冰冻切片步骤

冰冻切片 肌肉冰冻切片protocol(付文艳) 准备材料: 酒精棉 滤纸 枪(1ml) 24孔板 刀片 毛刷 记号笔 试剂配制: 4%多聚甲醛:称取40g多聚甲醛,加入温热(约60度左右)的蒸馏水约400ml，搅拌,加入少量的1N NaOH溶液，搅拌至完全溶解;加入0.2M的PBS500ml，冷却后过滤，蒸馏水定容至1000ml。 20%蔗糖溶液:20g蔗糖加0.1MPBS(PH7.4)至100ml(温水促溶) OCT包埋剂(购买) 染色剂: Tris(钙缓冲液:(O(1 mol加0(018mol氯化钙): Tris(Hydroxymethyl)methylamine 3(025 g;氯化钙0(499 g;去离子水加至250 ml;室 温保存。 酸性前孵育液:(pH4(35)乙酸钠0(2 mol 9 ml，乙酸0(2 mol 21 ml，调pH至4(35; 碱性前孵育液:Tris(钙缓冲液30 mL以0(1 NHCI仔细调pH至10(4; ATP酶孵育液:ATP(disodium salt)45 mg(购买);Tris(钙缓冲液30 ml，0(1 NHCl调pH至9(5。 注意: 1. ATP酶组织化学主要使用钙激活法。该方法沿用已久，所用的试剂配制比较繁复，尤其 对pH值有严格的要求，必须精确调试试剂的pH值，并每次都要新鲜配制，以保证染 色的成功。 2. 前孵育液和底物孵育液应精确调节pH值，配制完成后立即用EP管分装，置一20?保 存。 3. ATP酶染色法。可见正常骨骼肌纤维大小均匀，形状规则，排列成马赛克状。依前孵育 液pH的不同，分为不同的纤维类型。采用碱性前孵育液(pH 10(4)时，I型肌纤维不显 色。?型肌纤维呈深染。采用酸性前孵育液(pH 4(5)时，深染的为I型，浅染为IIa型， 介于中间染色为IIb型肌纤维。 肌肉冰冻切片protocol(付文艳) 具体操作流程: ,,多聚甲醛固定过夜 ,,,的蔗糖过夜 冰冻切片，6-8um 烘烤,小时(,,度烘箱) 染色(或者,80度保存，染色前需要37度烘烤2小时) 免疫组化笔在组织片周围划圈 酸性孵育液200uL滴人组织片中，室温下孵育15min (或者碱性孵育液200uL滴人组织片中，碱性孵育20 min) 双蒸水冲洗数次 滴入ATP酶孵育液200uL，37度孵育，酸性45min，碱性30 min 1,氯化钙作用3 min 2,硝酸钴3min 自来水快洗 自来水充分冲洗，过去离子水;脱水封片