ,3 2 ,3 2 ,3 2 ,3 2 ,3 2 ,3WANG Zong2yao,XIE Jian2yun,SHAO Wei2juan,WANG Sheng2chang, HU Jian2hua, GAO cheng (11Comparative Medicine Center of Yangzhou university , Yangzhou 225009 ,China ; 21Shanghai Quality Monitoring Center for Laboratory Animals , Shanghai 200032 ,China ; )31Shanghai Laboratory Animal Research Center , Shanghai Institute of Planned Parenthood Research , Shanghai 200032 ,China 【Abstract】 Objective To establish a reverse transcriptase ploymerase chain reaction method for Sendai virus and to utilize the RT2PCR for diagnosis of Sendai virus affected samples. Methods PCR primes were designed according to fusion protein () gene of Sendai virusgi :9627219. The 609 bp product was obtained with the template from Sendai virus. 8 mice infected Sendai virus and 16 cells for detecting were detected by RT2PCR. Results 609 bp fragment were amplified from 8 mice and 12 in 16 cells. Conclusion The results showed the developed RT2PCR was a rapid , reliable , sensitive and specific method of detecting Sendai virus. 【 Key words】 Sendai Virus ; Reverse Transcriptase2Ploymerase Chain Reaction ; Diagnosis 2 ( ) Sendai virus ,SeV属于副粘病毒科副 仙台病毒 前导序列。 粘病毒属 ,是具有细胞融合活性的包膜病毒 ,是典型 仙台病毒传染性强 ,容易扩散 ,是啮齿类实验动 的 线 性 非 片 段 负 链 RNA 病 毒 , 基 因 组 大 小 为 物最难控制的病毒之一 。啮齿类实验动物感染 SeV 1 3 15 kb。其基因排列次序为 ,3′2Leader 2 NP 2 P 2 C 2常会改变体内的免疫反应 ,影响实验结果,动物一 M2 F 2 HN 2 L 2 Leader 2 5′,在 3′端和 5′端各有一段旦感染很难清除 ,严重影响幼鼠生长发育并降低成 () 上海市科技发展基金资助项目 034909008。 [ 基金项目 ] () 王宗耀 1979 - ,男 ,硕士生 ,研究方向 :实验动物微生物检测和研究 。Email :tiechui20508 @1631com [ 作者简介 ] 高诚 ,研究员 ,硕导 。Email :gaocheng @sippr . stc . sh. cn [ 通讯作者 ] 4 μμμ( ) ( 抑制剂 1 L 40 U/L 、AMV 逆转录酶 3 L 10 U/ 年鼠 的 繁 殖 率。SeV 常 规 的 检 测 方 法 主 要 是 5 μμ) L、DEPC 水 715 L , 37 ?逆 转 录 60 min , 70 ? 15 EL ISA、IEA 等血清学方法, 但这些血清学方法无 min 灭活 RNA 酶 , - 20 ?保存备用 。 法对无血清生物制品和免疫缺陷小鼠进行检测 。 ( ) 11513 聚合酶链式反应 PCR: 反应体系 : 10 ×PCR F 蛋白是仙台病毒主要的抗原蛋白 , 与 HN 蛋2 + 2 () μμbuffer Mg5L 、215 mmolΠL dNTP 4L 、Ff 和 Fr 引 白构成毒粒表面的突起 ,有细胞融合特性。本实 μμμ() (μ) 物各 1L 20 pmolΠL、rTaq 1L 5 UΠL、cDNA 5L 验根据仙台病毒 F 蛋白基因序列和相关文献设计引 6 27μ、ddH O 33 L 。反应程序 :94 ?预变性 5 min 、进入循 物,建立了一种快速 、敏感的 RT2PCR 方法 ,并对 2 感染小鼠和某单位送检肿瘤细胞进行了检测应用 。 环 ,94 ?变性 45 s 、56 退火 45 s 、72 ?延伸 1 min30 s 共 35 循环 、72 ?延伸 5 min , PCR 产物用 1 %琼脂糖 1 材料与方法 凝胶电泳 。 111 病毒毒株 116 PCR 产物的克隆与鉴定 仙台病毒 、小鼠肺炎病毒 、小鼠肝炎病毒 、呼肠 将 PCR 产物与 pMD182T Vector 连接 、克隆到 E. 孤病毒 3 型为本站保存 ,BHK21 细胞购自中科院细 coli JM109 感受态细胞 , 将蓝白斑和 PCR 都鉴定为 胞所 ,本室保存 。 阳性的克隆送 Invitrogen 公司测序 。 112 分子生物试剂117 特异性实验 Taq DNA 酶 、dNTP 、DL2000Marker 、pMD2182T 载 用病毒总 RNA 提取试剂盒提取仙台病毒 、小鼠 体 、胶回收试剂盒 、质粒提取试剂盒 ,JM109 感受态 肺炎病毒 、小鼠肝炎病毒 、呼肠孤病毒 ?型 、BHK21 () 细胞等均购于宝生物 大连有限公司 ,AMV 逆 细胞和小鼠肺脏组织总 RNA ,用建立的 RT2PCR 方 转录酶购自 Promega 公司 ,病毒总 RNA 提取试剂盒 法进行检测 。 购于上海华舜生物工程有限公司 。 118 敏感性实验 (μ) 113 病毒培养将仙台病毒 cDNA 150 ngΠL样品进行 10 倍比 μμμ稀释 , 浓度 分 别 为 150 ngΠL 、15 ngΠL 、115 ngΠL 、 仙台病毒用 BHK21 细胞培养 ,细胞病变达 + + μμμμμ+ 以上时 ,收获病毒 。细胞冻融 3 次后 ,4 500 rΠmin150 pgΠL 、15 pgΠL 、115 pgΠL 、150 fgΠL 、15 fgΠL 和 μ 离心 ,弃细胞碎片等沉淀 ; 上清用 30 %蔗糖梯度 20115 fgΠL ,用建立的 RT2PCR 方法进行检测 。 119 RT2PCR 检测方法的应用000 rΠmin 离心 1 h ,弃上清 ,收获病毒沉淀 。 114 模板制备11911 人工感染小鼠检测 :仙台病毒人工感染 8 周 分别取病毒增殖液和 BHK21 细胞培养上清液龄 BALBΠc 小鼠 ,一个月后取小鼠肺脏 ,用试剂盒提 μμ250L ,加入病毒裂解液 500 L ,高速振荡 2 min ,室 取肺脏组织总 RNA ,用建立的 RT2PCR 方法检测 。 μ11912 肿瘤细胞样品检测 :用试剂盒提取某单位送温静置 5 min ; 加入 750 L 异丙醇 , 混匀 , 移入收集 μ检 16 份肿瘤细胞样品总 RNA ,用建立的 RT2PCR 方 管中 ,离心 ;加入去蛋白液 500 L ,离心 ,弃液体 ; 再 μ法检测 。 加入 W3 液 500 L ,离心 ,重复一次后 ; 在吸附膜中 μ央加工 30 L DEPC 水 , 离心 , 即为提取的 RNA , - 2 结果 40 ?保存 。 115 RT2PCR 扩增211 RT2PCR 结果及测序 ( ) 11511 引物设计 : 根据仙台病毒 gi : 9627219F 基 21111 RT2PCR : 仙台病毒出现与预期相符的 609bp () 的条带 ,而小鼠肺炎病毒没有条带 图 1。因序列设计引物 ,引物序列如下 : Ff :5′2GCCAAGAGAGGCATAGCACTCA23′, Fr :5′21112 RT2PCR 产物测序 :将上述 RT2PCR 产物将与2CCTGGGGCATATGTAGGTCAAC23′ 引物由上海pMD182T Vector 连接 、克隆到 E. coli JM109 感受态 博雅生物技术有限公司合成 ,用超 细胞 ,将蓝白斑和 PCR 鉴定阳性克隆送 Invitrogen 公 ( 纯水稀释成 20 pmolΠL ,产物为 609 bp 。司测序 ,测序结果与 Genbank 中发表 SeV 的序列 gb () ) ( ) μμμ11512 逆转录 RT:病毒总 RNA 5L 、100mΠL 随 | DQ21980311| 有 94 %同源性 图 2。 μ212 特异性实验机引 物 1 L 、70 ?变 性 5 min , 快 速 放 置 在 冰 浴 5 μμ min ,加 5xRT2buffer 5L 、10 mmolΠL dNTP215L 、RNA用病毒总 RNA 提取试剂盒提取仙台病毒 、小鼠 中国比较医学杂志 2008 年 1 月第 18 卷第 1 期 Chin J Comp Med , January 2008 ,Vol . 18 . No . 1 51 图 1 RT2PCR 结果 图 3 特异性实验结果 Fig. 1 The result of RT2PCR Fig. 3 The result of specificity of RT2PCR 注 :M. Marker ? 11 小鼠肺炎病毒 21 仙台病毒株 Note : 注 :M. DL2000 分子量标准 ,11 小鼠肺炎病毒 ,21 小鼠肝炎病 M. Marker ?;11PVM ;21SeV 毒 ,31 呼 肠 孤 病 毒 ?型 , 41BHK21 细 胞 , 51 小 鼠 肺 脏 , 61 水 肺炎病毒 、小鼠肝炎病毒 、呼肠孤病毒 ?型 、BHK21 Note : M. DL2000 Marker , 11PVM , 21MHV , 31Reo2 ?, 41BHK21 细胞和小鼠肺脏组织总 RNA ,用建立的 RT2PCR 方 cell ,51The lung of mouse ,61HO 2法进行检测 ,电泳结果表明只有仙台病毒有 609 bp μμμμ稀释为 150 ngΠL 、15 ngΠL 、115 ngΠL 、150 pgΠL 、15 的目的条带 ,而小鼠肺炎病毒 、小鼠肝炎病毒 、呼肠 μμμμμpgΠL 、115 pgΠL 、150 fgΠL 、15 fgΠL 和 115 fgΠL ,用 孤病毒 ?型 、BHK21 和小鼠肺脏组织均没有目的条 μμ建立 PCR 方法进行检测 ,电泳表明 5 L 15 fgΠL 浓 () 带 图 3,建立的 RT2PCR 方法有很好的特异性 。 度的仙台病毒 cDNA 仍可见目的条带 , 说明本研究 建立 的 PCR 技 术 能 检 测 到 0175 pg 的 仙 台 病 毒 () cDNA 图 4。 213 敏感性实验 (μ) 将仙台病毒 cDNA 150 ngΠL样品进行 10 倍比 () 图 2 SeV2F 与 SeV gb| DQ21980311| 比对结果 ()Fig. 2 Comparative result between SeV and SeVgb| DQ21980311| 台病毒全为阳性 , 提取小鼠肺脏组织总 RNA , 用建 ( ) 立的 RT2PCR 方法检测 ,检测结果全为阳性 图 5, 与 EL ISA 检测结果完全相符 。 图 4 敏感性实验结果 Fig. 4 The result of sensitivityof RT2PCR 注 : M. DL2000 分 子 量 标 准 , 11SeV2cDNA 300ng , 21SeV2cDNA 30ng , 31SeV2cDNA 3ng , 41SeV2cDNA 300pg , 51SeV2cDNA 30pg , 图 5 人工感染小鼠肺脏 RT2PCR 结果 61SeV2cDNA 3pg , 71SeV2cDNA 300fg , 81SeV2cDNA 30fg , 91SeV2 Fig. 5 RT2PCR result of lungs infected with SeV cDNA 3fg ,101 水 注 :1281 感染小鼠肺脏 ,91 仙台病毒标准株 ,101 水 ,M. DL2000 Note : M. DL2000 Marker , 11SeV2cDNA 300ng , 21SeV2cDNA 30ng , Marker 31SeV2cDNA 3ng , 41SeV2cDNA 300pg , 51SeV2cDNA 30pg , 61SeV2 Note : 1281lungs infected with SeV. 91SeV ; 101HO ; M. DL2000 2 cDNA 3pg , 71SeV2cDNA 300fg , 81SeV2cDNA 30fg , 91SeV2cDNA Marker 3fg ,101HO 2 21412 肿瘤细胞样品 RT2PCR 结果 : 某单位送检 肿瘤细胞样品 ,提取细胞总 RNA ,用建立的 RT2PCR214 仙台病毒 RT2PCR 方法应用结果 () 方法检测 ,其中 12 个样品为阳性 图 6。21411 人工感染 8 周龄 BALBΠc 小鼠检测结果 : 仙 台病毒人工感染 8 周龄 BALBΠc 小鼠 , EL ISA 检测仙 图 6 送检细胞样品 RT2PCR 结果 Fig. 6 RT2PCR result of cells 注 :12161 送检细胞样品 ,171 仙台病毒标准株 ,181BHK21 细胞 ,M. DL2000 Marker Note :12161cell ;171SeV ; 181BHK21 ( ) ; 血凝抑制实验 HI与补 但它耗费大量的人力物力 21313 送检细胞样品 RT2PCR 产物 测序结果 : 将送 ( ) 检细胞样品 RT2PCR 产物送 Invitrogen 测序 , 序列与 体固定实验 CF虽简便易操作但结果有较强的主 ( ) () 仙台病毒 gb| DQ21980311| 同源性为 93 % 图 7,说 观性 ,常规的酶联免疫吸附实验 EL ISA检测仙台病 明送检细胞样品感染了仙台病毒 。毒抗体虽有较高的敏感性但要求有高纯度的抗原 , 免疫荧光法检测操作过于麻烦而不能广为推广 ; 这 3 讨论 些血清学方法对无血清的生物制品和免疫缺陷小鼠 仙台病毒是感染实验动物最重要的病毒之一 , 无法进行检测 。 ( ) PCRRT2PCR是重要的分子生物学检测方法 , 实验动物一旦感染就很难消除 ,严重影响实验结果 ; 具有快速 、敏感 、简便 、易于标准化等特点 , 在病毒 在自然条件下仙台病毒感染发生在小鼠 、大鼠 、仓鼠 和豚鼠 ,对人有一定的致病性 ;空气和直接接触是病 学 、免疫学 、血清学 、寄生虫学 、细菌学等领域得到了 毒传播和扩散的方式 。 广泛的应用 。F 蛋白是仙台病毒重要的抗原蛋白 , 具有细胞融合特性 。本研究针对 F 蛋白基因序列设 对仙台病毒最传统 、最经典的方法是病毒分离 , 中国比较医学杂志 2008 年 1 月第 18 卷第 1 期 Chin J Comp Med , January 2008 ,Vol . 18 . No . 1 53 实验动物和非血清生物制品检测结果的客观性 。对 小鼠肺 炎 病 毒 、小 鼠 肝 炎 病 毒 、呼 肠 孤 病 毒 ?型 、 BHK21 和小鼠肺脏组织的特异性实验表明 ,仅仙台 病毒可以扩增出 609 bp 的目的条带 ,敏感性实验表 明 , 建 立 的 RT2PCR 方 法 可 以 检 测 到 0175 pg 的 cDNA。本研 究 建 立 的 RT2PCR 检 测 方 法 , 灵 敏 、快 速 、特异性好 ,能够用于仙台病毒常规检测 。 参考文献 : 田克恭. 实验动物病毒性疾病M. 北京 :农业出版社 ,1991 :57 1 - 641 范文平. 仙台病毒的分子生物学研究进展 J . 中国实验动物 2 学杂志 ,1999 ,2 :115 - 1191 Blandford G , Cureton RSR , Heath RB. Studies on the immune 3 response in Sendai infection of mice J . Med Microbiol ,1971 ,4 :351 - 3571 吴惠英 ,卫礼 ,贺争鸣 ,等. 不同方法检测鼠群 Sendai 抗体的研 4 () 究J . 北京实验动物科学 ,1989 ,6 1:12 - 161 瞿新验 , 卢胜明 , 刘均. 仙 台 病 毒 的 结 构 和 感 染 动 物 的 诊 断 () J . 实验动物科学与管理 ,2005 ,22 2:30 - 311 5 Hayase Y ,Tobita K , Kii M , at al . Detection of nucleoprotein gene of 6 Sendai virus in the lungs of rats by touchdown nested reverse () transcriptase ploymerase chain reaction J . Exp Anim ,1997 ,46 4: 307 - 3101 () 图 7 细胞样品测序与 SeV gb| DQ21980311| 比对 Bootz F , Sieber I , Popovic D , et al . Comparison of the sensitivity of (Fig. 7 Comparative result between cell infected SeV and SeVgb| 7 in vivo antibody production tests with in vitro PCR2based methods to )DQ21980311| detect infectious contamination of biological materials J . Laboratory () Animals ,2003 ,37 4:341 - 3511 〔修回日期〕2007204218 计引物 ,扩增出 F 蛋白 609 bp 序列 , 结合测序来确 定检测结果 ,避免了 PCR 方法假阳性的产生 , 保证